CN113308418B - 一株发酵用的谷糠乳杆菌及其发酵制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种发酵用的谷糠乳杆菌及其发酵制备工艺的应用。本发明从天然发酵酵素中分离获得一种乳杆菌，经鉴定为谷糠乳杆菌Lactobacillus farraginis，命名为84‑M‑Y‑7，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22055。该菌为食品用乳酸菌，培养周期短，生长繁殖速度快。本发明还提供该菌株发酵工艺的应用，经发酵、后熟、离心、过滤、调味、灌装，得饮料产品。利用该菌株制得的发酵饮料产品，在具有天然植物饮料特有香气和口感的基础上，同时优化了中药材原有的风味，使产品口感更佳，营养价值更高，保质期更长且具有良好的抗氧化性。

Description

一株发酵用的谷糠乳杆菌及其发酵制备工艺

技术领域

本发明涉及微生物技术及其应用领域，特别为一株食品发酵用的乳酸菌菌株及其在食药同源发酵中的应用。

背景技术

发酵是指人们借助微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体本身、或者直接代谢产物或次级代谢产物的过程。现如今，微生物发酵技术已广泛应用于食品加工行业，与传统发酵制品的生产模式相比，利用特定菌种发酵可以有效地解决传统发酵食品在工业化生产当中存在的问题，且具有发酵活力强、发酵时间短、可保持微生物菌种的活性、有效地防止杂菌污染、节省原材料、降低成本等优点，同时还可以保证发酵产品质量的稳定，能够精确控制发酵工程，降低生产风险。乳酸菌是一类可将碳水化合物代谢为乳酸的不具有芽孢结构的革兰氏阳性菌，被广泛运用于各类食品加工行业，利用乳酸菌生产加工发酵制品，在改善物料原有风味的同时，还具有强化人体胃肠道功能，促进机体对营养物质的消化吸收等作用。

“食药同源”中药是指既具有药效作用又可作为食物食用的中药材，如：人参、葛根、黄芪等，这些物料大多在中药配伍中应用较多，在食品加工产业中应用较少。发酵植物基饮料作为一种兴起的健康饮品，利用微生物对物料进行发酵，可以将物料中的大分子物质转化成小分子，在增强特征性功能物质的同时也更有易于人体的消化吸收，同时还可以优化产品的风味。目前，市场上与“食药同源”中药有关的发酵产品几乎没有。因此，将微生物发酵技术应用于“食药同源”中药材，在最大限度保留中药材中的营养物质，充分发挥中药材营养功效的同时，还可以有效地改善中药材的风味，提高中药材的保质期。基于此，利用微生物发酵技术开发研制“食药同源”中药发酵饮品，既充分利用了我国丰富的中药材资源，又增加和拓宽了我国中药材加工品的种类，促进了中药材的农业产业化。

发明内容

基于上述分析，本发明的目的是提供一种新的食品发酵用的乳酸菌菌株，以及利用该新的乳酸菌加工的“食药同源”中药发酵制品，以克服现有技术的缺陷，最大程度地保留中药材的营养成分，优化中药材的风味，强化人体对中药材营养物质的消化吸收。

本发明提供一种谷糠乳杆菌(Lactobacillus farraginis)84-M-Y-7，该菌株于2021年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为谷糠乳杆菌Lactobacillus farraginis，保藏编号为CGMCC No.22055。

本发明的谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7菌株的菌学特征：谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7单菌落呈乳白色、圆形、湿润、边缘整齐、不透明、不连片，革兰氏染色呈阳性。

本发明所述的利用谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7菌株生产“食药同源”中药发酵制品的方法，是通过对中药材进行发酵温度、pH值和时间等摸索，进而研究出的一套适合该菌株的发酵饮料制备工艺：原料挑选→清洗→烫漂→榨汁→煮沸→发酵→后熟→离心→过滤→调味→灌装→成品。

本发明发酵饮料制备的条件是：所述谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7的接种量为4-20％。发酵温度20-40℃，优选最适温度为32-38℃，更优选的是34-37℃。发酵时间20-80h，优选40-55h，更优选的是42-52h。后熟温度4-10℃，优选最适温度为4℃，后熟时间20-80h，优选40-55h，更优选的是42-52h。发酵方式为静置培养。

本发明的一个目的是提供谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在发酵制品中的应用。发酵制品为食药同源的中药材发酵制品。发酵制品为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参、玛卡之一的食药同源中药材，也可以是使用谷糠乳杆菌菌株发酵其他种类中药材。发酵制品可以是发酵饮料、膏剂、粉剂、含片等。

本发明的一个目的是提供一种发酵饮品的制备工艺，工艺步骤包括原料挑选、清洗、烫漂、榨汁、煮沸、发酵、后熟、离心、过滤、调味、灌装、成品。工艺步骤包括原料挑选、原料处理等步骤，原料处理包括烫漂、榨汁、煮沸步骤，产品经发酵后还包括后熟步骤。工艺步骤还包括离心、过滤、调味、灌装、包装、成品的一步或多步。

本发明的另一个目的是提供一种发酵饮品的制备工艺，包括使用本发明的谷糠乳杆菌对基料进行发酵。

本发明的另一个目的是提供一种发酵饮品的制备工艺，制备工艺包括如下步骤：

(1)原料预处理；

(2)中药材原液的制备：将处理好的中药材原料添加纯净水和一定量的羧甲基纤维素钠榨汁，将榨好的中药材原料原液煮沸15-20s后冷却备用；

(3)发酵菌种的制备：将谷糠乳杆菌84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养，制备种子液；

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照4-20％的接种量接入中药材原料原液中，将其置于恒温培养箱中培养得发酵液；

(5)离心过滤：将发酵液进行离心，过滤，得发酵原液；

(6)调味灌装：将发酵原液进行调味，无菌灌装，即得发酵饮品。

优选的，原料为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参、玛卡之一。

优选的，还包括后熟步骤，其为将发酵液置于4-6℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为24-72h。

优选的，调味灌装中使用蜂蜜和纯净水进行调味。

优选的，原料预处理步骤包括将原料挑选、清洗、去皮、洗净，切成小块后沸水烫漂20-30s。

在上述发酵工艺中，菌株84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

在上述发酵工艺中，可选地，谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7进行发酵制备，发酵条件为温度20-40℃，发酵时间20-80h，静置培养。

在上述发酵步骤中，可选地，将预先培养的菌体按4-20％的接种量接种入原料液。发酵产品的制备工艺中还包括后熟步骤，后熟温度优选4-6℃，后熟时间优选36-60h。

本发明提供的谷糠乳杆菌L.farraginis，编号为84-M-Y-7,可制备为菌剂、菌剂组合物及发酵粉剂等产品或添加剂。

产品或添加剂中谷糠乳杆菌84-M-Y-7使用MRS液体培养基培养，MRS液体培养基配方为：蛋白胨10g、牛肉粉5g、酵母粉4g、K₂HPO₄·7H₂O 2g、柠檬酸三铵2g、CH₃COONa·3H₂O5g、葡萄糖20g、吐温80 1mL、MgSO₄·7H₂O 0.2g、MnSO₄·4H₂O 0.05g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。

通过上述技术方案，本发明公开提供了一株食品发酵用的乳酸菌菌株及其在“食药同源”中药发酵中的应用，与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.该菌株可以作为优质发酵剂：本发明作为高活菌数的菌种培养物接入到“食药同源”中药原液中，可使料液进行充分发酵且发酵时间短，发酵特性好，产品质量稳定，风味优良。

2.本发明的发酵剂使用方便：本发明的发酵剂可直接添加到物料中，不需添加其他添加剂，使用方便，使用剂量小。

3.利用该菌株制得的六种发酵饮料改善了中药材本身的味道，在优化中药材风味的同时最大限度地保留了中药材原有的营养成分，并且利用乳酸菌的作用促进了结合态活性成分的释放，有效地提高了产品的功能特性，加强了人体的消化吸收。

附图说明

图1 4株乳酸菌菌落形态特征和革兰氏染色结果。

图2基于16SrDNA基因序列4株菌株的系统发育树。

图3不同菌株发酵石斛汁pH值(A)、总酸含量(B)以及OD₆₀₀(C)变化。

图4发酵饮料与未发酵原液对ABTS自由基清除效果的比较。A-F分别为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参和玛卡发酵饮料与未发酵原液的比较。

图5发酵饮料与未发酵原液对羟自由基清除效果的比较。A-F分别为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参和玛卡发酵饮料与未发酵原液的比较。

图6发酵饮料与未发酵原液还原力的比较。A-F分别为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参和玛卡发酵饮料与未发酵原液的比较。

图7六种发酵饮料在4℃下贮藏63天pH值变化。

图8六种发酵饮料在4℃下贮藏63天总酸含量变化。

图9六种发酵饮料在4℃下贮藏63天活菌数变化。

图10六种发酵饮料在4℃下贮藏63天感官评定结果。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1乳酸菌的分离纯化

将收集的民间酵素产品在超净工作台中利用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，取适当稀释倍数的菌液1mL并利用涂布棒均匀涂布于乳酸菌鉴别培养基上并置于37℃厌氧培养箱中恒温培养48-72h。随后取出培养基于无菌环境下挑取直径为1-2mm，表面光滑的单菌落，并利用划线的方法接种到新的乳酸菌鉴别培养基上，多次重复，直到分离纯化出纯菌落，此时初步鉴定菌种为乳酸菌，并对菌株进行编号。将筛选出的乳酸菌利用无菌生理盐水进行梯度稀释并利用MRS固体培养基于37℃恒温培养72h观察其菌落形态特征和显微形态学特征(革兰氏染色)。

随后根据微生物菌落的大小、颜色、光泽、透明度，挑取呈乳白色，表面光滑的单一菌落，并利用划线的方法在MRS平板上划线纯化2-3次后，将菌株4℃冰箱保存。

实施例2乳杆菌菌种鉴定

对纯化出的菌株的表型特征和16SrDNA进行系统鉴定。

一、表型特征及表型观察：

分离得到的4株乳酸菌菌落形态特征如图1所示，由图1A可知，菌株的菌落形态均呈乳白色，边缘比较规则呈圆形，表面光滑，菌落直径大小在1.0-1.5mm范围内，分别将其命名为84-M-Y-7，83-M-Y-6，57-M-H-7和102-M-H-8。将这4株乳酸菌进行革兰氏染色鉴定，并在100倍油镜下观察菌体特征。镜检结果表明，所有菌株均为革兰氏阳性菌株，其菌体形态呈杆状且排列方式多样。

二、16S rDNA序列分析

分离获得的乳酸菌接种到MRS液体培养基中活化24h，取1mL菌液于1.5mL无菌离心管中，采用Plant Zol(全式金试剂盒)提取基因组，将提取的基因组DNA利用细菌通用引物27F(SEQ ID NO:1 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(SEQ ID NO:2 5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)扩增细菌16SrDNA，扩增的模板采用30μL体系进行扩增。PCR条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸1.5min，25次循环；72℃延伸7min；3％琼脂糖电泳检测，随后将扩增样品送北京睿博兴科生物技术有限公司测序。

登录NCBI网站，将分离获得的4株乳酸菌16SrDNA测序结果与该网站数据库中相关信息进行BLAST同源性分析和比对，鉴定菌种并进行系统发育树构建，结果如图2所示。由图2可知，编号为84-M-Y-7的菌株为谷糠乳杆菌，编号为83-M-Y-6的菌株为哈尔滨乳杆菌，编号为57-M-H-7的菌株为副干酪乳杆菌，编号为102-M-H-8的菌株为布氏乳杆菌。

实施例3谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7的筛选

选用新鲜的石斛，除去杂物，剔除烂叶，利用流动的清水将石斛清洗干净后，切段(约2-3cm左右)，烫漂(约10-20s)，榨汁，煮沸(约10-20s)，灌装至250mL锥形瓶中。250mL锥形瓶采用121℃，灭菌15min处理。

将活化好的4株乳酸菌于超净工作台中接种到事先灭好菌的MRS液体培养基中进行3-4次传代培养，当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，制成种子液备用。

将4株乳酸菌种子液按照10％的接种量分别接种到石斛汁中进行发酵，发酵条件为：37℃恒温静置培养48h，随后转置于4℃低温冷藏冰箱中后熟48h。发酵后熟期间，每12h测定一次pH值，总酸含量以及OD₆₀₀，通过比较多指标测定结果以优选出适宜发酵菌株。

基本指标测定包括：

pH值测定：利用pH计测定；

总酸含量测定：利用电位滴定法测定；

OD₆₀₀测定：利用紫外可见分光光度计测定。

数据采用Graph Pad Prism 7.0绘图软件进行处理和分析作图，用SPSS 11进行方差分析。

结果分析：不同菌株发酵石斛汁pH值、总酸含量以及OD₆₀₀的变化如图3所示，其中0到48h为37℃发酵三种指标的变化趋势，48h到96h为4℃后熟三种指标的变化趋势。由图3可知，在整个发酵后熟过程中，pH值的变化与总酸含量的变化呈负相关，而OD₆₀₀呈先上升后下降的变化趋势。石斛原汁的pH值为5.46，总酸含量为0.45mL/L，经谷糠乳杆菌84-M-Y-7、哈尔滨乳杆菌83-M-Y-6、副干酪乳杆菌57-M-H-7以及布氏乳杆菌102-M-H-8发酵后，pH值依次降到了3.12、3.54、3.43和3.39，乳酸含量依次增加到4.95mL/L、1.35mL/L、3.45mL/L和4.35mL/L。自48h发酵结束进入后熟阶段后，由于乳酸菌生长代谢速度变慢，因此，pH值和总酸含量变化较小并于96h后熟结束后，4株菌株发酵石斛汁的pH值依次为3.03、3.5、3.3和3.27，总酸含量依次为6.45mL/L、2.3mL/L、4.35mL/L和5.25mL/L。结合发酵阶段石斛汁pH值和总酸含量变化，发现经谷糠乳杆菌84-M-Y-7发酵的石斛汁pH值和总酸含量变化最大，接下来是布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌，变化最小的是经哈尔滨乳杆菌发酵的是石斛汁。

实验以OD₆₀₀作为测定不同菌株发酵石斛汁过程中活菌数变化的指标。OD₆₀₀值越大，表明菌体浓度相对越高，菌株在石斛汁中的适应能力就越强。由图3C可知，在整个发酵后熟过程中，谷糠乳杆菌84-M-Y-7发酵石斛汁的OD₆₀₀值明显高于其他菌株，其次是布氏乳杆菌和副干酪乳杆菌，最后是哈尔滨乳杆菌，四株菌株在石斛汁中OD₆₀₀的变化情况与pH值以及总酸含量变化相对应。因此，根据上述实验结果可知，谷糠乳杆菌84-M-Y-7在石斛汁中适应性较强，发酵石斛汁的效果优于其他菌株。选取该菌株于2021年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为谷糠乳杆菌(L.farraginis)，保藏编号为CGMCC No.22055，并进行后续研究。

实施例4谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在葛根发酵中的应用

(1)原料预处理：选择新鲜、无霉烂的葛根，以流动的清水多次重复清洗，除去表面污垢后，去皮，切成小块，利用沸水烫漂20-30s左右，备用。

(2)葛根原液的制备：将处理好的葛根按照质量份数为葛根1-6份，蜂蜜1-3份，纯净水8-18份，羧甲基纤维素钠0.03-0.09份榨汁，将榨好的葛根原液煮沸15-20s后冷却备用。

(3)发酵菌种的制备：将发酵所用的菌种谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照6％的接种量接入葛根原液中，将其置于36℃的恒温培养箱中培养48h后，将其置于4℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为48h。

(5)离心过滤：将葛根发酵液进行离心，离心条件为：4000r/min，10min，取上清液过300目滤布，得发酵原液。

(6)调味灌装：将发酵原液按照质量份数葛根发酵原液3-9份，蜂蜜水(蜂蜜：水体积为1:1)1-4份，纯净水2-7份进行调味，无菌灌装于已灭菌的容器内，即得一种葛根发酵饮料。

实施例5谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在铁皮石斛发酵中的应用

(1)原料预处理：选择新鲜、无霉烂的铁皮石斛，以流动的清水多次重复清洗，除去表面污垢后，切成长度为2-3cm的小段，利用沸水烫漂20-30s左右，备用。

(2)铁皮石斛原液的制备：将处理好的铁皮石斛按照质量份数为铁皮石斛1-3份，蜂蜜2-4份，纯净水10-20份，羧甲基纤维素钠0.02-0.05份榨汁，将榨好的铁皮石斛原液煮沸15-20s后冷却备用。

(3)发酵菌种的制备：将发酵所用的菌种谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照10％的接种量接入铁皮石斛原液中，将其置于37℃的恒温培养箱中培养48h后，将其置于4℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为36h。

(5)离心过滤：将铁皮石斛发酵液进行离心，离心条件为：4000r/min，10min，取上清液过300目滤布，得发酵原液。

(6)调味灌装：将发酵原液按照质量份数铁皮石斛发酵原液1-5份，蜂蜜水(蜂蜜：水体积为1:1)1-3份，纯净水2-8份进行调味，无菌灌装于已灭菌的容器内，即得一种铁皮石斛发酵饮料。

实施例6谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在生姜发酵中的应用

(1)原料预处理：选择新鲜、无霉烂的生姜，以流动的清水多次重复清洗，除去表面污垢后，去皮，切成厚度为2-3cm的生姜片，利用沸水烫漂20-30s左右，备用。

(2)生姜原液的制备：将处理好的生姜按照质量份数为生姜2-6份，蜂蜜1-5份，纯净水6-18份，羧甲基纤维素钠0.02-0.08份榨汁，将榨好的生姜原液煮沸15-20s后冷却备用。

(3)发酵菌种的制备：将发酵所用的菌种谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照12％的接种量接入生姜原液中，将其置于36℃的恒温培养箱中培养36h后，将其置于4℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为42h。

(5)离心过滤：将生姜发酵液进行离心，离心条件为：4000r/min，10min，取上清液过300目滤布，得发酵原液。

(6)调味灌装：将发酵原液按照质量份数生姜发酵原液1-5份，蜂蜜水(蜂蜜：水体积为1:1)2-6份，纯净水1-8份进行调味，无菌灌装于已灭菌的容器内，即得一种生姜发酵饮料。

实施例7谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在山药发酵中的应用

(1)原料预处理：选择新鲜的山药，以流动的清水多次重复清洗，除去表面污垢后，去皮，切成厚度为2-3cm的圆片，利用沸水烫漂20-30s左右，备用。

(2)山药原液的制备：将处理好的山药按照质量份数为山药1-3份，蜂蜜1-6份，纯净水6-10份，羧甲基纤维素钠0.05-0.1份榨汁，将榨好的山药原液煮沸15-20s后冷却备用。

(3)发酵菌种的制备：将发酵所用的菌种谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照10％的接种量接入山药原液中，将其置于35℃的恒温培养箱中培养44h后，将其置于4℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为36h。

(5)离心过滤：将发酵好的山药原液进行离心，离心条件为：4000r/min，10min，取上清液过300目滤布，得发酵原液。

(6)调味灌装：将发酵原液按照质量份数山药发酵原液1-6份，纯净水2-6份进行调味，无菌灌装于已灭菌的容器内，即得一种山药发酵饮料。

实施例8谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在人参发酵中的应用

(1)原料预处理：选择新鲜的人参，以流动的清水多次重复清洗，除去表面污垢后，切成长度为2-3cm的小段，利用沸水烫漂20-30s左右，备用。

(2)人参原液的制备：将处理好的人参按照质量份数为人参1-3份，蜂蜜0.5-2份，纯净水8-12份，羧甲基纤维素钠0.01-0.06份榨汁，将榨好的人参原液煮沸15-20s后冷却备用。

(3)发酵菌种的制备：将发酵所用的菌种谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照8％的接种量接入人参原液中，将其置于36℃的恒温培养箱中培养42h后，将其置于4℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为48h。

(5)离心过滤：将发酵好的人参原液进行离心，离心条件为：4000r/min，10min，取上清液过300目滤布，得发酵原液。

(6)调味灌装：将发酵原液按照质量份数人参发酵原液2-6份，蜂蜜水(蜂蜜：水体积为1:1)1-3份，纯净水3-7份进行调味，无菌灌装于已灭菌的容器内，即得一种人参发酵饮料。

实施例9谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在玛卡发酵中的应用

(1)原料预处理：选择无虫蛀、无霉烂新鲜的玛卡，以流动的清水多次重复清洗，除去表面污垢，利用沸水烫漂20-30s左右，将其切成厚度为2-3cm的玛卡片备用。

(2)玛卡原液的制备：将处理好的玛卡按照质量份数为玛卡1-5份，蜂蜜2-6份，纯净水10-18份，羧甲基纤维素钠0.04-0.1份榨汁，将榨好的玛卡原液煮沸15-20s后冷却备用。

(3)发酵菌种的制备：将发酵所用的菌种谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养。当活菌数达到1×10⁷CFU/mL以上时，作为发酵种子液置于4℃冰箱中保存备用。

(4)发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照6％的接种量接入玛卡原液中，将其置于34℃的恒温培养箱中培养36h后，将其置于4℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为42h。

(5)离心过滤：将发酵好的玛卡原液进行离心，离心条件为：4000r/min，10min，取上清液过300目滤布，得发酵原液；

(6)调味灌装：将发酵原液按照质量份数玛卡发酵原液2-7份，蜂蜜水(蜂蜜：水体积为1:1)1-5份，纯净水4-10份进行调味，无菌灌装于已灭菌的容器内，即得一种玛卡发酵饮料。

实施例10发酵饮料性能检测

按照上述方法制备六种发酵饮料并对其基本指标、抗氧化性以及贮藏稳定性进行测定，具体实验方法如下：

一、发酵饮料基本指标测定实验方法如下：

(1)测定指标：饮料pH值

测定方法：利用pH计直接测定

(2)测定指标：总酸含量

测定方法：按照GB12456-2018《食品中总酸的测定》中的电位滴定法测定。

(3)测定指标：活菌数

测定方法：梯度稀释平板计数法

(4)测定指标：饮料含水率

测定方法：按照GB5009.3-2010《食品中水分的测定》中的直接干燥法测定。

(6)测定指标：饮料脂肪含量

测定方法：按照GB5009.6-2016《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法测定。

(7)测定指标：饮料灰分含量

测定方法：按照GB5009.4-2010《食品中灰分的测定》中的直接灰化法测定。

(8)测定指标：饮料钠，钙含量

测定方法：按照GB5009.92-2016《食品中钙的测定》以及GB5009.91-2017《食品中钾、钠的测定》中火焰原子吸收光谱法测定。

(9)测定指标：饮料大肠菌群测定

测定方法：按照GB4789.3-2016《食品微生物学检验大肠菌群计数》中的MPN法测定

(10)测定指标：饮料致病菌群测定

由于食品中最常含有的致病菌为沙门氏菌，因此，实验选择沙门氏菌作为致病菌进行检测。

测定方法：按照GB4789.3-2016《食品微生物学检验沙门氏菌检验》测定。

二、针对六种发酵饮料抗氧化性进行测定，具体测定方法如下：

(1)清除ABTS自由基能力测定

分别吸取以纯净水稀释至体积分数为100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5625％的发酵饮料0.1mL，加入3.5mL ABTS稀释液，作为样品组。对照组为同样体积分数的发酵饮料0.1mL，加入3.5mL 10mM pH7.4的PBS溶液，空白组为0.1mL的纯净水，加入3.5mL ABTS稀释液。将上述三组样品，摇匀并置暗处反应6min，于714nm处测吸光值。未发酵原液以同样的方法进行试验。所有试验，重复三次，取平均值，根据公式进行计算。

ABTS自由基清除率/％＝[1-(Ai-Aj)/AO]×100

式中：Ai为各体积分数样品与ABTS稀释液混合液的吸光度，Aj为各体积分数样品与10mM pH7.4的PBS混合液的吸光度，AO为纯净水与ABTS溶液混合液的吸光度。

(2)清除羟自由基能力测定

分别吸取以纯净水稀释至体积分数为100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5625％的发酵饮料1mL，加入0.75mmol/L的邻二氮菲溶液1mL，0.1mol/L pH7.4的PBS溶液2mL，0.75mmol/L的硫酸亚铁1mL。充分混匀后，加入0.01％的过氧化氢溶液1mL作为样品组。对照组用1mL纯净水代替1mL过氧化氢，空白组用1mL纯净水代替1mL样品，将上述三组样品，置于37℃水浴锅中，水浴60min，于536nm处测吸光值。未发酵原液以同样的方法进行试验。所有试验，重复三次，取平均值，根据公式进行计算。

羟自由基清除率/％＝(AS-AP)/(AB-AP)

式中：AS为各体积分数的样品与邻二氮菲等试剂混合液的吸光度，AB为对照组的吸光度，AP为空白组的吸光度。

三、还原力的测定

分别吸取以纯净水稀释至体积分数为100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5625％的发酵饮料1mL，加入0.2mol/LpH 6.6的PBS溶液2.5mL和1％铁氰化钾溶液2.5mL，50℃水浴反应20min后，加入10％的TCA溶液2.5mL和0.1％的三氯化铁0.5mL。暗处反应半小时后，以2000r/min离心5min，取上清液于700nm下测吸光值。未发酵原液以同样的方法进行试验。所有试验，重复三次，取平均值。

四、发酵饮料贮藏稳定性

具体测定方法如下：

将根据上述方法制作的发酵饮料置于4℃下放置60天，每隔7天测定饮料的pH值、总酸含量、活菌数，同时辅以感官评定来测定发酵饮料的贮藏稳定性。pH值、总酸含量、活菌数的测定方法同上述发酵饮料基本指标测定，感官评定则由多位本专业老师根据感官评定表进行品尝鉴定并打分，感官评定表如下：

表1发酵饮料感官指标评分标准

实施例11发酵饮料基本指标测定结果

按照上述测定方法，六种发酵饮料基本指标测定结果如下表所示：

表2葛根发酵饮料基本指标

表3铁皮石斛发酵饮料基本指标

表4生姜发酵饮料基本指标

表5山药发酵饮料基本指标

表6人参发酵饮料基本指标

表7玛卡发酵饮料基本指标

实施例12发酵饮料抗氧化性测定结果

将发酵饮料与未发酵原液对ABTS自由基以及羟自由基的清除效果，二者的还原力进行比较，结果见图4、5。

ABTS自由基是2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐与过二硫酸钾反应生成的绿色自由基，该自由基在714nm处有最大吸收。在样品中加入ABTS自由基溶液后，如果714nm处的吸光度降低，则说明该物质具有自由基清除活性，通过比较样品对ABTS自由基的清除效果，可以评价其抗氧化能力。由图4可知，随着体积分数的不断增加，发酵饮料与未发酵原液对ABTS自由基的清除率也在逐步增加且不同体积分数的发酵饮料对ABTS自由基的清除率均高于未发酵原液。

图5为发酵饮料与未发酵原液对羟自由基清除效果的比较。羟自由基(—OH)是一种重要的活性氧，具有极强的得电子能力即氧化能力。实验采用邻二氮菲-Fe²⁺氧化法来测定样品对羟自由基的清除能力，通过其呈色的变化来反映出样品的抗氧化性。由图5可知，发酵饮料与未发酵原液对羟自由基的清除率具有浓度依赖性，样品浓度越高，对羟自由基的清除效果就越好，且发酵饮料对羟自由基的清除率均高于未发酵原液。

还原力测定即抗氧化剂通过自身的还原作用，给出电子而清除自由基，还原力越强，抗氧化性越强。发酵饮料与未发酵原液在700nm下测定的吸光度值如图6所示，吸光度值越大，表明样品的还原力越强。根据实验结果可知，随着样品体积分数的增加，还原力也在逐渐提高，且发酵饮料的还原力明显优于未发酵原液。综上所述，利用谷糠乳杆菌(L.farraginis)84-M-Y-7发酵葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参和玛卡制得的发酵饮料，其抗氧化性明显增强。

实施例13发酵饮料贮藏稳定性测定结果

六种发酵饮料在4℃下贮藏63天，其pH值、总酸含量、活菌数、感官评定结果如图7-10所示。由图7-10可知，随着贮藏时间的延长，发酵饮料的pH值、总酸含量、活菌数并未发生明显变化。根据感官评定结果可知，发酵饮料冷藏保存两个月左右，仍具有较好的口感，与市场上同类型发酵产品相比，具有较长的货架期。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明做其它形式的限制，任何本领域技术人员可以利用上述公开的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院农产品加工研究所

<120> 一株发酵用的谷糠乳杆菌及其发酵制备工艺

<130> S010210713032Y

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacggctac cttgttacga 20

<210> 3

<211> 434

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tggacgaagt ctgatggagc aacgccgcgt gagtgatgaa gggtttcggc tcgtaaaact 60

ctgttgttgg agaagaacag gtgatagagt aactgttatc atcttgacgg tatccaacca 120

gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 180

cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcagg cggtttttta ggtctgatgt gaaagccttc 240

ggcttaaccg gagaagggca tcggaaaccg ggagacttga gtgcagaaga ggacagtgga 300

actccatgtg tagcggtgaa atgcgtagat atatggaaga acaccagtgg cgaaggcggc 360

tgtctggtct gtaactgacg ctgaggctcg aaagcatggg tagcgaacag gattagaaac 420

cccgggtagt ccaa 434

Claims (8)

1.一种发酵菌粉，其特征在于，发酵菌粉中包含谷糠乳杆菌，其为Lactobacillus farraginis，编号84-M-Y-7,谷糠乳杆菌84-M-Y-7保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22055。

2.一种发酵制品的制备工艺，其特征在于，使用权利要求1所述的发酵菌粉对基料进行发酵，所述基料为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参、玛卡之一的中药材。

3.一种发酵饮品的制备工艺，其特征在于，使用权利要求1所述的发酵菌粉对基料进行发酵，所述基料为葛根、铁皮石斛、生姜、山药、人参、玛卡之一的中药材。

4.如权利要求2或3所述的制备工艺，其特征在于，所述制备工艺包括如下步骤：

（1）原料预处理；

（2）中药材原液的制备：将处理好的中药材原料添加纯净水和一定量的羧甲基纤维素钠榨汁，将榨好的中药材原料原液煮沸15-20 s后冷却备用；

（3）发酵菌种的制备：将权利要求1中所述的谷糠乳杆菌84-M-Y-7在MRS液体培养基中进行3-4次传代培养，制备种子液；

（4）发酵后熟：在无菌环境下，将种子液按照4-20%的接种量接入中药材原料原液中，将其置于恒温培养箱中培养得发酵液；

（5）离心过滤：将发酵液进行离心、过滤，得发酵原液；

（6）调味灌装：将发酵原液进行调味，无菌灌装，即得发酵饮品。

5.如权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，步骤（4）发酵后熟步骤中，还包括后熟步骤，其为将发酵液置于4-10 ℃低温冷藏箱中进行后熟，后熟时长为24-72 h。

6.如权利要求5所述的制备工艺，其特征在于，步骤（6）调味灌装中使用蜂蜜和纯净水进行调味。

7.如权利要求4所述的制备工艺，其特征在于，步骤（1）原料预处理步骤包括将原料挑选、清洗、去皮、洗净，切成小块后沸水烫漂20-30 s。

8.如权利要求5或6任一所述的制备工艺，其特征在于，步骤（1）原料预处理步骤包括将原料挑选、清洗、去皮、洗净，切成小块后沸水烫漂20-30 s。

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