CN109294940B - 玉米乳杆菌诱变菌及高产乳酸的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种诱变的玉米乳杆菌及其生物制剂，其中该诱变菌是KJY13(KJY‐HN001‐01‐03)，CGMCC NO.15423，保藏日期为2018年03月07日。本发明还提供该诱变菌所制备的生物制剂，用于高产乳酸的用途。本发明还提供该诱变菌单独或联合其他乳酸菌制备用于酸豆奶、酸奶豆腐、豆清液饮料、豆清液酸汤的凝固剂的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，具体是涉及一种诱变的玉米乳杆菌(Lactobacilluszeae)，并通过该诱变菌来高产乳酸的用途。
背景技术
发酵食品是指在食品加工过程中有微生物或酶参与而形成的一类特殊食品。在一般发酵中以乳酸菌为代表的有益微生物群体稳定且占绝对优势。乳酸菌在发酵过程中产生糖类和乳酸，促使发酵环境中的pH和Eh迅速降低，致病菌在酸性环境中的生长受到抑制。同时，乳酸菌释放的H2O2、细菌素、双乙酰、有机酸等多种代谢产物也可抑制有害菌的生长。
具有优良性状的乳酸菌可以在食品业中作为发酵剂使用，也可在饲料制备中作为酸化剂使用，还可以制作成调节肠道的各种益生制剂为动物和人类的健康贡献力量。植物表面附着乳酸菌的种类和数量因自然条件，生长环境及种类的差异而不同。调查和分类鉴定不同样品的乳酸菌资源，建立微生物基因库，将大大提高乳酸菌的利用价值。目前国外研究者对饲料乳酸菌的分类鉴定及乳酸菌在各行业中的应用进行了深入全面的研究(夏姣等，“传统四川泡菜发酵过程中明串珠菌的分离鉴定，《食品工业科技》，2014；韩雪，“天然发酵青贮饲料中乳酸菌的分离与应用研究”，2013)。在我国，乳酸菌的鉴定分析及在各行业生产中的应用等还显得相对薄弱，迫切需要建立健全我国乳酸菌资源库，全方位开发利用国内乳酸菌资源。
玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)，从属于乳杆菌属，DOBSON等通过对干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌及玉米乳杆菌16S rRNA及16S～23S ITS进行测定，构建了系统发育树，并通过聚类分析、表型分析免疫印迹法试验等，建议将干酪乳杆菌和类干酪乳杆菌归为干酪乳杆菌种，不再单独命名类干酪乳杆菌。他们研究还发现，ATCC 393在系统发育树和聚类分析中并没有和干酪乳杆菌分在一个组，而是和玉米乳杆菌分在了一个组，因此认为ATCC 393不应为干酪乳杆菌的标准菌株，而是玉米乳杆菌。
研究表明，玉米乳杆菌是人体正常菌群之一，肠道黏着率高，定植能力强，并具有高效降胆固醇，促进细胞分裂，可起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素、预防龋齿、提高机体免疫力及抗癌等重要的生理保健功能。玉米乳杆菌为革兰阳性厌氧菌，无质粒；不能利用乳糖，但可代谢单糖；在厌氧情况下能很好生长，在有CO2存在的情况下也能生长。玉米乳杆菌能够耐受动物消化道环境，在人和动物肠道内定植，起到调节肠道菌群、预防和治疗腹泻、排除毒素及提高机体免疫力等功效，并对于过敏体质有很好的缓解作用。玉米乳杆菌作为具有益生潜力的乳酸菌，在食品研发领域有着十分重要的用途。
近年来，国内对玉米乳杆菌的研究主要集中在饲料和发酵食品中。例如，中国发明专利申请201610128283.7、“玉米乳杆菌LZ3及其在水产养殖中的应用”公开了一种生物保藏的玉米乳杆菌LZ3，其具有抑制嗜水气单胞菌生长或繁殖的能力。该菌作为嗜水气单胞菌拮抗菌可以制成抑菌制剂在水产养殖中进行应用，预防嗜水气单胞菌对水产养殖对象的危害；可作为益生菌制剂，改善养殖水质。然而，该发明只是研究如何通过玉米乳杆菌来降解水产养殖水体中的氨氮和亚硝酸盐等有害物质，从而改善养殖水质，并不涉及通过提高乳酸产量以用于相关食品应用中。
中国发明专利200610159700.0、“一种玉米青贮用乳酸菌剂及制作方法”公开了含有玉米乳杆菌的玉米青贮用乳酸菌剂，其具有加速玉米青贮成熟和提高玉米青贮品质的优点。虽然该发明能够利用原料中的碳水化合物进行乳酸发酵，使得青贮饲料中的乳酸含量达到1.5-2.0％，但该发明需要复配坚强肠球菌，其研究在于通过乳酸发酵来如何降解青贮饲料中的纤维素，并不涉及通过提高乳酸产量以用于相关食品应用中。
在研究用于食品领域生产乳酸的玉米乳杆菌在国内外的文献报道相对较少，其中大部分从泡菜等发酵食品中分离出来。李啸(“我国传统泡菜自然发酵与单菌发酵微生物及代谢特性研究”，南昌大学硕士研究生学位论文，2014)研究了自然发酵泡菜中优势微生物(乳酸菌、醋酸菌、酵母菌和霉菌)的消长规律和代谢物质的变化等，并认为发酵开始后，乳酸菌成为优势菌，并可抑制酵母菌和霉菌的生长直至消亡。四种乳酸菌中，肠膜明串珠菌在发酵前期启动泡菜发酵过程，并大量代谢产酸，而植物乳杆菌和玉米乳杆菌以及干酪乳杆菌是后期发酵酸化的主要力量，其中肠膜明串珠菌单菌发酵的终点pH值为3.50，其他三株乳酸杆菌单菌发酵的终点pH值为3.10-3.20之间。可见，该报道初步报道了玉米乳杆菌可以作为产乳酸的有益菌，但其产酸能力低于植物乳杆菌和干酪乳杆菌。
刘宗敏等(不同乳酸菌发酵萝卜干的品质动态变化研究，《食品工业科技》，2017年第38卷第9期)公开了在发酵萝卜中肠膜明串珠菌、玉米乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌的产酸能力的分析。研究发现，在平稳期，培养肠膜明串珠菌、玉米乳杆菌、副干酪乳杆菌和乳酸乳球菌培养液的pH基本上维持在4.25、3.90、3.85和3.95，表明玉米乳杆菌的产酸能力并不突出，其结果只是与李啸的研究论文保持一致。此外，各组中，能够表征乳酸含量的总酸度56d后由大到小分别是：副干酪乳杆菌(1.41％)＞乳酸乳球菌(1.26％)＞自然发酵(1.20％)＞肠膜明串珠菌(1.046％)＞玉米乳杆菌(0.89％)。虽然总酸度越高并不代表发酵蔬菜品质越好，但该研究证明了玉米乳杆菌的产乳酸能力不足现有的乳酸菌，还有待提高。
综上，目前需要一种能够高产乳酸的玉米乳杆菌，以便满足用于食品领域的简便、廉价和食品安全的生产需要。
发明内容
本发明原理在于，目前的高产乳酸的玉米乳杆菌的筛选，主要停留在传统的自然筛选或通过选择压能进行筛选。前者难以获得高产效率的菌株，而后者所获得的诱变菌，又由于选择压的消失而遗传性能不稳定，导致菌株退化。有鉴于此，本发明首次提供了通过复合诱变技术来筛选高产乳酸的玉米乳杆菌，同时通过多次重复的复筛，使得诱变菌株的性能稳定。
因此，本发明第一目的提供一种通过复合诱变技术而获得的高产乳酸的玉米乳杆菌(Lactobacillus zeae)KJY13，保藏号为CGMCC No.15423,保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述植物乳杆菌诱变菌株(Lactobacillusplantarum)KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KJY14，保藏号为CGMCCNo.15424，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在一个实施方案中，该诱变菌株KJY13能在相比于出发菌株，其发酵后乳酸产量提高了近70％。在一个具体实施方案中，该诱变菌株KJY13在豆清液培养基发酵后乳酸产量为13.496g/L。
本发明第二目的是提供诱变上述菌株KJY13的制备方法，步骤包括：
(1)将冻存的玉米乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，然后进行MRS固体培养基的平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代；
(2)将纯化后的菌株稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，然后涂布筛选梯度培养平板上，避光培养24h；
(3)选取平板相对较厚处生长的单菌落，置于MRS液体培养基中进行培养；
(4)收集培养的菌体，并稀释成108/ml的菌悬液，加入pH7.4的醋酸钠缓冲液和终浓度为200μg/mL的亚硝基胍溶液后，于37℃培养箱中分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，向各样品中加入生理盐水终止反应，然后对诱变处理后的菌液冰浴2～3h后以诱导正突变；
(5)取上述菌悬液以107/ml稀释梯度，取100ul涂布到筛选梯度培养平板37℃下培养48h，肉眼观察，挑出在梯度平板上层培养基的相对较厚处生长的单菌落；
(6)复筛：选择生化性状稳定的菌株于MRS液体培养基摇瓶培养，然后再于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选一次之后，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏；
(7)重复复合诱变：按照以上步骤(3)-(7)，再进行微波连续诱变2代-复筛-亚硝基胍连续诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，其中微波诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液；
(8)选择生长形状最良好的多个单菌落进行豆清液培养基发酵后，分离发酵液并获得无细菌的上清液，通过酸碱滴定法或pH电位法测量上清液的酸度并计算乳酸产量，其中一个突变株发酵生产的乳酸产量为13.496g/L；
(10)经生理生化试验鉴定，该突变株命名为玉米乳杆菌KJY13，并于2018年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15423。
本发明第三个发明目的是提供所述玉米乳杆菌诱变菌株KJY13生产富含乳酸的食用溶液的方法，包括：
(1)将保藏的玉米乳杆菌诱变菌株于MRS液体培养基中活化培养；
(2)将活化的培养液，以108CFU(即个/ml)的浓度加入预先制备好的培养液中(豆浆、豆清液或米浆中)，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液；
(3)取部分发酵液离心过滤菌液后，获得无乳杆菌的上清液；
(4)经过检测上清液，当酸度(或乳酸产量)达到13g/L以上时，所述终发酵液即为富含乳酸的食用溶液。
在一个实施方案中，所述食用溶液是用于制作泡菜、食用酸汤的溶液。
在一个实施方案中，还包括步骤(5)将所有终发酵液进行离心，获得无乳杆菌的食用溶液。在一个具体实施方案中，所述无乳杆菌的食用溶液是用于制作酸奶、酸豆清液、食用酸汤的溶液。
本发明第四个发明目的是提供所述诱变菌株与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产富含乳酸的食用溶液的方法，步骤包括：
(1)将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)、肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；
(2)将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的培养液(豆清液、豆浆、豆酸奶或酸汤)中，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液，其中玉米乳杆菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度。
(3)离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
(4)经过检测上清液，当酸度达到18g/L-22g/L以上时，所述终发酵液即为富含乳酸的食用溶液；
在一个实施方案中，该食用溶液中的乳酸总产量为23.836g/L，已经满足食品生产。
在另一实施方案中，诱变的肠膜明串珠菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌，其发酵液生产的单一乳酸量分别为3.896g/L、5.746g/L、5.928g/L、8.772g/L。
在一个具体实施方案中，所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述植物乳杆菌诱变菌株(Lactobacillus plantarum)KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
在一个具体实施方案中，所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCCNo.15423，保藏日期为2018年03月07日。
在另一具体实施方案中，所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
在其他具体实施方案中，所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
本发明第五个目的是提供诱变的玉米乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株用于制备食品凝固剂的方法，步骤包括：
(1)将诱变的玉米乳杆菌和/或多种诱变乳酸菌株在MRS液体培养基扩大培养后，获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
(2)将种子培养液按3％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵24-96h h，获得液体凝固剂。
在一个实施方案中，步骤还包括：(3)将所述液体凝固剂进行冷冻干燥处理，获得粉状的固体凝固剂。
在另一个实施方案中，所述食品是豆腐、豆花、酸奶或酸汤或酸豆奶。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1-10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含乳酸的保健食品。
本发明第六个目的是提供上述方法所制备的食品凝固剂。
本发明第七个目的是提供上述食品凝固剂用于凝固液体食品的方法，步骤包括：
(1)将豆浆或牛奶于65-72℃下进行加热，然后冷却至36-40℃；
(2)加入1-5％(v/v)液体凝固剂或0.01-0.05％(m/m)的固体凝固剂，以80-100r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物或胶凝状物，从而制备豆花、酸奶或酸豆奶。
在一个实施方案中，还包括步骤(3)根据所制备的凝固食品类型，选择凝固深化的持续时间，如豆腐的持续时间为20-30min，酸汤的持续时间为72小时。
在另一实施方案中，所述在诱变株选自玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15。在一个具体实施方案中，玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为(1-10):1:1:1:1。在优选的实施方案中，当所述接种比例为(5-10):1:1:1:1时，所制备的凝固剂可用于制备富含乳酸的保健食品。
原理和定义
微生物诱变指通过人为措施诱导微生物的基因产生变异或突变，从而筛选符合需要性状的微生物。对于微生物进行诱变的方法主要包括物理诱变(辐射或照射法)、化学诱变(化学诱变剂)、生物诱变(基因工程突变)。
物理诱变以紫外照射为主，即将微生物悬浮液在搅拌的情况下，置于紫外灯下短时间照射，并迅速置于低温中水浴。通过低温抑制微生物的自身修复，以增加突变几率。而后，多次照射后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同照射时间和照射强度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
除了放射性辐射诱变外，物理诱变还包括微波辐射法，即通过微波辐射进行诱变该方法能引起细胞壁分子间的强烈震动，通过摩擦改变其通透性，使细胞内含物迅速向胞外渗透。利用微波辐照改变细胞壁通透性，让微波作用于微生物DNA、RNA从而引起变异，以达到研究目的。相比于放射性辐射诱变，虽然诱变时间较长、处理样本量小，但其具有安全可靠、易于精细化控制和成本低廉、操作便利的优点，因此成为微生物诱变的研究热点。
常用的化学诱变剂包括亚硝基胍(NTG)、硫酸二乙酯等。均是直接将诱变剂以不同浓度梯度加入微生物悬浮液中，进行不同时间的培养。培养结束后，用生理盐水或其他终止剂终止诱变反应，并迅速置于低温中水浴。多次诱变后，与野生菌落对照同时进行培养，观察不同时间和诱变浓度的平板的菌落数，计算诱变后的菌株致死率。
技术效果
1、本发明通过复合诱变方法，获得高产乳酸的诱变菌株，在保障一定程度提高乳酸产量的同时，还能发挥乳杆菌自身有益于人体的代谢产物的协同作用，从而可将发酵初产物直接用于食品等领域。
2、本发明针对工业生产中常见的廉价发酵原料(如豆浆、豆清液等)，在上述高产乳酸的诱变菌株的基础，通过实验摸索优化发酵工艺条件，从而获得适宜的发酵方法，
3、本发明可以将终发酵液、上清液作为添加剂，直接加入食品原料中进行生产相关食品。
4、本发明首次发现，由于玉米乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和肠膜状明串珠菌均属于乳酸菌类别的菌株，在理化特性和耐受机制存在相似之处。由此，摸索出以上5种菌株都类似的复合诱变方法，并首次尝试将5种诱变菌株混合发酵以生产乳酸，取得良好的技术效果，并能发挥5种益生菌对人体有益的协同效应。
5、本发明的诱变菌种，还能用于作为(复合)凝固剂来生产酸奶、酸豆浆、豆花、酸奶豆腐等。该食用级凝固剂能够避免传统凝固剂中的氯化镁、氯化钙、硫酸钙的食品残留，提高口感，并能发挥(复合)凝固剂中益生菌的有益作用，以及乳酸的预防和治疗疾病的作用，符合绿色天然、安全健康的食品发展趋势。
附图说明
图1：微波辐照诱变时间与致死率变化曲线图；
图2：微波辐照诱变时间与突变率变化关系图；
图3：亚硝基胍诱变时间与致死率变化曲线图；
图4：酸性条件下，玉米乳杆菌诱变株在豆清液中发酵的生长曲线图；
图5：菌株系统发育树图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。对于所属技术领域的技术人员而言，从对本发明的详细说明中，本发明的特征和优点将显而易见。
实施例1、实验材料
出发菌株：
1、玉米乳杆菌为本公司冻藏菌株LZ20150301。
2、植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCC No.15422，保藏日期为2018年03月07日。
3、玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
4、干酪乳杆菌诱变菌株KJY14，保藏号为CGMCC No.15424，保藏日期为2018年03月07日。
5、肠膜状明串珠菌诱变菌株KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
实施例2、微波诱变玉米乳杆菌
将冻存的玉米乳杆菌株分别在MRS液体培养基中经过二次活化后，然后用浓度梯度法在MRS固体培养基上进行涂布。37℃下厌氧培养20-30h，在进行平板计数法，选择具有明显溶钙圈的单个菌落进行划线纯化。最后得到的单个菌落纯化3代。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，吐温-801g/L，柠檬酸三钠2g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH值为6.6～6.8；121℃，15min灭菌备用，
MRS固体培养基：即MRS液体培养基中加入2％琼脂粉；
收集菌种并稀释成107/ml的菌悬液，置于功率500W的微波炉，辐照时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90s，每隔10s取出用冰浴10s消除微波的热效应，避光4℃冷藏12h后，涂布MRS固体培养基平板上，37℃培养24h，进行菌落计数，计算致死率。
采用500功率照射乳杆菌的菌悬液，致死率与照射时间的关系如图1所示。
致死率(％)＝(未诱变处理的总菌数－诱变处理后的存活菌数)/未诱变处理的总菌数×100
可以看出，随着微波时间的增加，致死率逐渐增大，当微波处理50s时，致死率为92.1％而当微波辐照处理60s时，致死率接近100％。
统计出发菌株(边缘整齐，表面光滑，中心突起，乳白色，质地均匀，平均直径3mm)和诱变菌株的菌落平均直径和形状不规则性，确定比出发菌株的菌落直径增加且出现不规则圆形但颜色不变的诱变菌株为正突变株，从而确定菌落直径比例变大且形状出现不规则的诱变株为正向突变株。由此计算对于不同微波诱变时间下植物乳杆菌的正突变的研究。
由图2可知，当微波辐照50s时，正突变率较大，有利于诱变的菌株的筛选。
因此，根据诱变机制，强烈的诱变剂和较高的剂量处理诱变菌株，菌株突变可能性大，因此选用50s为下一步试验诱变辐射时间。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行微波辐照处理50s，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于37℃培养1天。选取生长迅速、边缘圆滑、相对较厚处生长的乳白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。
实施例3、亚硝基胍诱变
亚硝基胍(NTG)：取0.1g亚硝基胍加入10mL丙酮作为助溶剂，完全溶解后取1mL亚硝基胍丙酮溶液加入9mL磷酸钠缓冲液(pH7.4，0.02mol/L)配制成NTG浓度为1mg/mL的亚硝基胍母液。
收集培养的驯化菌种，并稀释成108/ml的菌悬液。然后取8mL菌悬液，加入亚硝基胍母液2mL，NTG终浓度为200μg/mL，同时设置未诱变原液作为对照。
将上述菌液置三角瓶中，摇床振荡37℃培养分别避光孵育10、15、20、25、30、35、40、45、50min后，分别加入生理盐水终止反应；诱变处理后的菌液冰浴2～3h以诱导正突变后，于4000r/min室温离心15min。取菌体沉淀，用pH 6.0磷酸缓冲液离心洗涤2次后，用冷生理盐水十倍梯度稀释菌体沉淀至7倍梯度，分别取0.1mL涂布于含2％(质量分数)碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃恒温避光静置培养48h。观察各梯度培养皿菌落数，计算NTG诱变的致死率。
结果图3所示：当菌悬液用NTG 100μg/mL的NTG诱变处理不同时间，随诱变处理时间的延长，致死率不断增加，在处理40min时，致死率达到87.1％。
按照实施例2的方法，统计出发菌株和诱变菌株的菌落平均直径和明显溶钙圈的平均直径，确定比出发菌株的菌落直径和明显溶钙圈有增加但颜色不变的诱变菌株为正突变株。
综合致死率和正突变率的实验结果，选择200μg/mL和诱导40min作为亚硝基胍的最佳诱导参数。
按照上述步骤，对已活化的菌悬液进行200μg/mL亚硝基胍的诱导40min，然后取辐照菌液1ml稀释后，涂布到筛选用梯度培养平板上，于30℃培养2-3天。
选取生长迅速、边缘圆滑、相对较厚处生长的乳白色单菌落置于MRS液体培养基进行培养。然后取对数生长期的菌液，离心收集后，再置于含2％碳酸钙的MRS固体培养基筛选，挑选生长迅速、明显溶钙圈有增加但颜色不变的单菌落，以完成复筛。以此方法，进行至少10代复筛，然后将生化性状稳定的菌株进行保藏。
按照以上方法，再进行微波连续诱变2代-复筛-亚硝基胍连续诱变2代-复筛，其中每次诱变后至少进行3代复筛，虽然微波诱变率较高，但二次诱变对菌株致死率大，因此微波重复诱变的菌株浓度需调整至108/ml的菌悬液。
实施例4、pH电位法检测发酵液的酸度和产酸量
1、测定步骤
根据酸碱中和原理，用碱液滴定试液中的酸，溶液的电位发生“突跃”时，即为滴定终点。按碱液的消耗量计算上清中的总酸含量。
所有试剂均使用分析纯试剂；分析用水应符合GB/T 6682规定的二级水规格或蒸馏水，使用前应经煮沸、冷却。
称取上清液试液100mL，置于150mL烧杯中。将酸度计电源接通，指针稳定后，用pH8.0的氢氧化钠缓冲溶液校正酸度计。将盛有试液的烧杯放到电磁搅拌器上，浸入玻璃电极和甘汞电极。按下pH读数开关，开动搅拌器，迅速用0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定，随时观察溶液pH的数值变化。接近滴定终点时，放慢滴定速度，直至溶液的pH达到终点。记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值(V3)。
同一被测样品应测定两次，并用蒸馏水代替试液做空白试验，记录消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积数值(V4)。
2、计算公式
发酵液中总酸的含量以质量体积分数X1计，数值以克每千毫升(g/ml)表示，计算公式如下：
X1＝[C2×(V3-V4)×K×F1×1000]/M1
式中：
C2：氢氧化钠标准滴定溶液浓度的准确的数值，单位为摩尔每升(mol/L)；
V3：滴定试液时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)；
V4：空白试验时消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)；
K：酸的换算系数，例如，乳酸＝0.090；苹果酸＝0.067；乙酸＝0.060；酒石酸＝0.075；柠檬酸＝0.064；柠檬酸＝0.070(含一分子结晶水)；盐酸＝0.036；磷酸＝0.049；
F1：试液的稀释倍数；
M1：试样的体积的数值，单位为ml。
计算结果表示到小数点后两位。
3、前后共进行3组实验，从中选择生长形状最良好的13个菌落，将上述保藏的多个菌株分别单一接种于豆清液培养基中，37℃下活化培养72h。
4、分离发酵液并获得无细菌的上清液，13株诱变菌株的发酵上清液中乳酸产量如下表1：另设未诱变菌株的出发菌种为对照
| 诱变株 | g/L | 诱变株 | g/L |
| IR-NTG-1-03 | 7.463 | IR-NTG-1-06 | 8.497 |
| IR-NTG-1-13 | 7.450 | IR-NTG-1-31 | 8.902 |
| IR-NTG-2-16 | 8.131 | IR-NTG-2-33 | 9.692 |
| IR-NTG-2-45 | 9.482 | IR-NTG-3-04 | 7.703 |
| IR-NTG-3-12 | 8.385 | IR-NTG-3-23 | 13.496 |
| IR-NTG-3-32 | 10.775 | IR-NTG-3-44 | 8.014 |
| IR-NTG-3-57 | 7.593 | 对照 | 7.939 |
表1
如上表1可知，诱变株IR-NTG-3-23，其发酵生产乳酸能力明显高于其他诱变株，其相比于未诱变的出发菌株，乳酸产量提高近70％。
实施例5、诱变株的生理生化特性测试和分子鉴定
(一)生理生化特性测试
挑取单个菌落进行划线纯化，纯化3～4代，并通过表观判断与镜检确定其菌落形态和菌体形态，并进行4℃菌种斜面保存。
生理生化特性测试结果如下表2：
(二)分子鉴定
提取菌株细胞总DNA，以通用引物扩增菌株的16S rRNA的部分基因片段，插入测序载体后进行测序，并于NCBI数据库进行比对。
比对结果如下表3：
另外，基于16S rRNA基因序列构建的菌株系统发育树图如图5和表4：
根据上述测定结果，表明其与上述多个玉米乳杆菌的部分序列均保持一致，且与生理生化特征结果相一致，故将该诱变菌株定名为(Lactobacillus zeae)KJY13，简写为KJY13。2018年03月07日，将该KJY13进行保藏，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
(三)菌种在豆清液中的生长
在酸性条件(pH2.5-4.0)下，将诱变菌种在豆清液中进行发酵培养，每2h检测OD值，以确定菌种活菌数。
如图4所示，随着时间的增长，诱变菌种的活菌数逐渐增加，在24h达到峰值，随后进入平稳的生长期。这表明，诱变的玉米乳杆菌在豆青液中能够良好生长，并且长时间持续保持高速平稳的生长状态。
实施例6、多种诱变菌株工业化协同生产乳酸
复配菌株：
鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No.15421，保藏日期为2018年03月07日。
植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCCNo.15422，保藏日期为2018年03月07日。
玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No.15423，保藏日期为2018年03月07日。
干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)KJY14，保藏号为CGMCCNo.15424，保藏日期为2018年03月07日。
肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)KJY15，保藏号为CGMCC No.15425，保藏日期为2018年03月07日。
将活化的诱变菌株培养液，分别单独加入预先制备的豆清液培养液中，于37℃下静置培养70h，获得终发酵液，并分别测定各菌株的产乳酸能力。结果如下表5所示。
按照以上方法，将复配混合菌株，分别一起接种到豆清液培养液、豆酸奶发酵液、酸汤(苗侗族)中，其中玉米乳杆菌的加入量为108CFU的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU的浓度，所测得发酵液乳酸产量分别为23.836、29.589g/L、26.361g/L。复配混合发酵的乳酸产量并未呈现产量叠加的结果，可能原因是5种乳酸菌的产物之间存在竞争性，另外因豆酸奶、酸汤的营养成分强于豆清液培养液而产量优于后者产量。
实施例7、诱变菌种生产用于食品的凝固剂
分别取鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、玉米乳杆菌KJY13、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15，接种于20mL MRS液体培养基中，37℃活化培养24h。
然后，按接种量3％(v/v)接种至500ml的MRS液体培养基中，37℃扩大培养至获得为活菌密度为108-109CFU/mL的种子培养液；
将种子培养液按1％(v/v)接种量接入预灭菌的豆清液中，于36～38℃下发酵48-96h，而后加入无菌的醋酸，将pH调至2.5-5.0、优选3.50-4.0，即获得液体凝固剂。
考虑到种子培养液中活菌密度为108-109CFU/mL为菌种最佳生长时期，在相同培养条件下，各种诱变菌种的生长的活菌密度并不完全一致，因此调整玉米乳杆菌KJY13、鼠李糖乳杆菌KJY11、植物乳杆菌诱变菌株KJY12、干酪乳杆菌KJY14、肠膜状明串珠菌KJY15的接种比例分别为10:1:1:1:1，或1:1:1:1:1，以确保分别获得用于生产主要富含乳酸的凝固食品的凝固剂，和生产主要富含多种益生菌的食品的凝固剂。
将获得的液体凝固剂中，通过离心分离菌体，然后用适量的无菌生理盐水重悬浮后，重新分离纯化菌体后，在重悬液中加入终浓度为7.5％(m/v)的葡萄糖或麦芽糊精作为保护剂，先放入4℃平衡30min，然后放置-40℃中进行预冷冻20h。冷冻完成后放入真空冷冻干燥机中，设置温度-50℃，抽真空(20～40Pa)，干燥24h，制得粉状固体凝固剂。使用时，重新复水溶解即可。
实施例8、诱变菌种用于凝固液体食品的生产方法
1、制作豆花或酸豆浆
将优质黄豆清洗后，充分泡涨。通过使用浆渣分离器磨浆，并加热，获得熟豆浆。
熟豆浆冷却至36-40℃，然后匀速流加加入3％(v/v)液体凝固剂，以80r/min的速度搅拌，直至产生絮状物或碎花状物。然后降低搅拌速度，直至出现大面积的絮状物或碎花状物。低温保存，即得豆花。或持续发酵1-4小时，以制备酸豆浆。
2、制作(酸)豆腐
在方法1的基础上，继续搅拌豆浆25min以便凝固深化，直至块状增大至不变且水固分离时，保温养浆20min，再大火加热至微沸1min，用重物压制蹲脑20-30min。
然后将蹲脑后豆腐倒入铺好豆腐布的型框中，包严网布、覆平、自沥后重物压力下加压3h，确保豆腐良好的外形和质构，压制成形后即为酸奶味豆腐成品。
3、制作酸奶
将新鲜牛奶于70度左右加热杀菌后，冷却至40度。
匀速流加加入0.02％(m/m)的固体凝固剂，以90r/min的速度搅拌，直至产生凝胶状物。然后降低搅拌速度，直至出现大量凝胶。低温保存，即得酸奶。
4、制作苗侗族酸汤
在方法1的基础上，将含有絮状物或碎花状物的豆浆液，于38℃下深化发酵72小时，即可得到酸汤原液。
预先制备西红柿浆、辣椒粉、食盐、白酒的混合溶液，加入适量1-5％(v/v)酸汤原液，厌氧发酵5-10天。即可制得食用的苗侗族酸汤。
相对于普通豆花、酸奶、酸豆腐等，本发明的凝固剂制备出的食品，具有保水性好、质地细腻(如酸奶豆腐)、口味清淡略带酸甜(如酸豆浆、酸奶)，香味浓厚(如酸汤)，营养丰富。
另外，由于含有多种益生菌，能够提高胃肠道的免疫力。所富含的乳酸，能调节肠道菌群、预防和治疗腹泻以及降低胆固醇等功能。
应当理解，本发明虽然已通过以上实施例进行了清楚说明，然而在不背离本发明精神及其实质的情况下，所属技术领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的变化和修正，但这些相应的变化和修正都应属于本发明的权利要求的保护范围。
Claims (4)
1.一种玉米乳杆菌诱变菌株（Lactobacillus zeae strain）KJY13，保藏号为CGMCCNo. 15423, 保藏日期为2018年03月07日，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.通过权利要求1所述的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，来生产富含乳酸的食用溶液的方法，包括：
（1）将保藏的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13于MRS液体培养基中活化培养；
（2）将活化的培养液，以108CFU的浓度加入预先制备好豆浆、豆清液或米浆培养液中，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液；
（3）取部分发酵液离心过滤菌液后，获得无乳杆菌的上清液；
（4）经过检测上清液，当乳酸产量达到13 g/L以上时，所述终发酵液即为富含乳酸的食用溶液，其中所述食用溶液是用于制作泡菜、食用酸汤的溶液，和/或
（5）将所有终发酵液进行离心，获得无乳杆菌的食用溶液。
3.权利要求2所述的方法，其中所述无乳杆菌的食用溶液是用于制作酸奶、酸豆清液、食用酸汤的溶液。
4.通过权利要求1所述的玉米乳杆菌诱变菌株KJY13，与下列任意一种或多种诱变乳酸菌株进行复配，以生产富含乳酸的食用溶液的方法，步骤包括：
（1）将保藏的诱变菌株分别进行活化培养，其中，活化培养基选自MRS液体培养基，其他诱变株选自干酪乳杆菌（Lactobacillus casei strain）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus strain）、肠膜状明串珠菌（Leuconostoc mesenteroidesstrain ）和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；
（2）将活化的诱变菌株培养液，加入预先制备的豆清液、豆浆、豆酸奶或酸汤培养液中，于37℃下静置培养24-96h，获得终发酵液，其中玉米乳杆菌的加入量为108CFU/ml的浓度，另外4种菌种的加入量为107CFU/ml的浓度；
（3）离心过滤菌液，获得无细菌的上清液；
（4）经过检测上清液，当酸度达到18g/L- 22g/L时，所述终发酵液即为富含乳酸的食用溶液；其中，
所述鼠李糖乳杆菌选自鼠李糖乳杆菌KJY11，保藏号为CGMCC No. 15421，保藏日期为2018年03月07日；
所述植物乳杆菌诱变菌株KJY12，保藏号为CGMCC No. 15422，保藏日期为2018年03月07日；
所述玉米乳杆菌选自玉米乳杆菌KJY13，保藏号为CGMCC No. 15423，保藏日期为2018年03月07日；
所述干酪乳杆菌选自干酪乳杆菌KJY14，保藏号为CGMCC No. 15424，保藏日期为2018年03月07日；
所述肠膜状明串珠菌选自肠膜状明串珠菌KJY15，保藏号为CGMCC No. 15425，保藏日期为2018年03月07日。
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