CN111944712B - 一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的名称为：LTJ12，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.20086，保藏日期：2020年6月15日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)来源于传统的发酵食品白酒发酵过程中的酒醅，属于公认安全的可用于食品的菌种。本发明植物乳杆菌具有优良的酒精耐受能力，该菌株是白酒酒醅中的优势菌株，具有很强的酒精耐受能力。

Description

一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其是一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌和应用。
背景技术
益生菌是一种通过改善肠道微生物平衡从而对宿主施加有益影响的微生物添加物，它们对机体有多种其他正常生理菌群无法比拟的生理作用。乳酸菌也普遍作为益生菌中的主要菌种，乳酸菌参与发酵不仅可以增加益生功能，还能丰富风味等。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是乳酸菌的一种，最适生长温度为30～35℃，厌氧或兼性厌氧，菌种为直或弯的杆状，单个、成对或成链状，最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌。植物乳杆菌作为人体胃肠道的益生菌群，具有维持肠道内菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种功能。植物乳杆菌在食品工业中应用十分广泛。
酒精是一种能够造成细胞膜通透性改变、细胞内物质流失、影响酶活性等的有机溶剂。在菌体生长的过程中，酒精浓度过高会对菌体的生理活性及其新陈代谢等方面造成不同程度的影响。有研究表明乳酸菌是白酒发酵过程中的优势细菌，随着发酵的进行，发酵体系内酸度和乙醇浓度的升高，氧气含量逐渐减少，大部分的微生物不能够耐受高酸度、高乙醇浓度、厌氧等不利条件而逐渐衰亡，而乳酸菌则成为绝对优势的细菌。乳酸菌细胞耐受环境胁迫(尤其是高浓度酒精)的能力极具开发前景。
随着人们生活水平的不断提高，人们饮酒的机会和饮酒量也越来越多。适量的饮酒有益于身体健康，但长期过量饮酒对人体健康可造成巨大的伤害，甚至对社会造成不良影响。同时人们健康饮酒的意识也越来越强，解酒产品应运而生，目前关于解酒药物的研究主要集中在传统中药的复方及初提物方面，对于能有效耐受并改善醉酒及酒精健康危害的益生菌的研究十分有限。
因此对具有优良酒精耐受能力的益生菌的研究对解酒保健产品的研制开发并进一步对人类身体健康具有重要意义。
通过检索，发现如下一篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
东方醋酸菌YZD-09及其应用(CN106635916A)，该东方醋酸菌(Acetobacterorientalis)YZD-09于2016年10月17日保藏，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC-NO.M-2016566，保藏地址为中国武汉大学，该东方醋酸菌分离自西藏灵菇。本发明还公开了一种果蔬酵素液的制备方法。本发明还公开了上述方法制备得到的果蔬发酵液或包含所述果蔬发酵液的果蔬饮品。本发明的东方醋酸菌YZD-09经过严格的实验筛选，证明其具有良好的酒精耐受能力，能够在较高温度下进行发酵活动，对广谱抗生素敏感，产酸能力强，是一株特殊生境来源的醋酸菌，将该菌株用于果蔬酵素的制备，经过酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三级发酵工艺，所得的酵素液风味更佳，并且具有更好的抗菌活性。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的名称为：LTJ12，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.20086，保藏日期：2020年6月15日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
而且，所述菌株分离自白酒酒醅，是酒醅中的优势菌株。
而且，所述菌株的菌落及菌体特征为：在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G+，菌体呈小短杆状。
而且，所述菌株分别进行4％、6％、8％、10％、12％(体积分数)酒精胁迫处理，其存活率依次为95.08％、73.72％、59.01％、40.51％、13.81％。
而且，所述植物乳杆菌在pH为3的条件下培养4h，存活率为15.87％，在含有0.3％胆盐的MRS培养基中培养4h存活率仍能达到53.38％，其细胞外基质黏附率为41.84％。
如上所述的一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌在解酒方面中的应用。
如上所述的一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌在功能性食品、药品方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)来源于传统的发酵食品白酒发酵过程中的酒醅，属于公认安全的可用于食品的菌种。本发明植物乳杆菌具有优良的酒精耐受能力，该菌株是白酒酒醅中的优势菌株，具有很强的酒精耐受能力。
2、本发明的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)经过4％、6％、8％、10％、12％(体积分数)酒精胁迫处理后，其存活率依次为95.08％、73.72％、59.01％、40.51％、13.81％，具有很强的酒精耐受能力。且其具有较强的耐酸、耐胆盐和黏附能力，可用于食品、医药等领域，如可用于开发相关功能性食品与药品(解酒产品)。
附图说明
图1为本发明中植物乳杆菌CGMCC No.20086的菌落形态和细胞形态图；
图2为本发明中植物乳杆菌CGMCC No.20086的16S rDNA系统发育树图；
图3为本发明中植物乳杆菌CGMCC No.20086在不同浓度酒精处理下的存活率。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的名称为：LTJ12，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.20086，保藏日期：2020年6月15日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
较优地，所述菌株分离自白酒酒醅，是酒醅中的优势菌株。
较优地，所述菌株的菌落及菌体特征为：在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G+，菌体呈小短杆状。
较优地，所述菌株分别进行4％、6％、8％、10％、12％(体积分数)酒精胁迫处理，其存活率依次为95.08％、73.72％、59.01％、40.51％、13.81％，具有很强的酒精耐受能力。
较优地，所述植物乳杆菌在pH为3的条件下培养4h，存活率为15.87％，在含有0.3％胆盐的MRS培养基中培养4h存活率仍能达到53.38％，其细胞外基质黏附率为41.84％。具有较强的耐酸、耐胆盐和细胞外基质黏附能力，具有很好的体内存活能力。
如上所述的一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌在解酒方面中的应用。
如上所述的一株具有优良酒精耐受能力的植物乳杆菌在功能性食品、药品方面中的应用。
具体地，以下实施例分别从菌株的分离鉴定、在不同浓度酒精处理下的耐受性以及耐酸、耐胆盐、黏附能力等特性来说明本发明的技术方案，具体内容如下。
实施例1乳酸菌的分离鉴定
以下实验均在无菌条件下操作。
1.菌株的富集
称取白酒酿酒过程中的酒醅25g，加入225mL无菌生理盐水混匀，将得到的菌液稀释103～105倍后取100μL涂布于MRS平板上，于37℃条件下倒置培养24h，观察菌落生长状况。
所述的MRS固体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，吐温80 1mL，磷酸氢二钾2g，酵母浸粉4g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌20min备用。
2.菌株的分离
挑取步骤1中得到的菌落，用革兰氏染色法进行镜检，观察菌体形态特征，选取革兰氏阳性菌作为目的菌株。
3.菌株的纯化
挑取步骤2中所得的菌落在MRS平板上进行划线，反复纯化直至无其他杂菌，记录不同菌落的状态。
4.菌株的鉴定
采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取乳酸菌菌株基因组，并以此为模板进行PCR扩增。将扩增成功的PCR产物测序后拼接得到DNA序列，使用NCBI的BLAST检索系统对序列同源性进行比对分析。选择与其相似性最高的已知菌株，对其相似性进行分析。使用MEGA5软件中的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)建立系统发育树。
对步骤3中获得的纯菌进行生理生化实验研究，发现该菌株具有很强的酒精耐受能力，该菌株在MRS培养基上培养24h，菌落呈白色，不透明，菌落突起，湿润，边缘平整，有光泽，菌落直径为0.8～1.0mm，光学显微镜下观察其细胞形态，革兰氏染色呈G+，菌体呈小短杆状(如图1所示)。
用BLAST软件经同源性比较，结果见图2，结合菌落形态特征、细胞形态特征和16SrDNA基因序列结果，确定为乳杆菌属中的一株新的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，该菌株已于2020年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.20086，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例2植物乳杆菌CGMCC No.20086在不同浓度酒精处理下的耐受性
选取对数生长末期的菌株，以2％的接种量加入不同含量(4％，6％，8％，10％，12％)酒精的MRS液体培养基中于37℃培养箱中进行酒精胁迫12h，同时以不含酒精的MRS培养基培养组作为阴性对照。胁迫后测定其OD600nm比较其生长状况。
所述的MRS液体培养基的制备方法为：蛋白胨10g，牛肉浸粉5g，吐温801mL，磷酸氢二钾2g，酵母浸粉4g，硫酸镁0.2g，柠檬酸三铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1L，pH 6.2±0.2，121℃灭菌20min备用。
对实施例1中获得的纯菌进行不同浓度酒精处理，随着酒精浓度的升高，植物乳杆菌CGMCC No.20086的耐受能力呈下降趋势，在4％、6％、8％、10％、12％(体积分数)酒精胁迫处理下，其存活率依次为95.08％、73.72％、59.01％、40.51％、13.81％，属于具有很高的耐酒精能力的菌株(如图3所示)。
实施例3植物乳杆菌CGMCC No.20086的特性测定
1.耐酸能力的测定
选取对数生长末期的菌株，以2％的接种量加入pH为3.0的液体MRS培养基中于37℃培养箱中培养4h，同时以常规pH值MRS培养基培养组作为阴性对照。胁迫后测定其OD600nm比较其生长状况。
2.耐胆盐能力的测定
选取对数生长末期的菌株，以2％的接种量加入含0.3％胆盐的液体MRS培养基中于37℃培养箱中培养4h，同时以常规MRS培养基培养组作为阴性对照。胁迫后测定其OD600nm比较其生长状况。
3.黏附能力的测定
将鼠尾胶原加入96孔板中，摇晃开盖过夜晾干。每孔加入100μL菌液，以不加菌液作为对照，37℃孵育1h。PBS洗去未黏附的菌，之后每孔加入10μL的MTT作用4h，然后终止培养。每孔加入100μL的二甲亚砜(DMSO)置于低速摇床上15min以使结晶物充分溶解。然后在酶联免疫检测仪中测量570nm波长处的PBS漂洗后的乳杆菌、未漂洗的乳杆菌及未加菌空白对照孔的吸光度(A)值，测定其黏附能力。
实施例1中获得的纯菌进行耐酸、耐胆盐、黏附能力的研究，发现该菌具有较强的耐酸、耐胆盐和黏附能力，在pH为3条件下培养4h存活率为15.87％，在含有0.3％胆盐的MRS培养基中培养4h存活率仍能达到53.38％，其细胞外基质黏附率为41.84％。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

Claims (1)

1. 一株具有酒精耐受能力的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，其特征在于：所述植物乳杆菌的名称为：LTJ12，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：CGMCC No.20086，保藏日期：2020年6月15日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
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