CN117050923B - 一株鼠李糖乳杆菌lr06及其在雪绒花发酵中的应用 - Google Patents
一株鼠李糖乳杆菌lr06及其在雪绒花发酵中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株鼠李糖乳杆菌LR06及其在雪绒花发酵中的应用，属于微生物发酵技术领域，该菌株于2023年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.27781；该菌株适宜发酵雪绒花，利用该菌株发酵雪绒花能够降低发酵过程中的pH值，维持适宜的发酵环境，从而促进菌体的新陈代谢，增加发酵产物中的活菌数量，且所获得的发酵产物具有较高的抗氧化活性，在生产化妆品、功能食品等抗氧化产品方面具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体是一株鼠李糖乳杆菌LR06及其在雪绒花发酵中的应用。
背景技术
雪绒花（Leontopodium japonicum）又名火绒草、薄雪草，为菊科火绒草属的多年生草本高山植物，原产西欧；雪绒花植株高度15-40cm，植株被白色或灰白色绒毛，是著名的高山花卉之一，其分布范围较广，在我国广泛分布于新疆东部、青海东部和北部、甘肃、陕西北部、山西、内蒙古南部和北部、河北、辽宁、吉林、黑龙江以及山东半岛。雪绒花除了具有观赏价值和药用价值外，如今也更多地应用于美容领域；雪绒花属寒性，其精华成分蕴含丰富的矿物质，能清热凉血，对肌肤具有舒缓、镇静及滋养保护的作用，是瑞士当地妇女的天然美容圣品；除此之外，随着各国对于雪绒花成分的研究和提炼，研究人员发现雪绒花对于皮肤同样具有很强的排毒、祛痘的作用。
益生菌在食品、饲料、医药、化妆品等领域中经常被用于微生物发酵生产，目前应用于食品的益生菌主要有乳杆菌（植物乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌等）和双歧杆菌（动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌和长双歧杆菌等）。近年来，随着微生物发酵技术的快速发展和化妆品现代化研究的深入，植物基质的微生物发酵和转化受到了人们的广泛关注，并成为生产化妆品的新途径。微生物发酵的发酵条件一般是在常温、常压的环境下，反应条件温和，因此可降低对植物活性成分的损失；另外，益生菌在新陈代谢中会产生纤维素酶、纤维二糖酶、蛋白酶、半乳糖酶、碳水化合物活性酶等，可以裂解植物的细胞壁，降低多糖等对植物活性成分的包裹作用，析出更多的生物碱、黄酮、糖苷、有机酸和萜类等有效成分，提高植物活性成分的含量和功效。
为了进一步开拓雪绒花在化妆品、食品等领域中的应用，本发明拟利用微生物发酵的方法研究雪绒花的更多发酵条件，筛选出一株适宜发酵雪绒花的菌株。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌LR06及其在雪绒花发酵中的应用，利用该菌株发酵雪绒花，可以维持发酵过程中适宜的pH环境，提高发酵产物中的活菌数量，且所获得的发酵产物具有较高的抗氧化活性。
本发明技术方案如下：
一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR06，2023年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27781。
所述鼠李糖乳杆菌LR06的菌液的培养方法，包括如下步骤：
挑取鼠李糖乳杆菌LR06菌株置于MRS培养基，25~42℃温度条件下静置培养12~18h，得鼠李糖乳杆菌LR06的菌液。
优选的，所述温度条件为37℃。
优选的，所述MRS培养基包括如下组分：胰蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.25g/L，吐温-80 0.1%（v/v），115℃灭菌。
所述鼠李糖乳杆菌LR06在雪绒花发酵中的应用。
优选的，应用方法是将鼠李糖乳杆菌LR06菌液按照雪绒花培养基体积2~4%的接种量接种至雪绒花培养基中，25~42℃静置培养72~96 h。
优选的，应用方法是将鼠李糖乳杆菌LR06菌液按照雪绒花培养基体积2~4%的接种量接种至雪绒花培养基中，37℃静置培养72 h。
优选的，所述雪绒花培养基包括如下组分：雪绒花10~30g/L，白糖40~80g/L，115℃灭菌。
优选的，所述雪绒花培养基包括如下组分：雪绒花20g/L，白糖60g/L，115℃灭菌。
优选的，所述雪绒花为晒干后磨成的粉末。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌LR06及其在雪绒花发酵中的应用，利用该菌株发酵雪绒花能够降低发酵过程中的pH值，维持适宜的发酵环境，从而促进菌体的新陈代谢，提高发酵产物中的活菌数量，且所获得的发酵产物具有较高的抗氧化活性，在生产化妆品、功能食品等抗氧化产品方面具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为发酵过程中发酵液pH的变化；
图2为发酵结束后的发酵液活菌数计数结果；
图3为发酵结束后对发酵液抗氧化能力的测定结果；
图4为不同糖添加量对发酵液pH值的影响；
图5为不同糖添加量对发酵液活菌数的影响；
图6为不同糖添加量对发酵液抗氧化能力的影响；
图7为不同雪绒花添加量对发酵液pH值的影响；
图8为不同雪绒花添加量对发酵液活菌数的影响；
图9为不同雪绒花添加量对发酵液抗氧化能力的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例进行说明：
实验材料来源：
植物乳杆菌WCFS1：购自北京科瑞思搏生物科技有限公司；
干酪乳杆菌BL23：购自北京科瑞思搏生物科技有限公司；
鼠李糖乳杆菌GG：购自上海瑞楚生物科技有限公司。
实施例1
鼠李糖乳杆菌LR06的分离、筛选和鉴定：
（1）将中国山东省烟台地区的葡萄（紫大夫品种）使用无菌水震荡，然后将震荡后的液体涂布在MRS固体培养基上，倒置培养基37℃培养24 h，挑取培养基上生长出的白色圆形菌落，进一步通过筛选获得过氧化氢酶阴性，镜检为短杆菌的菌落（按照乳酸菌的特性进行筛选）；反复划线确定纯菌落，将纯菌落接种到MRS固体培养基，最终得到一株单菌株，将其命名为“LR06”，观察LR06菌落个体形态及进行生化反应测定；
其中，所述MRS固体培养基的组分如下：胰蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.25g/L，吐温-80 0.1%（v/v），琼脂15 g/L ，115℃灭菌30min。
（2）对筛选获得的菌株LR06进行16S rDNA基因测序，并通过NCBI Blast程序将测序结果与NCBI数据库中的基因数据进行比对，鉴定得菌株LR06为鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）。
鼠李糖乳杆菌LR06菌落形态较小且大小均一，边缘整齐；为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，无芽孢，不运动；细胞呈短杆状，常3-5个成链；其具体生理生化特征如下表1所示：
表1. 鼠李糖乳杆菌LR06的生理生化特征
鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR06，于2023年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27781。
实施例2
鼠李糖乳杆菌LR06菌液的培养，具体方法如下：
挑取实施例1所述的鼠李糖乳杆菌LR06菌株置于100 mL的MRS培养基中，于37℃条件下静置培养12 h，得鼠李糖乳杆菌LR06菌液；此时菌液中的菌体密度OD600为9.85，pH值为4.21；
其中，所述MRS培养基组分如下：胰蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.25g/L，吐温-80 0.1%（v/v），115℃灭菌30 min。
实施例3
一、鼠李糖乳杆菌LR06在雪绒花发酵中的应用：
具体方法如下：
将实施例2中的鼠李糖乳杆菌LR06菌液以3mL的接种量接种至100mL雪绒花培养基中，37℃静置培养72 h，得发酵液；此时发酵液中的活菌数为1.2×1010CFU/mL，pH值为3.18；
其中，所述雪绒花培养基的组分如下：雪绒花20g/L，白糖60g/L，自然pH值，115℃灭菌30 min；雪绒花为晒干后磨成的粉末。
二、验证不同乳酸菌对雪绒花的发酵作用：
将按照实施例2的方法活化好的植物乳杆菌WCFS1、干酪乳杆菌BL23、鼠李糖乳杆菌GG和鼠李糖乳杆菌LR06菌株分别转接至发酵瓶内，每个发酵瓶内含有已灭菌的雪绒花2g、白糖2 g以及100 mL纯净水，其中雪绒花为晒干后磨成的粉末；
菌株转接完成后，将发酵瓶放置于37℃恒温培养箱内培养96 h，发酵过程中对发酵液取样测定其中的活菌数、pH值和抗氧化能力；
其中，抗氧化能力的检测采用DPPH法测定，具体方法如下：
（1）称取0.00197g的1.1-二苯基-2-苦肼粉末溶于含有50mL无水乙醇的棕色离心管内，置于冰上避光保存，得DPPH醇溶液；
（2）取0.3mg的L-抗坏血酸溶于含有3mL纯净水的棕色离心管内，置于冰上避光保存，得Vc溶液；
（3）在无菌条件下，使用移液枪准确量取5mL发酵液置于10mL白色离心管内，10000 r/min离心5min，离心后取3mL的上清液于新的10mL白色离心管中，置于冰上保存，得样品溶液；
（4）分别配制以下组分：
样品组：样品溶液1 mL+ DPPH醇溶液3 mL；
空白组：样品溶液1 mL +无水乙醇3 mL；
对照组：Vc溶液1 mL+ DPPH醇溶液3 mL；
将以上各组分分别混合后静置反应30 min，得反应液；然后将反应液10000 r/min离心5 min，离心完成后将各组分分别放在试管架上，过程中注意轻拿轻放；
（5）检测并计算DPPH清除率
全波长扫描分光仪器的使用：使用前预热30 min，波长设置为517 nm；在玻璃皿内加入蒸馏水后，进行空白校正；把玻璃皿取出，加入待测量的样品，检测样品在517 nm处的吸光度，取平均值，计算每个发酵液样品的DPPH自由基的清除率，并绘制折线图；
其中，清除率 =（1-（As-Ab）/Ac）*100%；
其中，As为样品组的吸光度平均值，Ab为空白组的吸光度平均值，Ac为对照组的吸光度平均值。
检测结果分别如图1~3所示：
图1为发酵过程中发酵液pH的变化，可以看出，在整个发酵过程中，发酵菌株为鼠李糖乳杆菌LR06的发酵液pH值从5.1下降至4.0，下降幅度明显大于其它三个菌种；
由于乳酸是乳酸菌的重要代谢产物，能够引起pH的下降，因此pH下降的越快说明菌株的生长状况越好；另外，较低的pH值能够维持适宜的乳酸菌发酵环境，使得乳酸菌菌体中的有效成分更好地溶出，从而促进菌体的新陈代谢。
图2为发酵结束后的发酵液活菌计数结果，可以看出，发酵菌株为鼠李糖乳杆菌LR06的发酵液活菌数为2.7×108CFU/mL，远大于其它三个菌种；
活菌数一般作为出厂指标来衡量发酵产物的品质，活菌数越高，代表发酵进行的越彻底，发酵产物的品质越好。
图3为发酵结束后对发酵液抗氧化能力的测定结果，可以看出，发酵菌株为鼠李糖乳杆菌LR06的发酵液DPPH自由基清除率为98.9%，抗氧化能力最强。
综上，利用鼠李糖乳杆菌LR06发酵雪绒花能够显著降低发酵过程中的pH值，维持适宜的发酵环境，从而促进菌体的新陈代谢，提高发酵液中的活菌数量，且所获得的发酵液具有较高的抗氧化活性，能够广泛地应用于化妆品、功能性食品等领域。
实施例4
发酵条件的筛选：
一、验证不同糖添加量对发酵过程的影响：
将实施例2中的鼠李糖乳酸菌LR06菌液3mL转接至发酵瓶内，每个发酵瓶内含有已灭菌的雪绒花2 g以及100 mL纯净水，另外分别添加1 g、2 g、4 g、6 g、8 g和10 g的白糖；
菌株转接完成后，将发酵瓶放置于37℃恒温培养箱内培养72 h，得发酵液；取样测定发酵液中的活菌数、pH值和抗氧化能力，测定结果分别如图4~6所示：
图4为不同糖添加量对发酵液pH值的影响，可以看出，糖添加量为6 g时发酵液的pH值（3.21）最低；
图5为不同糖添加量对发酵液活菌数的影响，可以看出，糖添加量为6 g时发酵液中的活菌数最高，为1.1×1010CFU/mL；
图6为不同糖添加量对发酵液抗氧化能力的影响，可以看出，糖添加量为6 g时发酵液的抗氧化活性最强，DPPH自由基清除率为98.2%。
二、验证不同雪绒花添加量对发酵过程的影响：
将实施例2中的鼠李糖乳酸菌LR06菌液3mL转接至发酵瓶内，每个发酵瓶内含有已灭菌的白糖6 g以及100 mL纯净水，另外分别添加0.5 g、1 g、2 g、3 g、4 g和5 g的雪绒花；
菌株转接完成后，将发酵瓶放置于37℃恒温培养箱内培养72 h，得发酵液；取样测定发酵液中的活菌数、pH值和抗氧化能力，测定结果分别如图7~9所示：
图7为不同雪绒花添加量对发酵液pH值的影响，可以看出，雪绒花添加量为2 g时发酵液的pH值（3.18）最低；
图8为不同雪绒花添加量对发酵液活菌数的影响，可以看出，雪绒花添加量为2 g时发酵液中的活菌数最高，为1.2×1010CFU/mL；
图9为不同雪绒花添加量对发酵液抗氧化能力的影响，可以看出，雪绒花添加量为2 g时发酵液的抗氧化活性最强，DPPH自由基清除率为98.3%。
综上，本发明提供了一株鼠李糖乳杆菌LR06，该菌株适宜于发酵雪绒花，其发酵雪绒花的最适条件为雪绒花20g/L，白糖60g/L，利用该菌株获得的雪绒花发酵产物具有较高的品质以及较高的抗氧化活性。
Claims (10)
1. 一株鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）LR06，其特征在于，2023年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.27781。
2. 权利要求1所述鼠李糖乳杆菌LR06的菌液的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：挑取鼠李糖乳杆菌LR06菌株置于MRS培养基，25~42℃温度条件下静置培养12~18 h，得鼠李糖乳杆菌LR06的菌液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述温度条件为37℃。
4. 如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述MRS培养基包括如下组分：胰蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖20.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L，乙酸钠3.12g/L，磷酸氢二钠1.63g/L，乙酸钾2.25g/L，吐温-800.1%（v/v），115℃灭菌。
5.权利要求1所述鼠李糖乳杆菌LR06的应用，其特征在于，应用于雪绒花发酵。
6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，应用方法是将鼠李糖乳杆菌LR06菌液按照雪绒花培养基体积2~4%的接种量接种至雪绒花培养基中，25~42℃静置培养72~96 h。
7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，应用方法是将鼠李糖乳杆菌LR06菌液按照雪绒花培养基体积2~4%的接种量接种至雪绒花培养基中，37℃静置培养72 h。
8. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述雪绒花培养基包括如下组分：雪绒花10~30g/L，白糖40~80 g/L，115℃灭菌。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述雪绒花培养基包括如下组分：雪绒花20g/L，白糖60g/L，115℃灭菌。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述雪绒花为晒干后磨成的粉末。
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