CN113832083B - 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用，菌株的名称为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)QH‑20003，其保藏编号为：CGMCC No.21613，保藏日期2021年1月13日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明贝莱斯芽孢杆菌应用在窖醋酿造，能在酸性条件下生长代谢并产酶，具有产高活性耐酸性颗粒淀粉酶、普鲁兰酶和蛋白酶的能力，将其运用于窖醋酿造中，能够提高原料利用率，为食醋酿造行业提供了新的酶源及有益微生物发酵菌株，从而提升食醋产品质量，改善食醋风味。

Description

一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用。
背景技术
醋是一种使用含淀粉、糖的原料经微生物发酵而成的酸性调味品，其中包含多种有机酸、氨基酸、肽、多酚、和黄酮类物质，赋予了食醋促消化、降血压、降血脂、软化血管、减肥、抗氧化等功能。
发酵原醋经陈酿后熟可得到口感滋味协调的成品原醋。现有工艺为了增加食醋的色香味，促进食醋陈化，促进食醋中酸、醇、醛、酯、酚、酮类物质进一步发生物理化学反应并相互融合，使食醋的香气、色泽等方面更加协调，品质大幅提升，皆需经过较长的时间(3-12个月)陈酿，使生产周期加长，生产成本攀升。
其中专利CN201410717751.5公开了“一种窖醋酿造工艺”，在醋酸发酵完成后，进一步应用窖泥池对发酵成熟醋醅进行了进一步的窖泥池二次发酵，能够促进醋醅中物质发生反应，生成香味物质，极大提升食醋口感，达到长时间陈酿的效果。
但是要使二次发酵得到的产物足够丰富，得保证醋酸发酵结束后的醋醅中的产物足够丰富。而目前食醋行业面临原料利用率不高的问题，因此，需要提高原料利用率，使原料中蛋白质、淀粉、纤维素类、脂肪类物质进一步水解成小分子物质，从而参与到酶促反应来。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本发明为了克服现有技术的缺陷，提供了一种新的贝莱斯芽孢杆菌及其在窖醋酿造中的应用，为食醋酿造行业提供了新的酶源及有益微生物发酵菌株，能在酸性条件下生长代谢并产酶，具有产高活性耐酸性颗粒淀粉酶、普鲁兰酶和蛋白酶的能力，将其运用于窖醋酿造中，能够提高原料利用率，从而提升食醋产品质量，改善食醋风味。
本发明通过下述技术方案实现：
一种贝莱斯芽孢杆菌，菌株的名称为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)QH-20003，其保藏编号为：CGMCC No.21613，保藏日期2021年1月13日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明贝莱斯芽孢杆菌QH-20003具有产淀粉酶、颗粒淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶的能力。
本发明贝莱斯芽孢杆菌QH-20003具有产乙偶姻的能力。
本发明还提供一种由贝莱斯芽孢杆菌QH-20003经发酵培养获得的发酵液。
发酵液的制备方法如下：1)斜面培养：将贝莱斯芽孢杆菌QH-20009接种至斜面培养基，在35℃培养24h，培养获得斜面菌体；2)一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至一级种子培养基，培养，获得一级种子液；3)二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中培养，获得二级种子液；4)发酵培养：米粉和高温α-淀粉酶加水搅拌加热得到醪液，然后加入糖化酶、蛋白胨5-15g/L和酵母粉2-10g/L，灭菌后冷却后，按照2～10％的接种量接入步骤3)的二级种子液，发酵，即得发酵液。
本发明还提供一种贝莱斯芽孢杆菌QH-20003在食品领域中的应用，具体的，所述应用为在食醋酿造中的应用，更进一步为窖醋的酿造。
其具体的应用方法为，将贝莱斯芽孢杆菌QH-20003经发酵培养获得的发酵液按2～10％的接种量加入醋醅中进行发酵，优选的贝莱斯芽孢杆菌QH-20003发酵液接种量为6％。
本发明的贝莱斯芽孢杆菌QH-20003具有如下优良性能：
(1)从醋醅中分离获得，能在酸性条件(pH 3.8-6.0)下生长；
(2)具有产颗粒淀粉酶、蛋白酶和普鲁兰酶的能力；
(3)具有产乙偶姻的功能；
(4)应用于食醋发酵体系，不会影响食醋的正常发酵；
(5)应用于强化食醋发酵，不仅可提高淀粉利用率而且可以提升食醋的风味和品质。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明实施例提供的一种贝莱斯芽孢杆菌，能够同时产淀粉酶、普鲁兰酶和蛋白酶的菌株--贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)QH-20003，该菌株可在酸性条件下生长代谢并高产淀粉酶、普鲁兰酶、蛋白酶，同时该菌株还具有高产乙偶姻功能，应用于食品领域，可提高原料的淀粉利用率和蛋白利用率；
2、本发明实施例提供的一种贝莱斯芽孢杆菌发酵液，利用贝莱斯芽孢杆菌QH-20003经发酵培养获得发酵液做为生物酶催化剂，能够催化水解食醋酿造中淀粉和蛋白质水解为还原糖和氨基酸；
3、本发明实施例提供的一种贝莱斯芽孢杆菌在窖醋酿造中的应用，该菌株及其发酵液应用于窖醋酿造中能够显著提高淀粉利用率，提高不挥发酸含量，同时可在一定程度上提升窖醋的总氨基酸含量，添加贝莱斯芽孢杆菌组窖醋淀粉利用率较对照组提高了15.21％，不挥发酸含量提高了9.32％，总氨基酸含量提高了21.04％。
附图说明
为了更清楚地说明本发明示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的菌株QH-20003的菌落形态；
图2为本发明实施例提供的菌株QH-20003的选育流程图；
图3为本发明实施例提供的菌株QH-20003基于16S rDNA的进化树分析；
图4为本发明实施例提供的不同pH对本发明菌株QH-20003所产颗粒淀粉酶酶活的影响；
图5为本发明实施例提供的不同pH对本发明菌株QH-20003所产普鲁兰酶酶活的影响；
图6为本发明实施例提供的醋酸发酵阶段醅酸及卤汁总酸随发酵周期的变化情况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
在以下描述中，为了提供对本发明的透彻理解阐述了大量特定细节。然而，对于本领域普通技术人员显而易见的是：不必采用这些特定细节来实行本本发明。在其他实施例中，为了避免混淆本本发明，未具体描述公知的结构、电路、材料或方法。
在整个说明书中，对“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”的提及意味着：结合该实施例或示例描述的特定特征、结构或特性被包含在本本发明至少一个实施例中。因此，在整个说明书的各个地方出现的短语“一个实施例”、“实施例”、“一个示例”或“示例”不一定都指同一实施例或示例。此外，可以以任何适当的组合和、或子组合将特定的特征、结构或特性组合在一个或多个实施例或示例中。此外，本领域普通技术人员应当理解，在此提供的示图都是为了说明的目的，并且示图不一定是按比例绘制的。这里使用的术语“和/或”包括一个或多个相关列出的项目的任何和所有组合。
在本发明的描述中，术语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”、“下”、“竖直”、“水平”、“高”、“低”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)QH-20003的选育流程
1、初筛
本发明从自然发酵状态的醋醅发酵池中，分别选取发酵第2、4、6、8、10、12、14、6、18、20、22、24天的醋醅，取样方式为发酵池四周从醋醅表面到底部垂直取样，然后将不同发酵周期醋醅样品均匀混合得到菌株筛选样本。
筛选的具体方法：称取100g土样置于1000mL 0.85％的生理盐水中，摇晃后静置，取上清液至富集培养基中，于30℃，150r/min振荡培养2-3天。取10mL富集液加入100mL新鲜富集培养基中，如此重复3次后进行分离纯化。
选用筛选培养基对菌株进行初筛，将富集完成的菌液进行梯度稀释后，涂布于固体筛选培养基平板上，35℃培养48h后，挑选具有明显水解透明圈生成的菌落进行进一步的复筛。所用筛选培养基为：可溶性淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na2HPO4 0.5g/L，K2HPO40.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水。
2、复筛
复筛分为颗粒淀粉酶产生菌复筛和普鲁兰酶产生菌复筛。
颗粒淀粉酶产生菌复筛：挑取初筛时候具有明显透明水解圈的单菌落点种到颗粒淀粉复筛培养基上，35℃培养48h后，观察单菌落周围水解透明圈生成情况，选取水解透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步在颗粒淀粉复筛培养基上进行分离纯化，得到纯种颗粒淀粉酶产生菌单菌落。颗粒淀粉复筛培养基为：生玉米淀粉20g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，Na2HPO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，其中生玉米淀粉单独称取到称量瓶中，107℃烘箱干热灭菌2h后，在使用前加入到灭菌后的培养基中，混匀后倾倒平板。
普鲁兰酶产生菌复筛：挑取初筛时具有明显水解透明圈的单菌落点种到普鲁兰糖复筛培养基上，35℃培养48h后，加入5mL无水乙醇于培养基表面，于4℃冰箱放置2h，取出观察菌落周围透明圈生成情况，挑选透明圈直径与单菌落直径比较大的菌落，进一步进行分离纯化，得到纯种普鲁兰酶产生菌。
3、菌株产酶活性测定
将步骤2筛选出的菌株接种到斜面培养基，30℃培养48h后，于4℃冰箱保存。所述斜面培养基为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。将保存于斜面上的菌株接种至种子培养基中，在30℃培养24h。将种子液以体积浓度1％的接种量接种至发酵培养基中，30℃，150rpm振荡培养60h，在12000g下离心5min，分离发酵液与湿菌体，取发酵液作为酶液进行相应酶活的测定，测定所得酶活较高的菌株进行进一步的研究。
淀粉酶酶活测定：以可溶性淀粉为底物，醋酸-醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5.8)作为溶剂溶解底物，配制30g/L的底物溶液。取5mL底物溶液与试管内，在40℃下保温5min，加入同样于此温度下保温5min的酶液30μL，200rpm反应30min，用200μL 200mM NaOH终止反应，再200rpm反应5min，得反应液。对照反应为：底物溶液于在40℃下保温5min，200rpm反应30min，用200μL 200mM NaOH终止反应，加入同样于40℃下保温5min的酶液30μL，再200rpm反应5min。用DNS法测定反应液与对照反应液中的葡萄糖生成量，计算淀粉酶酶活。
颗粒淀粉酶酶活的测定：以生玉米淀粉作为底物，醋酸-醋酸钠缓冲液(50mM，pH5.8)作为溶剂溶解底物，配制30g/L的底物溶液。取5mL底物溶液与试管内，在40℃下保温5min，加入同样于此温度下保温5min的酶液30μL，200rpm反应30min，用200μL 200mM NaOH终止反应，再200rpm反应5min，得反应液。对照反应为：底物溶液于在40℃下保温5min，200rpm反应30min，用200μL 200mM NaOH终止反应，加入同样于40℃下保温5min的酶液30μL，再200rpm反应5min。用DNS法测定反应液与对照反应液中的葡萄糖生成量，计算颗粒淀粉酶酶活。
普鲁兰酶酶活测定为：以普鲁兰糖作为底物，醋酸-醋酸钠缓冲液(50mM，pH 5.8)作为溶剂溶解底物，配制30g/L的底物溶液。取5mL底物溶液与试管内，在40℃下保温5min，加入同样于此温度下保温5min的酶液30μL，200rpm反应30min，用200μL 200mM NaOH终止反应，再200rpm反应5min，得反应液。对照反应为：底物溶液于在40℃下保温5min，200rpm反应30min，用200μL 200mM NaOH终止反应，加入同样于40℃下保温5min的酶液30μL，再200rpm反应5min。用DNS法测定反应液与对照反应液中的葡萄糖生成量，计算普鲁兰酶的酶活。
所述DNS法为：利用不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液与DNS试剂进行反应，反应为2mL DNS试剂加2mL酶促反应液，沸水浴5min后，加入蒸馏水定容到25mL，混匀后，以对照组DNS反应作为空白，酶促反应DNS反应液在λ＝520nm下测定吸光度，根据吸光度计算酶活。
所述淀粉酶酶活定义为：在40℃条件下，以可溶性淀粉为底物，以醋酸-醋酸钠(50mM，pH 5.8)为缓冲液，每1min释放1μg还原糖(葡萄糖计)所需酶量为一个酶活力单位，记为1U。
所述颗粒淀粉酶酶活定义为：在40℃条件下，以玉米生淀粉为底物，以醋酸-醋酸钠(50mM，pH 5.8)为缓冲液，每1min释放1μg还原糖(葡萄糖计)所需酶量为一个酶活力单位，记为1U。
所述普鲁兰酶酶活定义为：在40℃条件下，以普鲁兰糖为底物，以醋酸-醋酸钠(50mM，pH 5.8)为缓冲液，每1min释放1μg还原糖(葡萄糖计)所需酶量为一个酶活力单位，记为1U。
pH对酶活的影响测定方法为：使相同浓度底物溶液溶解于不同pH的缓冲溶液中(50mM)，测定并计算酶活。所述底物为可溶性淀粉(2％)、玉米生淀粉(2％)、普鲁兰糖(2％)。所述缓冲液为不同pH条件下的NaH2PO4-Na2HPO4(50mM)缓冲液或醋酸-醋酸钠(50mM，pH 5.8)缓冲液。
蛋白酶酶活测定：以酪蛋白为底物(20g/L)，以NaH2PO4-Na2HPO4(50mM，pH 7.2)为缓冲液的条件下测定中性蛋白酶酶活，乳酸-乳酸钠(50mM，pH 3.8)缓冲液条件下测定酸性蛋白酶酶活。2mL酶液在40℃条件下预热5min，加入2mL底物溶液，保温反应10min，加入4mL三氯乙酸(0.4M)溶液，继续保温20min后，得反应液。对照反应为酶液预热后，4mL三氯乙酸(0.4M)溶液保温10min后，再加2mL底物溶液，继续保温20min后得对照反应液。用福林-酚法测定并计算酶活。
所述中性蛋白酶酶活定义为：在40℃条件下，以酪蛋白为底物，NaH2PO4-Na2HPO4
(50mM，pH 7.2)缓冲液体系中，每1min释放1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位，及为1U。
所述酸性蛋白酶酶活定义为：在40℃条件下，以酪蛋白为底物，乳酸-乳酸钠(50mM，pH 3.8)缓冲液体系中，每1min释放1μg酪氨酸所需酶量为一个酶活力单位，及为1U。
表1贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)QH-20003酶活力测定
Figure BDA0003360201270000061
实施例2
菌株QH-20003鉴定
1、形态学鉴定：
将实施例1筛选得到的菌株QH-20003接种在固体培养基上，37℃培养24小时后形成不规则形状，质地软，中间凸起，内含黏液，边缘不整齐，有光泽的乳白色菌落，直径2-3mm(图1)。革兰氏染色观察：粉红色短杆状，无芽孢。
固体培养基组成：氯化钠10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，琼脂20g/L，溶剂为去离子水。
2、生理生化鉴定：
利用Biolog(GENⅢ)自动微生物鉴定系统对菌株QH-20003进行了94种表型测试，包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测：将菌株QH-20003接种于BUG平板培养基(BIOLOG UNIVERSAL GROWTH AGAR)，33℃恒温培养2天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(IF-A)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至91％T/IF-A。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在BiologGENⅢ微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在33℃培养箱中，分别在培养12h、24h、36h、48h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。Biolog系统给出48h鉴定结果如表2和表3所示。
表2.菌株QH-20003对BiologGENⅢ板上71种碳源的利用能力
Figure BDA0003360201270000071
Figure BDA0003360201270000081
表3.菌株QH-20003对BiologGENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性
Figure BDA0003360201270000082
3、分子生物学鉴定：
以菌株QH-20003的总DNA为模板，利用引物P1:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和P2:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'扩增菌株的16S rDNA基因，委托上海生工对该菌16SrDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1所示)后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rDNA基因序列，并进行同源性比对，进行生物进化分析(图3)。菌株QH-20003与Bacillus velezensis菌株同源性最高，根据微生物遗传学鉴定原则，基于16S rDNA同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。因此，菌株QH-20003为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，拟命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)QH-20003，保藏于中国微生物菌株管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No：21613，保藏日期2021年1月13日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
实施例3
发酵液及种子液的制备
1、斜面培养：
将贝莱斯芽孢杆菌QH-20003接种至斜面培养基，在35℃培养48h，获得斜面菌体；所述斜面培养基终浓度为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。
2、种子培养
分为一级种子培养和二级种子培养。
一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至种子培养基，在35℃培养24h，获得一级种子液；所述一级种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0；对照组为相同操作单不接种QH-20003的培养基。
二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1～10％的接种量接种至二级种子培养基中，在35℃培养24-48h，获得二级种子液，优选接种量为5％；所述二级种子培养基终浓度组成为：优选二级种子培养基终浓度为：生玉米淀粉20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，Na2HPO4 0.5g/L，K2HPO4 0.5g/L，MgSO4 0.1g/L，琼脂为20.0g/L，溶剂为去离子水，pH值为6.0。对照组为相同组分且为接种QH-20003的培养基。
3、发酵培养
选用液态发酵罐，加水搅拌，同时加入米粉和高温α-淀粉酶，高温α-淀粉酶用量为米粉质量的0.05％，并搅拌加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加入糖化酶并保温约20min左右，糖化酶用量为米粉质量的0.1％，加入蛋白胨1g/L和酵母粉0.5g/L，灭菌后冷却至33-37℃，按照5％的接种量接入上述二级种子液，通气搅拌，33～40℃保压发酵20-52h。发酵完成后，所得发酵液即为酶液，所得菌液也作为接入醋醅发酵的种子液。对照组为相同处理但未接种QH-20003的糖醪液。
实施例4
不同pH对贝莱斯芽孢杆菌QH-20003生长的影响
配制LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用乳酸调节不同pH，于35℃，200rpm培养一定时间，培养基编浑浊，则菌株能在此pH条件下生长。结果如表4所示。其中，pH 5.5和pH 4.8条件下，菌株接种后约8-12h长出，在pH 4.4和pH 4.0条件下，菌株16-24h长出，在pH 3.8条件下，菌株24h长出，在pH 3.5条件下，菌株在24-36h左右长出。
表4产酶菌株在不同pH条件下的生长情况
Figure BDA0003360201270000091
实施例5
不同pH对贝莱斯芽孢杆菌QH-20003产酶活性的影响
配制磷酸缓冲液NaH2PO4-Na2HPO4(50mM，pH 5.8-8.0)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.5-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为可溶性淀粉，配制底物浓度为30g/L，以实施例3中发酵培养所得上清液做为酶液，于40℃反应条件下测定不同pH反应体系中的颗粒淀粉酶酶活。所得结果如图3所示。
配制磷酸缓冲液NaH2PO4-Na2HPO4(50mM，pH 5.8-8.0)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.5-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为生玉米淀粉，配制底物浓度为30g/L，以实施例3中发酵培养所得上清液做为酶液，于40℃反应条件下测定不同pH反应体系中的颗粒淀粉酶酶活。所得结果如图3所示。
配制磷酸缓冲液NaH2PO4-Na2HPO4(50mM，pH 5.8-7.2)、醋酸-醋酸钠(50mM，pH3.5-5.8)，以不同pH的缓冲液配制底物溶液，底物为普鲁兰多糖，配制底物浓度为30g/L，以实施例3中发酵培养所得上清液做为酶液，于40℃反应条件下测定不同pH反应体系中的普鲁兰酶酶活。所得结果如图4所示。
实施例6
贝莱斯芽孢杆菌QH-20003产乙偶姻功能验证
斜面培养如实施例3所示，得到斜面种子。挑取斜面菌落接种到发酵培养基，37℃培养36h。所述发酵培养基组成为：葡萄糖10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，KH2PO4 5.0g/L，溶剂为去离子水，pH为7.0，121℃灭菌20min。
取发酵所得菌液，混和均匀，取1mL至1.5mL EP管中，8000r/min离心10min，取0.7mL上清液，加入0.1mL显色剂，震荡1～2min混匀，于37℃下反应60min，观察颜色变化，变红则为阳性。将反应之后的混合液在520nm处测定吸光度，以接菌但未加显色剂组做空白。所述显色剂组成为：0.3g肌酸，0.5g蛋白胨，再加入5％α-萘酚(正丙醇溶剂配制)，40％NaOH定容到100mL。
乙偶姻标准曲线制备：精确配制乙偶姻浓度梯度溶液，浓度梯度为：10-100mg/L，测定吸光度，以吸光度值为纵坐标，乙偶姻浓度值为横坐标，绘制标准曲线为：y＝0.0092x-0.0303，(R2＝0.9991)，通过测定此贝莱斯芽孢杆菌QH-20003在所述发酵培养基中培养36h后测得发酵液中乙偶姻含量为52.47mg/L。
实施例7
贝莱斯芽孢杆菌QH-20003在窖醋酿造中的应用
1、醋窖泥制备
现有窖泥池底部及侧面窖泥取出，取窖泥位置应遍布整个窖泥池，共取出约100kg左右，加入二醋10kg，窖泥池发酵的鲜醋醅20kg，麸皮浸出液25kg，混合均匀，在表面接入20kg贝莱斯芽孢杆菌QH-20003发酵液，于30-35℃堆积培养5d，获得醋窖泥。成熟醋窖泥平铺涂敷在醋窖泥池的底部及侧面，涂敷厚度为10cm。对照组1中使用醋窖泥为窖泥池本身存在的醋窖泥。
2、酒醪液制备
称取大米250kg，高粱50kg，磨浆制粉，边搅拌边加水900kg，加入α-淀粉酶1kg，加热到90-95℃，匀速搅拌约30min左右得到醪液，将醪液降温至45-55℃，缓慢搅拌条件下加乳酸调醪液pH 4.7后加入2kg糖化酶并保温约20min左右，冷却至33-37℃，接入活性干酵母5kg，静置常温培养12-16h，即得酵母活化醪液。
3、菌株扩大培养
按实施例3中发酵液及种子液制备方式制得发酵菌液。
4、醋醅接种发酵
对照组：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，接入1中制备的酒醪液8300kg(其中酒醪液温度约为33℃)，同时接入实施例2中制备的对照糖醪液，用量为醋醅物料总量的0.8％，待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。
实验组：发酵池内部从下而上铺谷壳540kg，加入麸皮4600kg，大曲200kg，麸曲250kg，将实施例3中制备的发酵液接入1中制备的酒醪液中，混合均匀，成为含芽孢杆菌的酒醪液，将含芽孢杆菌的糖醪液接入发酵池(其中混合酒醪液温度约为33℃)，接种量为醋醅物料总量的0.8％。待酒醪液浸入新醅后，在新醅表面接种100kg发酵至第9-11天的鲜醋醅，均匀铺散于新醅表面，进行人工翻醅。发酵周期前3天每天翻醅，之后隔天翻醅。翻醅完成后进行自然发酵。发酵过程取醋醅及卤汁测定相关理化指标。
5、醋窖泥池二次发酵
步骤4所得发酵醋醅转入醋窖泥池，压实，进一步用成熟醋窖泥密封，继续保持密封发酵25天，获得成熟窖醋醋醅。其中，实验组1醋醅转入新制备含枯草芽孢杆菌亚种的窖泥池，用相应制备的醋窖泥密封，而对照组1醋醅转入原本窖泥池，并使用原本醋窖泥密封。获得成熟窖醋后，淋醋。
6、淋醋
淋醋采用套淋方式得醋。将发酵池醋醅及卤汁全部铲入淋醋池，用上一轮的一醋进行浇淋，浸泡2h后取醋，所得为头醋，即原醋，放入存储罐。再用上一轮二醋进行浇淋，浸泡2h后得一醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋头醋。接着用自来水浸泡醋醅2h，所得为二醋，放入中转罐，用于下一轮浇淋一醋。
7、沉降灭菌灌装
所得头醋经管道的高温瞬时灭菌后，于储存罐进行沉降，沉降后抽取上层醋液经板框压滤后进入精制灌装流程，最终得到成品醋。
8、总酸及不挥发酸含量监测
从发酵第一天开始至醋酸发酵结束，隔天取醋醅及池底卤汁进行检测。总酸以乙酸计，采用酸碱滴定法测定。醋酸发酵阶段，醋醅总酸及池底卤汁总酸随发酵周期的变化情况如图6所示，随发酵进行，总醅酸及卤汁酸度不断上升，发酵过程中，对照组的醅酸及卤汁酸度皆低于实验组。发酵结束后，对照组的总醅酸含量为5.37g/100g(湿醅)，实验组的总醅酸含量为5.98g/100g(湿醅)。对照组的窖泥池底滤出液总酸含量为7.19g/100mL，实验组的窖泥池底滤出液总酸含量为7.76g/100mL。
在进行窖泥池二次发酵后，取出醋醅入淋醋池，进行淋醋，同时使用4.0g/100mL的一醋进行淋醋，得到头醋，测定所得头醋总酸及氨氮含量如表5所示，采用蒸馏方式除去挥发酸后，用酸碱滴定方式测定头醋不挥发酸含量如表5所示。淋醋情况及出醋率计算如表6所示。
表5头醋相关指标及出醋率
Figure BDA0003360201270000121
表6淋醋情况及出醋率
Figure BDA0003360201270000122
9、淀粉含量检测及淀粉利用率计算
醋醅淀粉含量按照GB 5009.9-2016中，采用酶解法测定。发酵结束当天对照组和实验组醋醅的淀粉含量分别为4.82g/100g和3.79g/100g。初始淀粉含量均为11.6g/100g，淀粉利用率分别为58.44％和67.32％，淀粉利用率提高了15.19％。窖泥池二次发酵后，对二次发酵成熟醋醅的淀粉含量进行测定，实验组和对照组醋醅淀粉含量分别为1.83g/100g和3.12g/100g。窖泥池二次发酵后，醋醅淀粉被进一步水解利用，实验组与对照组淀粉利用率分别为84.22％及73.10％，实验组比对照组淀粉利用率提高了15.21％。
10、沉淀含量检测
采用离心法测定成品醋中沉淀含量，对照组和实验组的沉淀含量分别为312mg/100mL和243mg/100mL，实验组相对于对照组，沉淀含量减少了22.12％。
13、氨基酸含量检测
氨基酸含量测定按照《GB 5009.124-2016食品中氨基酸的测定》中的方法来测定。结果如表7所示，实验组1总氨基酸含量为15568.68mg/L，将贝莱斯芽孢杆菌QH-20003应用到窖醋发酵可使提升窖醋产品整体氨基酸含量，实验组比对照组一的氨基酸含量增加了21.04％。
表7窖醋成品中氨基酸含量分析
Figure BDA0003360201270000131
14、风味物质含量检测
采用GC-MS方法测定风味物质乙偶姻及吡嗪类的含量，所述GC-MS方法为：美国安捷伦气质连用色谱仪，采用DB-Wax毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.32mm；将预处理的样品加入2.0g氯化钠和转子,5ul浓度为250mg/L的2-辛醇，盖上样品盖,样品瓶顶空部分插入SPME萃取头,吸附时间40min,以500r/min的转速搅拌，后将萃取头插入GC-MS进样口,解析温度250℃,时间5min；载气：He；流速：1.0ml/min，分流比为2：1；柱温：进样口温度保持在250℃，起始气相色谱柱温维持在40℃3min，以5℃/min升温至60℃，再以10℃/min升温至230℃，保持5min。质谱条件：离子源温度230℃；接口温度280℃；电离方式：EI+；电子能量：70ev；扫描质量范围：33～450amu。
乙偶姻相关风味物质分析结果如表8所示。添加贝莱斯芽孢杆菌QH-20003可以显著增加窖醋中乙偶姻的含量，乙偶姻作为吡嗪类物质去前体物质，可进一步促进窖醋中吡嗪类物质的生成，得到富含乙偶姻及川穹嗪的窖醋，因川穹嗪及其它以乙偶姻为前体产生的吡嗪类物质具有降压、活血化瘀及改善冠心病及溶栓抑栓的功能，并且添加贝莱斯芽孢杆菌的实验组中酯类物质的含量更高，可使食醋口感更佳醇厚，所以将贝莱斯芽孢杆菌QH-20003应用到窖醋酿造中，在赋予其更丰富的风味物质的同时，也在一定程度上强化了窖醋的健康保健的功能性。
表8窖醋成品中相关风味物质含量分
Figure BDA0003360201270000141
15、成品醋感官指标分析
实验组的成品醋色泽更黑亮，体态更澄清，酸味更柔和饱满醇厚，回味更悠长，说明在窖醋的醋酸发酵阶段与窖醋发酵阶段添加贝莱斯芽孢杆菌可以显著提高产品品质。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，菌株的名称为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）QH-20003，其保藏编号为：CGMCC No. 21613，保藏日期2021年 1月 13日，保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.一种如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌发酵液，其特征在于，将贝莱斯芽孢杆菌QH-20003经发酵培养获得发酵液。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵液，其特征在于，发酵液的制备方法如下：1）斜面培养：将贝莱斯芽孢杆菌QH-20003接种至斜面培养基，在35 ℃培养24 h，培养获得斜面菌体；2）一级种子培养：从斜面菌体挑取一接种环菌体接种至一级种子培养基，培养，获得一级种子液；3）二级种子培养：将一级种子液以体积浓度1~10%的接种量接种至二级种子培养基中培养，获得二级种子液；4）发酵培养：米粉和高温α-淀粉酶加水搅拌加热得到醪液，然后加入糖化酶、蛋白胨5-15 g/L和酵母粉2-10 g/L，灭菌后冷却后，按照2~10%的接种量接入步骤3）的二级种子液，发酵，即得发酵液。
4.一种如权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌QH-20003在窖醋酿造中的应用。
5.根据权利要求4所述贝莱斯芽孢杆菌QH-20003在窖醋酿造中的应用，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌QH-20003经发酵培养获得的发酵液按2~10%的接种量加入醋醅中进行发酵。
6.根据权利要求5所述贝莱斯芽孢杆菌QH-20003在窖醋酿造中的应用，其特征在于，贝莱斯芽孢杆菌QH-20003发酵液接种量为6%。
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