CN111979222A - 一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法，具体通过诱变、培养、筛选、分离鉴定、滴定酸度的筛选及其他性质评价六个步骤。本发明所述的高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法工艺简单、成本低；筛选得到的诱变副干酪乳杆菌，在提升产酸的同时，保持了活菌数且活菌数有所提升；其中，连续发酵7d后的酸度比副干酪乳杆菌L105的酸度提高了18.1°T；筛选得到的诱变副干酪乳杆菌具有遗传稳定性，对胆盐的耐受能力及产胞外多糖的能力未降低。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法。
背景技术
目前，全球对益生菌食品存在着极大的兴趣，并且正在研究开发含有大量潜在健康益处的益生菌的新型食品。对益生菌来说，最重要的是对人的食用安全，因此，益生菌食品中最广泛使用的是乳酸菌属和双歧杆菌属，它们都自然存在于人的肠道中。在乳酸菌中，干酪乳杆菌是益生菌食品中最常用的一种。因此，开发干酪乳杆菌具有极大的价值及意义。它具有一定的营养价值和保健作用。国内外对优良乳酸菌的选择及发酵剂的研究与开发已受到各国的重视。近几年，对乳酸菌的加工和功能特性的研究较为重视，原因在于发酵乳制品几乎都是通过乳酸菌发酵而来的。在工业生产中更需要性能优良的品种，可以使产品的品质更完美，更利于产品的销售以及使用者对于产品有更好的感受。因此，在发酵产品的过程中乳酸菌的筛选是至关重要的一步。对于乳酸菌的筛选必须具有优良的发酵特性，包括酸的产生和香气的产生，产粘特性；菌株的性能与酸奶的质量直接相关，酸产能力强，感官品质优良等，对酸奶的生产都具有重要意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供了一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法。
本发明一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法的技术方案，具体包括如下步骤：
步骤一，诱变：将副干酪乳杆菌L105冻干菌株置于无菌器皿中，用20W的紫外灯在距离22～28cm处照射20～25s；
步骤二，培养：将诱变后的菌株置于MRS液体培养基中培养，传代3-4代后，获得诱变菌液；
步骤三，筛选：将诱变菌液离心洗涤2次后取菌体沉淀，稀释后涂布于加碳酸钙、4.5％NaCl的MRS平板上培养，然后观察挑出溶钙圈较大的菌落置于MRS液体培养基中培养；
步骤四，分离鉴定：经过分离挑取步骤三的单菌落后，进行培养，经革兰氏染色、基因组DNA的提取、PCR扩增以及测序鉴定进行菌株鉴定，得到鉴定为副干酪乳杆菌的菌株；
步骤五，滴定酸度的筛选：将步骤四鉴定后的副干酪乳杆菌株接种于pH 6.5的MRS液体培养基中，经37℃过夜活化后，按1％接种量分别接种于12％脱脂乳中，将其放入37℃恒温培养箱中，连续发酵7d，测定发酵7d后的滴定酸度；
步骤六，其他性质评价：将筛选得到的诱变副干酪乳杆菌株进行形态学观察、生长曲线的测定、耐酸、耐胆盐、胞外多糖含量以及表面疏水性的测定。
进一步的，所述的副干酪乳杆菌L105为从云南大理的乳扇中进行分离筛选的副干酪乳杆菌L9进行耐酸、耐氧适应性驯化后得到的，该菌株具有良好的发酵性能。
进一步的，所述的MRS液体培养基为10g蛋白胨，20g葡萄糖，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸二铵，5g无水乙酸钠，0.58g硫酸镁，0.2g硫酸锰，1mL吐温80，1L蒸馏水，调节pH值至6.5。
其中，所述步骤四菌株鉴定为：(1)基因组DNA的提取：根据细菌基因组提取试剂盒，将分离得到的株菌进行进行基因组DNA的提取；(2)PCR扩增：根据提取全基因组DNA：30ml反应混合物，包括模板DNA、前引物、反向引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液，对分离株的基因型进行鉴定，采用PCR方法选择16SrDNA区域序列进行扩增；使用引物P1和引物P2，扩增程序为94℃条件下初始变性2min，36个周期为94℃条件下，变性1min，56℃条件下，退火1min，72℃条件下，扩展2min；其中，引物P1为27f:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；引物P2为1492r:5-TAGGGTTACCTTGTTACGAC TT-3；(3)测序鉴定：16S rDNA序列分析PCR产物由上海生工生物技术有限公司确定，通过生物编辑程序对序列结果进行评价，并与NCBI网站上BLAST程序GenBank数据库序列进行比较，找到16S rDNA PCR扩增产物的核心序列与副干酪乳杆菌L 9的基因序列一致的菌株。
相比于现有的技术，本发明具有如下有益效果：本发明所述的高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法工艺简单、成本低；筛选得到的诱变副干酪乳杆菌，在提升产酸的同时，保持了活菌数且活菌数有所提升；其中，连续发酵7d后的酸度比副干酪乳杆菌L105的酸度提高了18.1°T；筛选得到的诱变副干酪乳杆菌具有遗传稳定性，对胆盐的耐受能力及产胞外多糖的能力未降低。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法，具体包括如下步骤：
步骤一，诱变：将副干酪乳杆菌L105冻干菌株置于无菌器皿中，用20W的紫外灯在距离22～28cm处照射20～25s；其中，副干酪乳杆菌L105为从云南大理的乳扇中进行分离筛选的副干酪乳杆菌L9(野生菌株)进行耐酸、耐氧适应性驯化后得到的，该菌株具有良好的发酵性能；
步骤二，培养：将诱变后的菌株置于MRS液体培养基中培养，传代3-4代后，获得诱变菌液；
步骤三，筛选：将诱变菌液离心洗涤2次后取菌体沉淀，稀释后涂布于加碳酸钙、4.5％NaCl的MRS平板上培养，然后观察挑出溶钙圈较大的菌落置于MRS液体培养基中培养；
步骤四，分离鉴定：经过分离挑取步骤三的单菌落后，进行培养，经革兰氏染色、基因组DNA的提取、PCR扩增以及测序鉴定进行菌株鉴定，得到鉴定为副干酪乳杆菌的菌株；
其中，所述步骤四菌株鉴定为：(1)基因组DNA的提取：根据细菌基因组提取试剂盒，将分离得到的株菌进行进行基因组DNA的提取；(2)PCR扩增：根据提取全基因组DNA：30ml反应混合物，包括模板DNA、前引物、反向引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液，对分离株的基因型进行鉴定，采用PCR方法选择16SrDNA区域序列进行扩增；使用引物P1和引物P2，扩增程序为94℃条件下初始变性2min，36个周期为94℃条件下，变性1min，56℃条件下，退火1min，72℃条件下，扩展2min；其中，引物P1为27f:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；引物P2为1492r:5-TAGGGTTACCTTGTTACGAC TT-3；(3)测序鉴定：16S rDNA序列分析PCR产物由上海生工生物技术有限公司确定，通过生物编辑程序对序列结果进行评价，并与NCBI网站上BLAST程序GenBank数据库序列进行比较，找到16S rDNA PCR扩增产物的核心序列与副干酪乳杆菌L 9的基因序列一致的菌株；
步骤五，滴定酸度的筛选：将步骤四鉴定后的副干酪乳杆菌株接种于pH 6.5的MRS液体培养基中，经37℃过夜活化后，按1％接种量分别接种于12％脱脂乳中，将其放入37℃恒温培养箱中，连续发酵7d，测定发酵7d后的滴定酸度；筛选得到的副干酪乳杆菌，连续发酵7d后的酸度比副干酪乳杆菌L105的酸度提高了；
步骤六，其他性质评价：将筛选得到的诱变副干酪乳杆菌株进行形态学观察、生长曲线的测定、耐酸、耐胆盐、胞外多糖含量以及表面疏水性的测定。
其中，上述的MRS液体培养基为10g蛋白胨，20g葡萄糖，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸二铵，5g无水乙酸钠，0.58g硫酸镁，0.2g硫酸锰，1mL吐温80，1L蒸馏水，调节pH值至6.5。
实施例2
本发明方法筛选得到的诱变副干酪乳杆菌株进行形态学观察、生长曲线的测定、耐酸、耐胆盐、胞外多糖含量以及表面疏水性等的测定。
1、形态学观察
(1)革兰氏染色：将筛选出来的诱变副干酪乳杆菌株与L9、L105接种、活化后，分别等量接种于pH值为6.5的MRS培养基中，在有氧条件下37℃连续培养12h后，进行革兰氏染色，电子显微镜观察。
(2)透射电镜：将突变株与L9、L105接种、活化后，分别等量接种于pH值为6.5的MRS培养基中，在有氧条件下37℃连续培养12h后，进行透射电镜样品处理：
A取样：取大量样品离心(转速3000r～4000r/min)，去除上清液，加入适当pH(7.2～7.4)的0.1M PBS清洗三遍；清洗时菌体温柔悬浮。
B固定：2.5％戊二醛固定3h(此步时间非绝对，1～12h都可)，用PBS清洗两遍，每遍10min，再用纯水清洗两遍。
C电镜观察：进行透射电镜Tecnai G2F20S-TWIN(200KV)观察，形态均呈杆状，排列方式呈链状。
2、生长曲线的测定
将筛选出来的诱变副干酪乳杆菌株与L9、L105接种、活化2代后，按1％接种量分别接种于pH值为6.5的MRS培养基中，用芬兰Bioscreen C全自动生长曲线分析仪，在有氧条件下37℃连续培养24h，测定OD600nm处菌悬液的光密度值，绘制OD600nm处对培养时间的生长曲线。经过统计分析得到，诱变副干酪乳杆菌株在有氧条件下的生长情况基本与野生株保持一致，表明了其产酸性能提高的同时，又不失其原有生长特性。
3、酸度筛选
将菌株接种于pH 6.5的MRS液体培养基中，经37℃过夜活化后，按1％接种量分别接种于12％脱脂乳中，将其放入37℃恒温培养箱中发酵，测定发酵7d后的滴定酸度，每个样品做3个重复。滴定酸度测定：参照国标GB5413.34-2010进行。
将鉴定测序成功得到的82株诱变副干酪乳杆菌活化后，按1％接种量分别接于12％脱脂乳中，37℃连续发酵7天，测定7天后的滴定酸度。结果显示，经过测定的82株菌中，有67株酸度相对L105明显下降，其中14株酸度基本与L105保持一致，只有诱变副干酪乳杆菌株酸度较L105有显著升高(详见表1)。
表1 发酵7d菌株pH及滴定酸度°T
注：表中相同字母表示不同菌株间无显著性差异；不同字母表示不同菌株间有显著性差异且P<0.05。
4、耐酸评价
(1)低pH下菌株致死率：待测菌株接种、活化后，1％接种量分别接种于pH值为6.5的MRS培养基中，在有氧条件下37℃连续培养16h后，离心收集菌体，将菌体沉淀分别接入pH值为3.5、3.0和2.5的MRS培养基中，并在37℃下分别培养0、2和4h时，对菌株进行平板计数，计算菌株致死率。每组试验至少有3个重复。
在不同pH值的培养液中，活菌数明显有所下降，说明在酸性环境下，副干酪乳杆菌的生长受到了抑制，对菌体代谢活动多需的营养物质以及能量有所减少，对菌体的存活产生了一定的影响。在pH值3.5培养1h与2h，突变株较野生株的存活率显著升高，而在pH值3.0与pH值2.5条件下，突变株与野生株各时间存活率并无明显差异，且存活率较低，说明突变株维持了良好的耐酸能力。
(2)发酵7d后菌株耐酸能力评价：将待测菌株进行37℃过夜活化后，按1％接种量分别接种于12％的脱脂乳培养基中，放入37℃恒温培养箱中，连续发酵7d后，将发酵乳样品充分混匀，并吸取1mL样品分别加到pH值为3.5、3.0、2.5的MRS液体培养基中，37℃连续培养4h，分别在培养0h、2h、4h时进行活菌计数。每组试验至少有3个重复。
0h时，诱变菌株的活菌数对数值为8.28(CFU/mL)，在pH值为3.5的培养基中培养2h后，活菌数有所下降，达到8.20(CFU/mL)，而在pH值为3.0和2.5的培养基中，菌数下降的更为明显，分别为8.17(CFU/mL)和8.01(CFU/mL)。说明诱变菌株在发酵7d后，在酸性环境下的生长能力受到明显的抑制。
(3)经37℃过夜活化的菌株按1％接种量分别接种于12％脱脂乳中，37℃连续发酵7d，(前3d每12h，后4d每24h)测定pH值、滴定酸度、活菌数；记录菌株的凝乳时间，每个样品做3个重复。凝乳时间：菌株接种到12％脱脂乳管后，从放入37℃培养箱起到管中脱脂乳完全凝固所需的时间。
通过滴定酸度筛选出酸度较高的诱变副干酪乳杆菌株，进行产酸能力评价。诱变副干酪乳杆菌株在发酵12h时，其酸度与L105、L9没有明显变化，其酸度均维持在63°T左右；当发酵时间达到1d时，诱变副干酪乳杆菌株的酸度仍然与L105基本保持一致；当发酵时间达到2.5d后，诱变副干酪乳杆菌株的酸度相比较L105有明显上升；发酵5d后，诱变副干酪乳杆菌株与L105的酸度变化较小，到达发酵终点7d时，诱变副干酪乳杆菌株与L105的酸度相差(16.10±0.16)°T。L9、L105、诱变副干酪乳杆菌株在发酵过程中，活菌数均呈现先上升后下降的趋势，并通过显著性分析得出，当发酵7d后诱变副干酪乳杆菌株的活菌数显著高于出发菌株L105，因此，表明经过诱变后，在提升产酸的同时，保持了活菌数且活菌数有所提升。
5、耐胆盐评价
不同胆盐浓度下菌株致死率：待测菌株接种、活化后，1％接种量分别接种于pH值为6.5的MRS培养基中，在有氧条件下37℃连续培养16h后，离心收集菌体，将菌体沉淀分别接入胆盐浓度为0.1％、0.2％和0.3％的MRS胆盐培养基中，37℃下分别培养0、1、2、3和4h，对菌株进行平板计数计算菌株致死率。每组试验至少有3个重复。
潜在益生菌的另一个重要特性是它们能够存活于人类小肠中产生的胆汁浓度，并在大肠中占据并繁殖。在不同胆盐浓度的培养液中，副干酪乳杆菌活菌数随胆盐浓度值的升高数量减少，副干酪乳杆菌在高胆盐浓度条件下生长受到抑制。0.1％胆盐条件下培养2h，突变株与野生株存活率基本相同，且存活率保持在40％左右；相比于含0.1％胆盐的培养条件，0.2％与0.3％胆盐含量的两株菌存活率明显下降，说明胆盐对于副干酪乳杆菌的生长有抑制作用。在胆盐环境培养2h过程中，突变株与野生株的存活率无显著性差异，说明航天诱变没有降低副干酪乳杆菌对胆盐的耐受能力。
6、胞外多糖测定
(1)胞外多糖的分离与含量测定
将待测菌株经37℃过夜活化后，按1％的接种量接种于10mL12％的脱脂乳培养基中，放入37℃恒温培养箱中，连续发酵7d，在发酵1d、3d、5d、7d时取发酵乳样品10mL，向其加入3mL 16g/100mL的三氯乙酸溶液，放入4℃冰箱放置2h后，10000r/min离心30min，取上清液备用；取6mL上清液，并加入等体积的无水乙醇，4℃放置过夜；将混合液10000r/min离心30min，取沉淀，采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量。
(2)葡萄糖标准曲线的绘制
标准曲线的绘制：用万分之一天平称取葡萄糖0.10g，于100mL容量瓶中，加入少量蒸馏水溶解，定容摇匀。从100mL容量瓶中，分别吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL葡萄糖溶液，分别加入10mL容量瓶中，定容摇匀。蒸馏水做空白对照。吸取不同浓度的标准溶液1mL，于室温下向其中加入5％苯酚1mL并摇匀，再快速向其中加入5mL浓硫酸。待反应结束溶液冷却至室温时，用紫外分光光度计于490nm处测其吸光度。空白样以1mL蒸馏水按照同样的步骤进行。
(3)样品中胞外多糖含量的测定
取1mL样液，于室温下向其中加入5％苯酚1mL并摇匀，再快速向其中加入5mL浓硫酸。待反应结束溶液冷却至室温时，用紫外分光光度计于490nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中胞外多糖含量。
将菌株所制备的发酵乳样品进行胞外多糖的测定。诱变副干酪乳杆菌株的产胞外多糖能力比副干酪乳杆菌株L105略高，即诱变菌株具有较高的产胞外多糖的能力，因此，说明诱变没有降低副干酪乳杆菌产胞外多糖的能力。
7、表面疏水性评价
待测菌株接种、活化后，1％接种量分别接种于pH值为6.5的MRS培养基中，在37℃恒温培养箱中，有氧条件下，连续培养12h后，离心(4200～4500g，10～17min)弃去上清液，将菌体沉淀用PBS溶液(pH 7.2)洗涤两次，重悬于0.1mL/L KNO3(pH 6.2)中，将菌悬液浓度的调整为1×108cfu/mL，同时测定菌悬液在600nm处的吸光值(A0)。取上述3mL菌悬液与1mL二甲苯混合，室温放置10min后漩涡混合2min，再于室温下放置20min，测定600nm处水相的吸光值(A1)。表面疏水性以细菌黏附有机溶剂的百分率来表示，计算公式：BATS(％)＝(1-A1/A0)×100％。
菌株L9具有高度亲水性，突变菌株与L105都表现出一定的疏水性。通常，高度疏水性的菌株具有很强的附着细胞的能力。但是有研究表明，一株菌株对细胞的黏附率为40％，而该菌株的表面疏水能力极低，仅仅只有2％。因此，疏水性可以促进粘附，但强疏水性并不是强粘附的必要条件。
8、遗传稳定性评价
通过诱变，并经过酸度筛选得到的菌株，必须保证该菌株经过多次传代后，其优良性状不会发生明显变化，在其后代中得到保存。因此，我们必须对突变菌株进行多次传代培养，确定菌株的优良性状具有遗传稳定性，能在其后代中得到表达。将通过酸度筛选得到的突变菌株进行37℃过夜活化，按1％接种量进行接种，将其连续传代20次，分别在传代5、10、15、20次时测定菌株的发酵性能。结果显示，经过传代5、10、15、20次后，诱变菌株的酸度仍保持在229°T左右，故筛选得到的菌株具有遗传稳定性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (3)
1.一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
步骤一，诱变：将副干酪乳杆菌L105冻干菌株置于无菌器皿中，用20W的紫外灯在距离22～28cm处照射20～25s；
步骤二，培养：将诱变后的菌株置于MRS液体培养基中培养，传代3-4代后，获得诱变菌液；
步骤三，筛选：将诱变菌液离心洗涤2次后取菌体沉淀，稀释后涂布于加碳酸钙、4.5％NaCl的MRS平板上培养，然后观察挑出溶钙圈较大的菌落置于MRS液体培养基中培养；
步骤四，分离鉴定：经过分离挑取步骤三的单菌落后，进行培养，经革兰氏染色、基因组DNA的提取、PCR扩增以及测序鉴定进行菌株鉴定，得到鉴定为副干酪乳杆菌的菌株；
步骤五，滴定酸度的筛选：将步骤四鉴定后的副干酪乳杆菌株接种于pH 6.5的MRS液体培养基中，经37℃过夜活化后，按1％接种量分别接种于12％脱脂乳中，将其放入37℃恒温培养箱中，连续发酵7d，测定发酵7d后的滴定酸度；
步骤六，其他性质评价：将筛选得到的诱变副干酪乳杆菌株进行形态学观察、生长曲线的测定、耐酸、耐胆盐、胞外多糖含量以及表面疏水性的测定。
2.根据权利要求1所述的一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法，其特征在于，所述的副干酪乳杆菌L105为从云南大理的乳扇中进行分离筛选的副干酪乳杆菌L9进行耐酸、耐氧适应性驯化后得到的，该菌株具有良好的发酵性能。
3.根据权利要求1所述的一种高产酸副干酪乳杆菌的筛选方法，其特征在于，所述的MRS液体培养基为10g蛋白胨，20g葡萄糖，10g牛肉膏，5g酵母浸粉，2g磷酸氢二钾，2g柠檬酸二铵，5g无水乙酸钠，0.58g硫酸镁，0.2g硫酸锰，1mL吐温80，1L蒸馏水，调节pH值至6.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201124 |
|
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