CN113337446A - 一种复合发酵剂制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复合发酵剂制备方法及其应用，包括步骤一，培养基建立；步骤二，乳酸菌分离鉴定；步骤三，优良菌株筛选；步骤四，菌剂制备；步骤五，复合发酵剂制备；通过类肠膜魏斯氏菌协同植物乳杆菌和短乳杆菌形成复合发酵剂发酵芥菜，改善产品风味，表现了较好的潜在应用价值；通过该复合发酵剂的使用，不仅能缩短芥菜发酵周期、提前到达发酵终点，减少杂菌微生物的危害，还能调控发酵芥菜在口感风味上的不足，方便使用，且符合食品发展的风味和健康趋势，该复合发酵剂可直接投入到芥菜生产中，提高产品质量，使用方便，解决了芥菜加工生产中发酵周期长、产品质量稳定性差、风味不佳等关键问题。
Description
技术领域
本发明涉及蔬菜发酵及加工技术领域，具体为一种复合发酵剂制备方法及其应用。
背景技术
目前，常见的蔬菜发酵剂为单菌种发酵，单菌种发酵蔬菜可以使发酵周期缩短，提前结束发酵时间，但是，单菌种产物比较单一，在产品风味上，达到的效果不理想，口味、风味单一，因此，现阶段亟需一种新型的复合发酵剂制备方法及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合发酵剂制备方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种复合发酵剂制备方法，包括步骤一，培养基建立；步骤二，乳酸菌分离鉴定；步骤三，优良菌株筛选；步骤四，菌剂制备；步骤五，复合发酵剂制备；
其中上述步骤一中，按照重量份数选取10份的蛋白胨、10份的牛肉膏、5份的酵母膏、20份的葡萄糖、2份的柠檬酸钠、2份的乙酸钠、0.58份的硫酸镁、0.25份的硫酸锰、2份的磷酸氢二钾、1份的吐温80和1份的蒸馏水，在pH值6.28～6.7的环境下，121℃湿热灭菌30min制成MRS培养基；然后在MRS琼脂培养基中加入1.5％的碳酸钙，制成CaCO3-MRS琼脂培养基；
其中上述步骤二中，首先进行乳酸菌的分离培养，分别取1mL的酸菜汁，通过逐级稀释的方法分别稀释10-1至10-7浓度级，取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，用无菌玻璃刮铲依次涂布接种于MRS琼脂平板上，每个稀释度涂3个平板，置37℃培养48h，当出现溶钙圈、圆形稍扁平或凸起、白色或黄色，初步鉴定为乳酸菌；然后进行菌株的鉴定，先进行形态观察鉴定，用接种针取适量纯化后的菌体涂布在MRS培养基上，37℃培养48h，观察菌落在培养基上的大小、颜色、形状、边缘状况，之后取菌落涂片进行革兰氏染色，油镜下观察，然后进行菌株生理生化鉴定，将筛选纯化所得菌株参考《伯杰细菌手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，设计生化试验，分别进行过化氢酶、淀粉水解、柠檬酸盐、明胶液化测定和糖发酵试验；
其中上述步骤三中，首先进行分离菌株的产酸能力比较，在超净工作台中，挑取斜面上的菌株转接至MRS液体培养基中，37℃条件下活化菌株12-24h，再按2％的接种量接种活化后菌液至MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h；将菌液混匀，在600nm的波长下测菌液的吸光度值，同时用pH计测定发酵液pH值，比较各菌株产酸能力，挑选生长较快和产酸能力强的菌株进行下一步的实验；然后进行分离菌株亚硝酸盐降解率测定，将在MRS培养液中活化后的菌株，以2％接种量接种于含有150μg/mL亚硝酸钠的MRS培养液中，37℃培养24h，测定培养前后培养液中亚硝酸钠含量，计算培养液中亚硝酸盐降解率；然后筛选菌株的生长曲线，并筛选菌株的耐酸能力比较；
其中上述步骤四中，首先，进行菌剂的制备，将筛选得到的菌株在MRS液体培养基中活化3代，扩大培养后进行离心处理，并弃上清液收集菌体，然后以10％的脱脂乳粉、10％的海藻糖和1％的谷氨酸钠作为保护剂，且经预试验确定各保护剂浓度，将配置好的保护剂与菌泥混合，按照菌泥∶保护剂为1∶3(w/v)比例混匀，分装到平板中，在-20℃冰箱中预冻24h，后真空冷冻干燥；
其中上述步骤五中，将植物乳杆菌、短乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌按照不同比例分13组以接种量0.5％的质量浓度比芥菜发酵，密封发酵周期为7d，对发酵成品进行pH值和总酸含量的测定及感官评价；结合pH值、总酸含量和感官评定分数对不同菌种配比发酵芥菜效果进行分析，确定复合发酵剂的复配比例。
进一步的，所述步骤二中，在进行菌株生理生化鉴定后，进行16S rDNA基因序列扩增及测序，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书实验操作步骤进行提取菌株基因组DNA，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反应采用50μL反应体系，PCR条件为，94℃预变3min，94℃变性1min，56℃复性30s，72℃延伸1min，30次循环，最后72℃延伸5min，测定后的16S rDNA序列登陆NCBI进行BLAST比对。
进一步的，所述步骤三中，筛选菌株的生长曲线的方式为，将活化12h后的菌液按2％的接种量转接至MRS液体培养基中，同时以不接种的MRS液体培养基作为空白对照，于37℃恒温培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h时将培养管取出，测定各菌株溶液在波长600nm处的吸光值，记录测量结果，以培养时间为横坐标，各菌株溶液在波长600nm处的吸光值为纵坐标，绘制各菌株生长曲线；筛选菌株的耐酸能力比较的方式为，将筛选出的菌株活化后分别接种于pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7和pH8的MRS培养液中，37℃培养，每隔2h测定菌液在波长600nm处的吸光值，以培养时间为横坐标，菌液在波长600nm处的吸光值为纵坐标，绘制曲线。
进一步的，所述步骤四中，离心处理的方式为8000r/min的转速下4℃离心10min。
进一步的，所述步骤五中，菌种比例植物乳杆菌∶短乳杆菌∶类肠膜魏斯氏菌为2∶1∶1时为复配比例。
一种复合发酵剂的应用，包括使用复合发酵剂发酵芥菜，采用不同发酵方式进行发酵芥菜对比，乳酸菌发酵剂发酵试验组：直投式发酵剂菌剂添加量为0.7％，发酵温度为20℃，发酵6d。
进一步的，所述使用复合发酵剂发酵芥菜的发酵工艺为：青菜整理、清洗、切分、入缸、接种、密封、发酵和成品，菌剂添加量0.5％；发酵温度为20℃，密封发酵7d。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：通过类肠膜魏斯氏菌协同植物乳杆菌和短乳杆菌形成复合发酵剂发酵芥菜，改善产品风味，表现了较好的潜在应用价值；通过从传统自然发酵芥菜中分离筛选性状优良的具有潜在应用价值的乳酸菌，通过真空冷冻干燥技术制备乳酸菌发酵剂，该乳酸菌发酵剂的使用不仅能缩短芥菜发酵周期、提前到达发酵终点，减少杂菌微生物的危害，还能调控发酵芥菜在口感风味上的不足，符合食品发展的风味和健康趋势，该复合发酵剂可直接投入到芥菜生产中，提高产品质量，使用方便，解决了芥菜加工生产中发酵周期长、产品质量稳定性差、风味不佳等关键问题。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明中乳酸菌发酵剂的制备流程图；
图2是本发明的方法流程图；
图3是本发明中芥菜样品中的pH和总酸量示意图；
图4是本发明中乳酸菌鉴定结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种复合发酵剂制备方法，包括步骤一，培养基建立；步骤二，乳酸菌分离鉴定；步骤三，优良菌株筛选；步骤四，菌剂制备；步骤五，复合发酵剂制备；
其中上述步骤一中，选取10g的蛋白胨、10g的牛肉膏、5g的酵母膏、20g的葡萄糖、2g的柠檬酸钠、2g的乙酸钠、0.58g的硫酸镁、0.25g的硫酸锰、2g的磷酸氢二钾、1mL的吐温80和1mL的蒸馏水，在pH值6.28～6.7的环境下，121℃湿热灭菌30min制成MRS培养基；然后在MRS琼脂培养基中加入1.5％的碳酸钙，制成CaCO3-MRS琼脂培养基；
其中上述步骤二中，首先进行乳酸菌的分离培养，分别取1mL的酸菜汁，通过逐级稀释的方法分别稀释10-1至10-7浓度级，取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，用无菌玻璃刮铲依次涂布接种于MRS琼脂平板上，每个稀释度涂3个平板，置37℃培养48h，当出现溶钙圈、圆形稍扁平或凸起、白色或黄色，初步鉴定为乳酸菌；然后进行菌株的鉴定，先进行形态观察鉴定，用接种针取适量纯化后的菌体涂布在MRS培养基上，37℃培养48h，观察菌落在培养基上的大小、颜色、形状、边缘状况，之后取菌落涂片进行革兰氏染色，油镜下观察，然后进行菌株生理生化鉴定，将筛选纯化所得菌株参考《伯杰细菌手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，设计生化试验，分别进行过化氢酶、淀粉水解、柠檬酸盐、明胶液化测定和糖发酵试验；在进行菌株生理生化鉴定后，进行16SrDNA基因序列扩增及测序，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书实验操作步骤进行提取菌株基因组DNA，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反应采用50μL反应体系，PCR条件为，94℃预变3min，94℃变性1min，56℃复性30s，72℃延伸1min，30次循环，最后72℃延伸5min，测定后的16S rDNA序列登陆NCBI进行BLAST比对；
其中上述步骤三中，首先进行分离菌株的产酸能力比较，在超净工作台中，挑取斜面上的菌株转接至MRS液体培养基中，37℃条件下活化菌株12-24h，再按2％的接种量接种活化后菌液至MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h；将菌液混匀，在600nm的波长下测菌液的吸光度值，同时用pH计测定发酵液pH值，比较各菌株产酸能力，挑选生长较快和产酸能力强的菌株进行下一步的实验；然后进行分离菌株亚硝酸盐降解率测定，将在MRS培养液中活化后的菌株，以2％接种量接种于含有150μg/mL亚硝酸钠的MRS培养液中，37℃培养24h，测定培养前后培养液中亚硝酸钠含量，计算培养液中亚硝酸盐降解率；然后筛选菌株的生长曲线，并筛选菌株的耐酸能力比较；筛选菌株的生长曲线的方式为，将活化12h后的菌液按2％的接种量转接至MRS液体培养基中，同时以不接种的MRS液体培养基作为空白对照，于37℃恒温培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h时将培养管取出，测定各菌株溶液在波长600nm处的吸光值，记录测量结果，以培养时间为横坐标，各菌株溶液在波长600nm处的吸光值为纵坐标，绘制各菌株生长曲线；筛选菌株的耐酸能力比较的方式为，将筛选出的菌株活化后分别接种于pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7和pH8的MRS培养液中，37℃培养，每隔2h测定菌液在波长600nm处的吸光值，以培养时间为横坐标，菌液在波长600nm处的吸光值为纵坐标，绘制曲线；
其中上述步骤四中，首先，进行菌剂的制备，将筛选得到的菌株在MRS液体培养基中活化3代，扩大培养后进行离心处理，离心处理的方式为8000r/min的转速下4℃离心10min，并弃上清液收集菌体，然后以10％的脱脂乳粉、10％的海藻糖和1％的谷氨酸钠作为保护剂，且经预试验确定各保护剂浓度，将配置好的保护剂与菌泥混合，按照菌泥∶保护剂为1∶3(w/v)比例混匀，分装到平板中，在-20℃冰箱中预冻24h，后真空冷冻干燥；
其中上述步骤五中，将植物乳杆菌、短乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌按照不同比例分13组以接种量0.5％的质量浓度比芥菜发酵，密封发酵周期为7d，对发酵成品进行pH值和总酸含量的测定及感官评价，参阅表1，感官评价评价表；结合pH值、总酸含量和感官评定分数对不同菌种配比发酵芥菜效果进行分析，确定复合发酵剂的复配比例，菌种比例植物乳杆菌∶短乳杆菌∶类肠膜魏斯氏菌为2∶1∶1时为复配比例。
表1感官评价评价表
请参阅图3-4，本发明提供一种技术方案：一种复合发酵剂的应用，包括使用复合发酵剂发酵芥菜，使用复合发酵剂发酵芥菜的发酵工艺为：青菜整理、清洗、切分、入缸、接种、密封、发酵和成品，菌剂添加量0.5％；发酵温度为20℃，密封发酵7天，采用不同发酵方式进行发酵芥菜对比，乳酸菌发酵剂发酵试验组：直投式发酵剂菌剂添加量为0.7％，发酵温度为20℃，发酵6d，乳酸菌粉比例为植物乳杆菌∶短乳杆菌∶类肠膜魏斯氏为2∶1∶1，发酵6d后，酸菜色泽明亮、表现为均一的明黄色且无白璞和霉菌，通过类肠膜魏斯氏菌协同植物乳杆菌和短乳杆菌形成复合发酵剂发酵芥菜，改善产品风味，表现了较好的潜在应用价值；相比于自然发酵的芥菜，乳酸菌发酵剂试验组发酵的芥菜的总酸含量高、产酸快，pH值低、能抑制有害微生物生长，发酵芥菜样品感官评分如表2所示，芥菜样品中的pH和总酸量如图3所示，酸菜中的有机酸含量如表3所示。
表2发酵芥菜样品感官评分表
表3酸菜中的有机酸含量表
| 样品 | 乳酸/(μg/g) | 酒石酸/(μg/g) | 琥珀酸/(μg/g) | 富马酸/(μg/g) |
| CK | 1815.98±16.65 | 231.09±10.90 | - | - |
| 混菌发酵组 | 1803.51±1.27 | 159.82±0.88 | 90.74±0.45 | 2.35±0.01 |
基于上述，该发明相较于传统的乳酸菌发酵剂，通过类肠膜魏斯氏菌、植物乳杆菌和短乳杆菌复合形成的发酵剂发酵芥菜，改善产品风味，表现了较好的潜在应用价值；且通过该复合发酵剂的使用，不仅能缩短芥菜发酵周期，减少杂菌微生物的危害，还能改善芥菜风味，符合食品发展的风味和健康趋势，该复合发酵剂可直接投入到芥菜生产中，解决了芥菜加工生产中发酵周期长、产品质量稳定性差、风味不佳等关键问题；通过从传统自然发酵芥菜中分离筛选出性状优良的乳酸菌，并通过真空冷冻干燥技术制备复合发酵剂，对接种发酵和自然发酵的芥菜品质进行对比，利于生产出具有潜在工业价值的发酵剂菌种。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其它变体意在涵盖非排它性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其它要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种复合发酵剂制备方法，包括步骤一，培养基建立；步骤二，乳酸菌分离鉴定；步骤三，优良菌株筛选；步骤四，菌剂制备；步骤五，复合发酵剂制备；其特征在于：
其中上述步骤一中，按照重量份数选取10份的蛋白胨、10份的牛肉膏、5份的酵母膏、20份的葡萄糖、2份的柠檬酸钠、2份的乙酸钠、0.58份的硫酸镁、0.25份的硫酸锰、2份的磷酸氢二钾、1份的吐温80和1份的蒸馏水，在pH值6.28～6.7的环境下，121℃湿热灭菌30min制成MRS培养基；然后在MRS琼脂培养基中加入1.5％的碳酸钙，制成CaCO3-MRS琼脂培养基；
其中上述步骤二中，首先进行乳酸菌的分离培养，分别取1mL的酸菜汁，通过逐级稀释的方法分别稀释10-1至10-7浓度级，取10-3、10-4和10-5稀释液各0.1mL，用无菌玻璃刮铲依次涂布接种于MRS琼脂平板上，每个稀释度涂3个平板，置37℃培养48h，当出现溶钙圈、圆形稍扁平或凸起、白色或黄色，初步鉴定为乳酸菌；然后进行菌株的鉴定，先进行形态观察鉴定，用接种针取适量纯化后的菌体涂布在MRS培养基上，37℃培养48h，观察菌落在培养基上的大小、颜色、形状、边缘状况，之后取菌落涂片进行革兰氏染色，油镜下观察，然后进行菌株生理生化鉴定，将筛选纯化所得菌株参考《伯杰细菌手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，设计生化试验，分别进行过化氢酶、淀粉水解、柠檬酸盐、明胶液化测定和糖发酵试验；
其中上述步骤三中，首先进行分离菌株的产酸能力比较，在超净工作台中，挑取斜面上的菌株转接至MRS液体培养基中，37℃条件下活化菌株12-24h，再按2％的接种量接种活化后菌液至MRS液体培养基中，置于37℃恒温培养箱中培养24h；将菌液混匀，在600nm的波长下测菌液的吸光度值，同时用pH计测定发酵液pH值，比较各菌株产酸能力，挑选生长较快和产酸能力强的菌株进行下一步的实验；然后进行分离菌株亚硝酸盐降解率测定，将在MRS培养液中活化后的菌株，以2％接种量接种于含有150μg/mL亚硝酸钠的MRS培养液中，37℃培养24h，测定培养前后培养液中亚硝酸钠含量，计算培养液中亚硝酸盐降解率；然后筛选菌株的生长曲线，并筛选菌株的耐酸能力比较；
其中上述步骤四中，首先，进行菌剂的制备，将筛选得到的菌株在MRS液体培养基中活化3代，扩大培养后进行离心处理，并弃上清液收集菌体，然后以10％的脱脂乳粉、10％的海藻糖和1％的谷氨酸钠作为保护剂，且经预试验确定各保护剂浓度，将配置好的保护剂与菌泥混合，按照菌泥∶保护剂为1∶3(w/v)比例混匀，分装到平板中，在-20℃冰箱中预冻24h，后真空冷冻干燥；
其中上述步骤五中，将植物乳杆菌、短乳杆菌、类肠膜魏斯氏菌按照不同比例分13组以接种量0.5％的质量浓度比芥菜发酵，密封发酵周期为7d，对发酵成品进行pH值和总酸含量的测定及感官评价；结合pH值、总酸含量和感官评定分数对不同菌种配比发酵酸菜效果进行分析，确定复合发酵剂的复配比例。
2.根据权利要求1所述的一种复合发酵剂制备方法，其特征在于：所述步骤二中，在进行菌株生理生化鉴定后，进行16S rDNA基因序列扩增及测序，按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书实验操作步骤进行提取菌株基因组DNA，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR反应采用50μL反应体系，PCR条件为，94℃预变3min，94℃变性1min，56℃复性30s，72℃延伸1min，30次循环，最后72℃延伸5min，测定后的16S rDNA序列登陆NCBI进行BLAST比对。
3.根据权利要求1所述的一种复合发酵剂制备方法，其特征在于：所述步骤三中，筛选菌株的生长曲线的方式为，将活化12h后的菌液按2％的接种量转接至MRS液体培养基中，同时以不接种的MRS液体培养基作为空白对照，于37℃恒温培养，分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h时将培养管取出，测定各菌株溶液在波长600nm处的吸光值，记录测量结果，以培养时间为横坐标，各菌株溶液在波长600nm处的吸光值为纵坐标，绘制各菌株生长曲线；筛选菌株的耐酸能力比较的方式为，将筛选出的菌株活化后分别接种于pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7和pH8的MRS培养液中，37℃培养，每隔2h测定菌液在波长600nm处的吸光值，以培养时间为横坐标，菌液在波长600nm处的吸光值为纵坐标，绘制曲线。
4.根据权利要求1所述的一种复合发酵剂制备方法，其特征在于：所述步骤四中，离心处理的方式为8000r/min的转速下4℃离心10min。
5.根据权利要求1所述的一种复合发酵剂制备方法，其特征在于：所述步骤五中，菌种比例植物乳杆菌∶短乳杆菌∶类肠膜魏斯氏菌为2∶1∶1时为复配比例。
6.一种复合发酵剂的应用，其特征在于：包括使用复合发酵剂发酵芥菜，采用不同发酵方式进行发酵芥菜对比，乳酸菌发酵剂发酵试验组：直投式发酵剂菌剂添加量为0.7％，发酵温度为20℃，发酵6d。
7.根据权利要求6所述的一种复合发酵剂的应用，其特征在于：所述使用复合发酵剂发酵芥菜的发酵工艺为：青菜整理、清洗、切分、入缸、接种、密封、发酵和成品，菌剂添加量0.5％；发酵温度为20℃，密封发酵7d。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210903 |
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