CN112694994B - 贝莱斯芽孢杆菌及联产维生素k2和伊枯草菌素a的方法 - Google Patents

贝莱斯芽孢杆菌及联产维生素k2和伊枯草菌素a的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及联产维生素K2和伊枯草菌素A的方法。本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020983。本发明还公开了发酵联产维生素K2(MK‑7)和伊枯草菌素A的方法，以及发酵结束后从发酵液中收集维生素K2(MK‑7)和伊枯草菌素A的方法。本发明提供的方法原料利用率高，产量高，方法简单，易于工业化。

Description

贝莱斯芽孢杆菌及联产维生素K2和伊枯草菌素A的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一株可以高产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的贝莱斯芽孢杆菌，还涉及利用该菌发酵联产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的方法。
背景技术
维生素K2(Vitamin K2,VK2，MK)是由一个甲基萘醌母环和数量不等的异戊二烯单元组成的系列化合物，以MK-n表示侧链上异戊二烯单元的数量，MK-7即侧链上含有7个异戊二烯单元。VK2可以加强人体血清中骨钙蛋白的羧基化，从而增加骨密度，具有预防和治疗骨质疏松症的效果。还可以用来治疗帕金森综合征等线粒体疾病。VK2同系物中，MK-7由于半衰期较长，可在血液中稳定存在，更有效的被人体利用，因而生物活性最佳。目前MK-7的生产主要通过芽孢杆菌属微生物发酵实现，而发酵MK-7的菌种产量普遍比较低，发酵所需的原料成本高，是制约MK-7工业化生产的主要因素。
伊枯草菌素A(iturin A)于1957年首次在从土壤中分离到的枯草芽孢杆菌中发现，是从枯草芽孢杆菌(Bucillus subilis)发酵液中分离得到的一种环脂肽类化合物。其结构由一个β-脂肪酸侧链和7个a-氨基酸残基(L-Asn-D-Tyr-D-Asn-L-Cln-L-Pro-D-Asn-L-Ser)构成，β-脂肪酸侧链通常为直链或支链烷烃构成，侧链的长度和结构差别，构成了其同系物。Iturin A具有强烈抑制植物病原真菌的作用，具有广泛的抗菌谱。IturinA在医药和农业上具有良好的利用和开发前景。
对于大多数生物发酵产品而言，原料成本通常占整个生产成本的30％～40％。如何提高发酵过程的附加值，显著降低发酵成本，提高原料的利用率，是微生物发酵工业中的一个重要问题。本发明人筛选获得一株可高产维生素K2(MK-7)的菌株(Bacillusvelezensis ND)，该菌株同时还具有较弱的产伊枯草菌素A能力。为了使该菌株更适合于进行联产发酵，对该菌株进行了ARTP诱变和筛选，最终获得一株产伊枯草菌素A的能力有较大提升的突变菌株ND-A1，用于联产发酵可以显著降低发酵成本和提高底物利用效率，具有良好的工业应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种可以同时高产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)的菌株，以及利用该菌株高效生产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的低成本高效率生产方法；同时提供一种简单有效的产物提取方法，可以从发酵液中同步提取，分别收集维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A。
本发明提供以下技术方案解决上述问题：
本发明的第一个目的是提供一株可同时高产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的菌株，该菌株是以Bacillus velezensis ND为出发菌株，经过诱变后筛选得到的，该菌株命名为Bacillus velezensis ND-A1，已于2020年12月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2020983，中国，武汉。
本发明的第二个目的是提供一种发酵联产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的方法，包括最优的发酵联产培养基，最优的发酵联产培养条件，包括以下步骤：
(1)将Bacillus velezensis ND-A1划线或稀释涂布至固体种子培养基平板中，获得活化的平板菌落；挑取单菌落接种到种子培养基中培养，获得细胞浓度为1～2×108种子液
(2)将上述种子液按1～10％接种量，接入联产发酵培养基中在最优培养条件下培养，以使该微生物在培养基中同时积累伊枯草菌素A和维生素K2(MK-7)
进一步地，步骤(1)中，固体种子培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 5g/L、琼脂粉15g/L，培养条件为：培养温度28～～37℃、培养时间10-20h。种子培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、NaCl 5g/L,培养条件为：培养温度28～37℃、摇床转速180～200rpm、培养时间16-24h。
进一步地，步骤(2)中所述联产发酵培养基成分为：甘油50-90ml/L、L-谷氨酸钠1～5g/L、酵母浸粉1～20g/L、豆粕粉80～180g/L、K2HPO40.5～1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1～1.0g/L、FeSO4·7H2O 0.1～0.5mg/L、Mn SO4·H2O 1～15mg/L、CuSO4·5H2O 0.1～0.5mg/L
优化地，以相同含量的D-麦芽糖，葡萄糖，蔗糖，D-果糖替代发酵培养基中甘油进行发酵。
进一步地，步骤(2)中所述的最优联产发酵培养条件为：培养温度28～37℃、摇床转速180～200转/分钟，培养时间144～168小时。
本发明的第三个目的是提供一种简单有效的产物提取方法，可以从发酵液中同步提取，分别收集维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A。
包括以下步骤：
发酵结束后从培养液中提取维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A，所述的提取方法为：将步骤(2)中所得的发酵液按体积比4:1加入萃取剂进行振荡萃取5min。萃取结束后3000r/min离心10min，离心后的混合液分为三层，分别收集上层无色清液和中间层浅黄色清液。上层无色清液减压浓缩，得到淡黄色油状的维生素K2(MK-7)；中间层浅黄色清液减压浓缩后得到伊枯草菌素A。
进一步地，所述的萃取剂为甲醇：正己烷：异丙醇，其体积比为3:2:1
进一步地，获得的维生素K2(MK-7)加异丙醇溶解，HPLC检测维生素K2(MK-7)，HPLC条件如下：流动相为甲醇:二氯甲烷＝9:1，流速为1.0ml/min，柱温为40℃，进样量为20μL，紫外检测波长：248nm，色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18；
进一步地，所述步提取获得的伊枯草菌素A用甲醇溶解，HPLC测定伊枯草菌素，HPLC条件如下：流动相为10mmol/l醋酸铵：乙腈＝65:35，柱温为25℃，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为210nm，色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的诱变菌株ND-A1，诱变后的菌株ND-A1可以同时高产维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A，相比于现有的其他菌株，拓宽了菌株的应用范围。
本发明提供的联产发酵方法，可以实现显著提高维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的联产产率，提高发酵过程的附加值，提高原料的转化率，降低发酵成本。
本发明提供的发酵液中的维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的同步提取分别收集方法，操作简单，周期短。
本发明联产发酵过程中，以相同含量的D-麦芽糖，葡萄糖，蔗糖，D-果糖替代发酵培养基中甘油进行发酵，维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的联产产率均不及甘油，可见，本发明菌株最适碳源是甘油。
附图说明
图1为Bacillus velezensis菌株ND菌落形态；
图2为Bacillus velezensis菌株ND-A1的发酵液上清对大丽轮枝菌和镰刀菌的抑菌效果；a为大丽轮枝菌，b为镰刀菌；
图3为发酵液中维生素K2(MK-7)的HPLC图；
图4为发酵液中伊枯草菌素A的HPLC图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的内容，但本发明不限于下述的实施例。
实施例1
出发菌株Bacillus velezensis ND的分离及鉴定
将采集的土壤样品用无菌水稀释后在95℃水浴30min，然后在种子培养基上划线分离，获得单菌落。挑取单菌落连续划线分离三次后进行初筛。初筛时将单菌落进行斜面培养后接入发酵培养基中进行摇瓶发酵，发酵结束检测其MK-7的含量。将含量较高的菌株斜面保存于4℃冰箱，再次传斜面活化后进行复筛。复筛时，首先将斜面菌种接入种子培养基培养，种子培养成熟后接入发酵培养基培养，发酵结束检测其MK-7的含量。
通过筛选获得一株维生素复筛产量为23mg/L的菌株,对其制备甘油冷冻进行保存。将菌株进行分子生物学鉴定，将菌株的16s rRNA基因及gyrB基因采用PCR扩增后测序，将基因序列提交NCBI基因库进行比对鉴定。确定该菌种为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。
该菌株平板单菌落幼龄菌落为白色，圆形，幼龄菌落半通明，40h后菌落中间凸起环形褶皱，边缘不规则。最适培养温度为37℃。在液体培养基的气液交界处形成生物膜。革兰氏染色为阳性。
图1为Bacillus velezensis ND菌落形态。
实施例2
利用常压室温等离子体(ARTP)对出发菌株Bacillus velezensis ND进行诱变及筛选，包括以下步骤：
(1)菌悬液的制备：将保藏于甘油管中的Bacillus velezensis ND划线或稀释涂布于固体种子培养基(培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，121℃灭菌20min)，培养温度37℃、培养时间14h。
(2)种子悬液的制备：将固体种子上单菌落接种于种子培养基(培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，121℃灭菌20min)进行培养，培养温度37℃、摇床转速200r/min、培养时间20h；
(3)取制备的种子悬液，于6000r/min下离心5min收集菌体，用无菌水悬浮菌体沉淀并再次于6000r/min下离心5min，洗涤两次，最终再用无菌水彻底重悬制得菌悬液。
(4)ARTP诱变：取上述步骤制备的10μL菌悬液于载片上，涂匀后转移至操作箱进行诱变，工作条件为：10SLM,120W，分别处理20，50，80，110，140s。诱变结束后将载片转移至装有1mL无菌水的EP管中振荡1min彻底洗脱载片上的菌体，根据10倍稀释法稀释至合适浓度涂布于含有甲萘醌的固体筛选培养基上，培养后进行菌落计数，计算致死率和正突变率。当ARTP处理140s时正突变率达到最高，为40％。
(5)高产菌株的筛选：将筛选培养基平板上生长的单菌落挑取于装有700μL种子培养基的96孔深孔细胞培养板中，于培养温度37℃、200r/min培养时间10-14h，将培养好的种子液分别接入装有20ml Landy发酵培养基(配方为：葡萄糖20g/L，L-谷氨酸钠5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，KH2PO41.0 g/L，KCl 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.15mg/L，Mn SO4·H2O5mg/L，CuSO4·5H2O 0.16mg/L)的250ml摇瓶中，37℃，振荡培养5天。培养结束后分别提取伊枯草菌素A进行HPLC检测。经过筛选，得到一株稳定遗传的突变株ND-A1,其伊枯草菌素A产量达到0.33g/L，比出发菌株提高4.1倍。菌落及菌株形态未发生明显改变。
将Bacillus velezensis ND-A1的发酵液上清及菌落接种于植物病原微生物大丽轮枝菌和镰刀菌的平板上进行培养，结果如图2所示，其发酵产物及菌落对两种病原微生物具有明显的抑菌效果。
实施例3
(1)菌种活化：将保藏于甘油管中的Bacillus velezensis ND-A1划线或稀释涂布于固体种子培养基(培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，琼脂粉15g/L，121℃灭菌20min)，培养温度37℃、培养时间10-14h。
(2)种子悬液的制备：将固体种子上单菌落接种于种子培养基(培养基配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L，121℃灭菌20min)进行培养，培养温度37℃、摇床转速200r/min、培养时间16-20h；
(3)取步骤(2)制备的种子悬液接种到使用同等浓度的甘油代替葡萄糖为碳源的Landy培养基中发酵(培养基配方为：甘油20g/L，L-谷氨酸钠5g/L，MgSO4.7H2O 0.5g/L，KH2PO41.0g/L，KCl 0.5g/L，微量元素FeSO4·7H2O 0.15mg/L，MnSO4·H2O 5mg/L，CuSO4·5H2O 0.16mg/L，121℃灭菌20min)，接种量1％，培养温度37℃、200r/min，培养时间7天，发酵结束后补水至初始发酵体积。维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的测定采用同步提取法进行提取并用HPLC进行测定。结果发酵液中不产生维生素K2(MK-7)，而伊枯草菌素A产量为0.37g/L。
实施例4
(1)Bacillusvelezensis菌株ND-A1菌种按实施例3的步骤(1)、(2)进行菌种活化和种子悬液制备
(2)使用液态发酵培养基发酵，配制液态发酵培养基(培养基配方：甘油50g/L、大豆蛋白胨120g/L、酵母浸粉12g/L、K2HPO40.7 g/L、CaCl20.15g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L，121℃灭菌20min)，灭菌后冷却，再取步骤(1)制备的种子悬液接种到发酵培养基中，接种量1％，培养温度37℃、200r/min、培养7天，发酵结束后补水至初始发酵体积。维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的测定采用同步提取法进行提取和测定。
维生素K2(MK-7)产量为15.7mg/L，伊枯草菌素产量，为0.65g/L。
比较实施例4中的液态发酵培养基和实施例2、3的Landy培养基发酵的结果可以看出，使用Landy培养基做为发酵培养基时，虽然其可以产生伊枯草菌素A，但是其不能产生MK-7。使用液态发酵培养基可以产生维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A,但产量均比较低，不适合工业化生产。
实施例5
(1)Bacillusvelezensis菌株ND-A1菌种按实施例3的步骤(1)、(2)进行菌种活化和种子悬液制备
(2)将上述种子悬液按1％接种量接入配方为：酵母浸粉12g/L、大豆蛋白胨120g/L、甘油50ml/L、KH2PO41.7g/L、CaCl20.2g/L、NaCl 0.9g/L、L-谷氨酸钠5g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.15mg/L、MnSO4·H2O 5mg/L、CuSO4·5H2O 0.165mg/L,自然PH的发酵培养基中。分别在温度为37℃，转速200r/min的条件下培养7d。发酵结束后补水至初始发酵体积。维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的测定采用同步提取法进行提取和测定。
提取和测定包括以下步骤：
首先在一定体积的发酵液中，加入4倍体积萃取剂，萃取剂为甲醇：正己烷：异丙醇＝3:2:1，于漩涡震荡仪上振荡5min，然后混合液3000r/min离心5min；离心后混合液分为三层，最上层为无色清液，中间为浅黄色清液，最下层为菌体沉淀。
吸取上层无色液体旋转蒸发浓缩后加异丙醇溶解，HPLC检测维生素K2(MK-7)，HPLC条件如下：流动相:甲醇:二氯甲烷＝9:1，流速：1.0mL/min，柱温：40℃，进样量：20μL，紫外检测波长：248nm，色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18；
吸取中间层浅黄色清液旋转浓缩后加甲醇溶解，HPLC测定伊枯草菌素，HPLC条件：流动相：10mmol/l醋酸铵：乙腈＝65:35，柱温：25℃，流速：1ml/min，紫外检测波长：210nm，色谱柱为安捷伦ZORBAX Eclipse XDB-C18。
如表1所示，对发酵结束后的不同批次发酵液使用上述步骤进行提取，并对维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A的含量进行测定，可以看出维生素K2(MK-7)经分离后全部存在于上部清液中，伊枯草菌素全部存在于中间层浅黄色清液中。
表1同步提取法的上层无色液体和中间层浅黄色液体中的各产物含量
Figure GDA0002980366060000071
实施例6
(1)Bacillusvelezensis菌株ND-A1菌种按实施例3的步骤(1)、(2)进行菌种活化和种子悬液制备
(2)将上述种子悬液按1％接种量接入配方为：酵母浸粉12g/L、豆粕粉100g/L、甘油50ml/L、L-谷氨酸钠5g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、KH2PO41.0g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4·7H2O0.15mg/L、Mn SO4·H2O 5mg/L、CuSO4·5H2O 0.165mg/L,自然PH的发酵培养基中。分别在温度为25、28、32、37和40℃，转速200r/min，的条件下培养7d。发酵结束后补水至初始发酵体积，对维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A进行提取和测定。
考察发酵温度对维生素K2(MK-7)和iturinA产量的影响。
结果如下：
表2发酵温度对维生素K2(MK-7)和iturinA产量的影响
Figure GDA0002980366060000072
37℃时维生素K2(MK-7)的最大产量为39.39mg/L，iturinA的产量为1.94g/L，28℃时,iturinA的最大产量为4.66g/L，维生素K2(MK-7)的产量为23.09mg/L。高温(37℃)有利于维生素K2(MK-7)的合成，但不利于iturin A的合成。考虑到iturin A和维生素K2(MK-7)的同时生产，其最适温度为32℃。
实施例7
(1)Bacillusvelezensis菌株ND-A1菌种按实施例3的步骤(1)、(2)进行菌种活化和种子悬液制备
(2)通过PB试验对发酵培养基中的关键影响因子进行筛选，对筛选出的关键影响因子再进行iturin A和维生素K2(MK-7)作为目标值的响应面优化，得到最佳的联产发酵培养基：甘油为72.2ml/L、L-谷氨酸钠为1.4g/L、酵母浸粉为16.9g/L、豆粕粉为130.9g/L，K2HPO4 1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L、FeSO4·7H2O 0.15mg/L、Mn SO4·H2O 5mg/L、CuSO4·5H2O 0.165mg/L，将步骤(1)所述种子悬液接入最佳联产发酵培养基中，32℃，200r/min，发酵7d。发酵结束后补水至初始发酵体积，对维生素K2(MK-7)和伊枯草菌素A进行提取和测定。
维生素K2(MK-7)产量为42.22mg/L，伊枯草菌素产量为4.23g/L。
上述虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了介绍，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，这对本领域技术人员而言应该很明确，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一株高产维生素K2 MK-7和伊枯草菌素A的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ND-A1，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis) ND-A1保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020983。
2.一种发酵联产维生素K2 MK-7和伊枯草菌素A的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1）将保藏号为CCTCC M 2020983的贝莱斯芽孢杆菌ND-A1划线或稀释涂布至固体种子培养基平板中进行活化培养，获得活化的平板菌落；挑取单菌落接种到种子培养基中进行种子培养，获得细胞浓度为（1-2）×108cfu/ml的种子液；
步骤2）将步骤1）所得种子液按1-10%接种量，接入联产发酵培养基中进行发酵培养；
步骤3）发酵培养结束后，从发酵培养液中提取维生素K2 MK-7和伊枯草菌素A；
所述联产发酵培养基的成分为：甘油50-90ml/L、L-谷氨酸钠1-5g/L、酵母浸粉1-20g/L、豆粕粉80-180g/L、K2HPO4 0.5-1.0g/L、MgSO4·7H2O 0.1-1.0g/L、FeSO4·7H2O 0.1-0.5mg/L、MnSO4·H2O 1-15mg/L、CuSO4·5H2O 0.1-0.5mg/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固体种子培养基的配方为：牛肉膏5g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂粉15 g/L。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述活化培养的条件为：培养温度28-37℃、培养时间10-20 h。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：牛肉膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、葡萄糖10 g/L、NaCl 5 g/L。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子培养的条件为：培养温度28-37℃、摇床转速180-200 rpm、培养时间16-24 h。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：培养温度28-37℃、摇床转速180-200 转/分钟，培养时间144-168小时。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述提取维生素K2 MK-7和伊枯草菌素A的方法为：按发酵培养液：萃取剂为4:1的体积比向发酵培养液中加入萃取剂，进行振荡萃取5min；萃取结束后3000r/min离心10min，离心后的混合液分为三层，分别收集上层无色清液和中间层浅黄色清液；将上层无色清液减压浓缩，得到淡黄色油状的维生素K2 MK-7；中间层浅黄色清液减压浓缩后得到伊枯草菌素A；所述萃取剂由甲醇、正己烷以及异丙醇组成，甲醇：正己烷：异丙醇的体积比为3:2:1。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104328064A (zh) * 2014-09-16 2015-02-04 丽水双健生物工程有限公司 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN104328064A (zh) * 2014-09-16 2015-02-04 丽水双健生物工程有限公司 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用
CN110117556A (zh) * 2019-03-27 2019-08-13 海南大学 一种高效产脂肽类物质的生防菌hn-2及发酵工艺

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Comparison of different fermentation processes for the vitamin K2 (Menaquinone-7) production by a novel Bacillus velezensis ND strain;Changle Zhao等;《Process Biochemistry》;20201203;第102卷;全文 *
Isolation and characterization of a high iturin yielding Bacillus velezensis UV mutant with improved antifungal activity;Young Tae Kim等;《PLOS ONE》;20201203;第15卷(第12期);全文 *

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