CN113396214A - 从链霉菌属sp.mcc-0151生产尼日利亚菌素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于从登录号为MCC 0151的链霉菌属菌合成尼日利亚菌素及其高产率的分离的发酵方法。本发明进一步涉及一种包含用于以高产率专门生产尼日利亚菌素的包含链霉菌属sp.MCC0151的生物纯培养物的微生物接种组合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种从登录号MCC 0151的链霉菌属菌以高产率合成尼日利亚菌素的发酵方法。本发明进一步涉及作为生产尼日利亚菌素的接种物的包含链霉菌属sp.MCC0151的生物纯培养物的微生物组合物。
背景技术
由链霉菌(特别是吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus))产生的尼日利亚菌素抗生素于20世纪50年代首次分离。其复杂的结构最终在1968年得到阐明。尼日利亚菌素是一种离子载体,对单价阳离子如Na+和K+具有很高的亲和力。尼日利亚菌素破坏线粒体的膜电位。尽管尼日利亚菌素可以作为游离酸被分离,像大多数离子载体一样,它被提取到有机溶剂中并且最方便地作为盐被分离。通过体外技术,已确定尼日利亚菌素对革兰阳性细菌、真菌、肿瘤细胞系、疟疾寄生虫和某些病毒(包括HIV)具有广泛的生物学活性。
据报道,共有53种链霉菌科的细菌产生离子载体。这些微生物属于三个属,链霉菌属(Streptomyces)、放线菌属(Actinomodura)和指孢囊菌属(Dactylosporangium)。链霉菌被认为是离子载体的主要生产者。目前已知的约50%的离子载体源自两种链霉菌属物种(即吸水链霉菌和白色链霉菌(Streptomyces albus))。尼日利亚菌素是最早发现的聚醚离子载体之一,但其生物合成仍不明确,因此对其生产、产量和商业化造成了压力。
在结构上,尼日利亚菌素显示为具有带末端羧基的支链的环醚,并且其特征在于存在许多立构中心。尼日利亚菌素的分子式为C40H68O11,摩尔质量为724.96g/mol。
尼日利亚菌素分子结构(从MCC-0151获得)
尼日利亚菌素在有9个可旋转的键的40个碳原子的骨架上含有19个确定的原子立构中心。其具有与11个氢键受体计数相关的3个氢键供体基团。这已通过分析参数如NMR、XRD、IR等明确确认。尼日利亚菌素可从在全球范围内很少的发酵行业买到。
在Mouslim等的The Journal of Antibiotics,Vol,4,No.9,1995中发表的涉及通过尼日利亚菌素生产菌吸水链霉菌NRRL B-1865的聚醚羧酸类抗生素尼日利亚菌素的生产和灰争菌素(grisorixin)生物羟基化的生物合成研究的研究项目中,公开了油酸甲酯的添加提高了尼日利亚菌素生产的产率,并且还导致分离出三种另外的聚醚类抗生素-奥布菌素(abierixin)、epinigericin和灰争菌素。然而,在所述公开中观察到尼日利亚菌素的产率低至8mg/L。此外,尼日利亚菌素生产菌吸水链霉菌NRRLB-1865产生奥布菌素和灰争菌素两者对主要代谢物尼日利亚菌素生物合成的最终步骤带来了问题。在2011年3月21日的中国专利申请号20111067581中报道的关于“产生尼日利亚菌素的菌株”的不同研究中,其中作者描述了产生尼日利亚菌素的马来西亚链霉菌(Streptomyces malaysiensis)O4-6及其在杀藻中的应用。但是,在该报告中,他们并未就该方法的回收、产率和经济性方面进行详细说明。
目前,尼日利亚菌素通过吸水链霉菌生产,并且由于其严重的低产率,仅可通过商业供应商以过高的成本获得用于研究目的。在商业上,尼日利亚菌素在格尔德霉素的发酵工艺过程中作为副产物或污染物获得,因此,现有技术中没有报道过用于专门生产尼日利亚菌素的方法。从以上可以得出结论,现有技术的公开缺乏用于生产和分离具有高效抗生素特性的尼日利亚菌素的明确方法。
因此,本领域需要提供一种用于以高产率地专门生产尼日利亚菌素的高成本效益的方法。
发明内容
发明目的
本发明的一个目的是提供一种用于合成尼日利亚菌素的发酵方法,其中以高产率产生尼日利亚菌素作为主要产物。
本发明的另一个目的是提供一种从全细胞培养液提取物分离尼日利亚菌素的方法。
本发明的又一目的是提供一种包含登录号为MCC 0151的链霉菌属菌的组合物用于专门合成尼日利亚菌素。
发明概述
在一个实施方案中,本发明提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,包括:
(i)在代谢物生产培养基(metabolite production medium)中培养包含链霉菌属sp.MCC 0151的接种物;
(ii)以1:1的比率混合含有链霉菌属sp.MCC 0151细胞的代谢物生产培养基和乙酸乙酯以获得混合物;
(iii)对步骤(ii)中获得的混合物进行离心以获得上清液和包含尼日利亚菌素的乙酸乙酯提取物;
(iv)蒸发步骤(iii)中获得的乙酸乙酯提取物以获得干燥的粗提取物;
(v)通过柱色谱纯化步骤(iv)中获得的干燥粗提取物以获得纯化的尼日利亚菌素,其中尼日利亚菌素以具有最高500mg/L浓度的高产率产生。
在本发明的又一实施方案中提供了一种接种物,其中所述接种物包含浓度范围为代谢物生产培养基体积的5%至10%的链霉菌属sp.MCC 0151。
在本发明的又一实施方案中,培养在28℃至32℃的温度范围内进行5-8天。
在本发明的又一实施方案中,柱色谱包括作为固定相的硅胶网(silica gelmesh)和作为流动相的包含二氯甲烷和甲醇的梯度。
在本发明的再另一实施方案中,代谢物生产培养基包含碳源、作为氮源的酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4.7H2O。
在本发明的再另一实施方案中,碳源选自淀粉。
在本发明的再另一实施方案中,产生的尼日利亚菌素的产率为33重量%。
在本发明的再另一实施方案中,产生的尼日利亚菌素具有抗细菌和抗疟疾性质。
在再另一个实施方案中,本发明提供了一种微生物组合物,其包含浓度范围为代谢物生产培养基重量的5%至10%的登录号为MCC-0151链霉菌属菌的生物纯培养物,和合适的赋形剂。
在再另一个实施方案中,本发明提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中尼日利亚菌素作为主要代谢物产生,具有最高500mg/L浓度的高产率。
附图说明
图1(a)描绘了在不同浓度的来自链霉菌属sp.MCC-0151的尼日利亚菌素下对金黄色葡萄球菌(S.aureus)生长的抑制;
图1(b)描绘了来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。
图1(c)描绘了sigma标准品尼日利亚菌素对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。
图2描绘了红内期(blood-stage)疟疾寄生虫生长抑制的EC50值。“■”代表来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素和“●”代表标准品尼日利亚菌素。所有样品的重复数n=3。
图3描绘了从链霉菌属sp.MCC-0151分离的尼日利亚菌素和商业获得的尼日利亚菌素对鼠脾细胞的体外毒性的比较。“▲”代表来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素和“▼”代表标准品尼日利亚菌素。
图4描绘了雄性SD大鼠中来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素单次静脉内(IV,剂量:2mg/kg)、腹膜内(IP,剂量:2mg/kg)和口服(PO,剂量:10mg/kg)施用后的平均血浆浓度-时间曲线。
图5描绘了在第1天来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素(剂量:0.5、1.5和5mg/kg/天)的14天重复腹膜内施用后,雄性和雌性SD大鼠的血浆浓度-时间曲线。
图6描绘了链霉菌属sp.MCC0151中的另外的转运相关蛋白质。
图7提供了获得的尼日利亚菌素的1H NMR谱。
图8提供了获得的尼日利亚菌素的13C NMR谱。
图9提供了获得的尼日利亚菌素的2D NMR。图9(a)描绘了NOSY NMR谱,图9(b)描绘了HSQC NMR谱,图9(c)描绘了HMBC NMR谱,和图9(d)描绘了COSY NMR谱。
具体实施方式
现在将结合特定的优选和任选实施方案详细描述本发明,从而可以更充分地了解和理解本发明的各个方面。
生物材料的来源:
产生尼日利亚菌素的链霉菌属sp.DASNCL-29分离自从Unkeshwar,Maharashtra,India(GPS:20°05'57.8"N 78°20'17.4"E)收集的土壤。
生物材料的保藏
根据本发明,链霉菌属sp.DASNCL-29的菌株于2018年9月7日保藏于Pune,Maharashtra,India的国家微生物资源中心(National Center Microbial Resource),并被指定登录号:MCC 0151。
本发明的链霉菌属sp.MCC0151在其基因组中具有如同其他尼日利亚菌素生产菌株的相关的天然尼日利亚菌素生物合成基因簇。与天然尼日利亚菌素生物合成基因簇一起,该菌株还具有另外的转运相关基因。其蛋白质提供于图6中。所述基因未报道与任何已知的尼日利亚菌素生产菌株相关。这种转运蛋白将大分子细胞外转运,其导致本发明中尼日利亚菌素的高产率。因此,为了增强链霉菌MCC 0151的尼日利亚菌素产生和以高产率获得尼日利亚菌素,本发明提供了一种对链霉菌MCC 0151特异性的方法。
本发明提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151产生和分离尼日利亚菌素的方法。该方法包括使用新的菌株链霉菌属sp.MCC 0151。由于所有菌株通过常规工艺不产生尼日利亚菌素,该方法是菌株特异性的。
本发明提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151产生和分离尼日利亚菌素的方法,包括在代谢物生产培养基中培养链霉菌属sp.MCC 0151,且在培养适当天数后,对含有链霉菌属sp.MCC 0151的培养基使用乙酸乙酯进行溶剂提取。对包含尼日利亚菌素的乙酸乙酯提取物进行蒸发以获得干燥的粗提取物,并通过柱色谱纯化干燥的粗提取物以获得包含纯化的尼日利亚菌素的级分。通过本发明的方法产生的尼日利亚菌素是高产率的主要产物,不同于涉及将尼日利亚菌素作为污染物或副产物产生的常规方法。所述方法的完整工作流程对于链霉菌属sp.MCC 0151是非常特异性的以获得高产率的尼日利亚菌素。通过本发明方法产生的尼日利亚菌素已证明作为抗微生物和抗疟疾剂是有效的。保持尼日利亚菌素生产的商业性,非常重要的是具有用于生产尼日利亚菌素的经济的方法。
本发明提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中尼日利亚菌素作为主要代谢物产生,具有浓度最高500mg/L的高产率。
本发明的一个实施方案提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,包括:
(i)在代谢物生产培养基中培养包含链霉菌属sp.MCC 0151的接种物;
(ii)以1:1的比率混合含有链霉菌属sp.MCC 0151细胞的代谢物生产培养基和乙酸乙酯以获得混合物;
(iii)对步骤(ii)中获得的混合物进行离心以获得上清液和包含尼日利亚菌素的乙酸乙酯提取物;
(iv)蒸发步骤(iii)中获得的乙酸乙酯提取物以获得干燥的粗提取物;
(v)通过柱色谱纯化步骤(iv)中获得的干燥粗提取物以获得纯化的尼日利亚菌素。
在尼日利亚菌素合成的过程之前,所述链霉菌属sp.MCC0151菌株的接种物通过在国际链霉菌项目培养基-2(International Streptomyces Project Medium-2)(ISP 2)琼脂培养基中培养所述菌株,和然后将其转移至液体培养介质(LCM)中以提供包含链霉菌属sp.MCC-0151的接种物而制备。所述LCM在28℃下,150rpm的振荡培养箱中孵育6天。液体培养介质包含作为氮源的大豆粉和作为碳源的葡萄糖和甘露醇。
本发明的另一个实施方案提供了用于制备链霉菌属sp.MCC-0151的接种物的液体培养介质,其包含20.0g/L大豆粉、20.0g/L甘露醇、4.0g/L葡萄糖,pH 7.0±0.3。
在本发明的又一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中接种物包含浓度范围为代谢物生产培养基体积的5%至10%的链霉菌属sp.MCC 0151。
在本发明的再另一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中培养在28℃至32℃的温度范围内进行5-8天。
在本发明的另一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中柱色谱包括作为固定相的硅胶网和作为流动相的包含二氯甲烷和甲醇的梯度。
在本发明的又一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中代谢物生产培养基包含碳源、作为氮源的酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4.7H2O。
在本发明的再另一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中代谢物生产培养基中的碳源选自葡萄糖和甘露醇。
在本发明的另一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中所产生的尼日利亚菌素的产率为33重量%。
在本发明的又一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中所产生的尼日利亚菌素具有抗细菌和抗疟疾性质。
本发明的另一方面提供了一种微生物组合物,其包含浓度范围为代谢物生产培养基重量的5%至10%的登录号为MCC-0151的链霉菌属菌的生物纯培养物,和合适的赋形剂。
在本发明的优选实施方案中,合适的赋形剂是牛奶培养基(milk medium)。链霉菌菌丝体与孢子可使用牛奶培养基以冻干的形式保持,或在土壤基质中长时间保持,并可复苏以用于接种。
本发明的又一方面提供了一种微生物组合物,其包含浓度范围为代谢物生产培养基体积的5%至10%的登录号为MCC-0151的链霉菌属菌的生物纯培养物,和由碳源、氮源和矿物质源组成的代谢物生产培养基。
在本发明的又一方面中,提供了一种微生物组合物,其包含浓度范围为代谢物生产培养基体积的5%至10%的登录号为MCC-0151的链霉菌属菌的生物纯培养物和代谢物生产培养基,其中在代谢物生产培养基中,碳源选自葡萄糖或甘露醇,氮源选自酵母提取物或大豆提取物,和矿物质源选自K2HPO4和MgSO4.7H2O。
因此,用于合成尼日利亚菌素的发酵工艺包括以下阶段,其在下文中进行详细描述:
(i)开发链霉菌属sp.MCC-0151的接种物,
(ii)代谢物生产的上游工艺,以及
(iii)尼日利亚菌素的提取和纯化的下游工艺。
接种物开发:
产生尼日利亚菌素的链霉菌sp.MCC-0151从ISP 2琼脂接种到液体介质(LCM)中。LCM包含大豆粉(20.0g/L)、甘露醇(20.0g/L)、葡萄糖(4.0g/L),pH 7.0±0.3。LCM在28℃下,150rpm的振荡培养箱中孵育6天。
发酵工艺(上游):
代谢物生产培养基包含淀粉(15g/L)、酵母抽提物(4g/L)、K2HPO4(1g/L)、MgSO4.7H2O(0.5g/L)。将由LCM制备的10重量%的接种物无菌接种到所述代谢生产培养基中。
温度:28℃,搅拌:初始150rpm(控制循环以维持DO)(使用Ruston涡轮叶轮,范围150-500RPM),充气:通过宏喷头(macro sparger)的压缩无菌空气3LPM(经调整以维持DO),溶解氧(DO):初始饱和至100%。维持在30±5%。持续时间:6天,pH:7.0+0.3
下游工艺纯化
乙酸乙酯提取
乙酸乙酯用于从全发酵液(含有链霉菌属sp.MCC 0151细胞的代谢物生产培养基)提取产生的代谢物。以1:1的比率混合的乙酸乙酯和含有链霉菌属sp.MCC 0151细胞的代谢物生产培养基进行离心,且含有尼日利亚菌素的乙酸乙酯提取物进行旋转真空蒸发以获得干燥的粗提取物(75g/50L)。
色谱纯化:
纯化使用重力柱通过柱色谱进行,其中100-200目硅胶作为固定相且二氯甲烷和甲醇的梯度作为流动相。
将粗提取物(75g)分级分离成45个级分,之后将含有尼日利亚菌素的级分混合在一起,并使用相同的色谱方法进一步纯化以获得25g纯尼日利亚菌素。
在本发明的又一个实施方案中,提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中尼日利亚菌素作为主要产物专门产生,并且在10L至50L的中试生产中,尼日利亚菌素的产率为最高500mg/L的浓度。
培养后,微生物生产培养基包含浓度范围为0.2μg/mL至80μg/mL,优选浓度范围为0.2μg/mL至50μg/mL,更优选浓度范围为20μg/mL至50μg/mL的尼日利亚菌素。
通过本发明方法合成的尼日利亚菌素具有抗细菌和抗疟疾性质。尼日利亚菌素对金黄色葡萄球菌的MIC为0.21μg/ml和MIC浓度为287.7nM。尼日利亚菌素对恶性疟原虫的IC50为~0.986nM。
通过本发明方法合成的尼日利亚菌素表现出优异的生物利用度,并且对宿主细胞是非毒性的。
本发明的一个实施方案提供了用于治疗传染病和疟疾的包含尼日利亚菌素的组合物。
实施例
以下实施例是为了说明本发明而给出的,且因此不应被解释为限制本发明的范围。
实施例1:接种物开发
为了建立用于生产尼日利亚菌素的接种物,链霉菌属sp.MCC-0151最初在ISP2琼脂平板上生长以获得纯菌落。从平板中挑取单菌落,并无菌接种到pH 7.0±0.3的含有20g/L的大豆粉、20g/L的甘露醇、4g/L的葡萄糖与5%-10%的接种物的无菌液体培养介质中和保持在28℃的温度,150RPM的振摇条件下6天。
实施例2:上游工艺,即尼日利亚菌素产生
尼日利亚菌素生产采用14L发酵罐以中试规模进行。将含有淀粉15g/L、酵母抽提物4g/L、磷酸氢二钾1g/L和七水硫酸镁0.5g/L的代谢物生产培养基用液体培养介质中培养的接种物进行无菌接种。
实施例3:工艺参数
(a)温度
使用带夹套温度控制系统将工艺的温度保持在28℃。
(b)溶解氧
在接种发酵罐前,通过在室温下用氧气饱和培养基将发酵培养基中的溶解氧校准至100%。在此过程中,采用用搅拌循环的级联控制系统将溶解氧维持在30±5%。
(c)搅拌:
使用受控的电机驱动的Ruston涡轮叶轮获得工艺的适当混合以实现工艺中所需的溶解氧。旋转被设定为通过级联控制的150rpm-500rpm的限度。带挡板容器用于确保适当混合。
(d)通气:
无菌空气以喷射空气和表面空气的形式提供到培养基中;在该工艺中,使用1-5LPM的喷射空气维持溶解氧水平。提供表面空气以保持容器处于正压力下以避免发酵运行过程中的污染。
(e)发酵体积和持续时间:
发酵工艺在包含9L的代谢物生产培养基和在液体培养介质中生长的1L接种物的14L的容器(具有10L的工作体积)中进行。该工艺运行6天,并通过间歇取样和观察生物活性曲线确认了该工艺过程中的尼日利亚菌素产生。
实施例4:下游工艺
(a)乙酸乙酯提取
全发酵液(含有链霉菌属sp.MCC 0151细胞的代谢物生产培养基)在混合容器中使用等量的乙酸乙酯进行提取。剧烈混合1小时以确保代谢物的适当提取。混合后,将发酵液和乙酸乙酯的混合物以10000rpm的速度离心10分钟,并收集上清液。剩余的发酵液再次进行两次提取。使用旋转真空蒸发器浓缩包含尼日利亚菌素的乙酸乙酯提取物以获得包含尼日利亚菌素的干燥粗提取物。
(b)尼日利亚菌素的纯化
所获得的干燥粗提取物使用具有100-200尺寸的二氧化硅网作为固定相的重力柱通过柱色谱分级分离。使用60-120二氧化硅网将粗提取物加载到柱上。使用相同的色谱技术进一步纯化含有尼日利亚菌素的级分。
使用二氯甲烷和甲醇的梯度作为流动相进行色谱分级分离。采用薄层色谱法分析尼日利亚菌素的纯度;其中对-茴香醛用作TLC的显色试剂。
(c)使用NMR谱的尼日利亚菌素的表征
使用400Hz NMR谱仪产生纯化合物的NMR谱。质子NMR、13C、HMBC、HSQC、NOSY、COSY谱用于确认尼日利亚菌素的结构。图7提供了所得尼日利亚菌素的1H NMR谱。图8提供了所得尼日利亚菌素的13C NMR谱。图9提供了所得尼日利亚菌素的2D NMR。图9(a)描绘了NOSY NMR谱,图9(b)描绘了HSQC NMR谱,图9(c)描绘了HMBC NMR谱,和图9(d)描绘了COSY NMR谱。
实施例5:尼日利亚菌素在50L中试规模的发酵中的产率
50L体积的中试规模发酵产生75g乙酸乙酯粗提取物,即1.5g/L,纯化后分离出25g纯尼日利亚菌素,其占总粗提取物的33%。产率的计算见表1。
表1
实施例6:中试规模尼日利亚菌素生产工艺中涉及的详细成本(表2)
表2
图3显示了来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素和Sigma标准品尼日利亚菌素的比较毒性。由链霉菌属sp.MCC0151产生的尼日利亚菌素与商业上可得的尼日利亚菌素(Sigma)相比,其对鼠脾细胞的毒性没有统计学显著的差异。
实施例7:尼日利亚菌素对雄性SD大鼠的血浆药代动力学
静脉内:在以2mg/kg剂量对雄性SD大鼠进行尼日利亚菌素单次静脉内施用后,尼日利亚菌素显示出中等的血浆清除率(15.10mL/min/kg,大鼠中的正常肝血流=55mL/min/kg),平均消除半衰期为3.53小时。Vss比正常的全身水体积(0.7L/kg)高2.3倍。
口服:在以10mg/kg剂量对雄性SD大鼠单次口服施用尼日利亚菌素后,可定量血浆浓度直至24小时,其中Tmax为0.63小时。口服溶液生物利用度为2%。
腹膜内:在以2mg/kg剂量对雄性SD大鼠单次腹膜内施用尼日利亚菌素后,可定量血浆浓度直至24小时,其中Tmax为0.25小时。
图4描绘了来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素在雄性SD大鼠中单次静脉内(IV,剂量:2mg/kg)、腹膜内(IP,剂量:2mg/kg)和口服(PO,剂量:10mg/kg)施用后的平均血浆浓度-时间曲线。
采用三种不同的施用途径,即静脉内(IV)、口服(O)和腹膜内(IP),进行尼日利亚菌素的血浆药代动力学研究。基于上述研究,选择腹膜内施用途径研究尼日利亚菌素的毒代动力学特征。
实施例8:腹膜内施用后尼日利亚菌素在SD大鼠中的毒代动力学研究
采用14天重复腹膜内施用方案用尼日利亚菌素进行毒代动力学研究。雄性和雌性动物被分为三组,各组基于施用的尼日利亚菌素的剂量(0.5、1.5和5mg/kg/天)。各组每一天接受相同剂量的化合物施用,共14天。在第一次(即第1天)和最后一次(即第14天)施用尼日利亚菌素后,对毒代动力学参数进行定量,结果列于表3中。在第1天施用后,在所有三个剂量类别中,尼日利亚菌素在两种性别的动物的血浆中可定量直至24小时。在第14天第二剂量的施用后,在两种性别中,对于0.5mg/kg/天剂量类别的血浆浓度可定量直至8小时,和对于1.5mg/kg/天剂量类别的血浆浓度可定量直至24小时。然而,对于5mg/kg/天剂量类别,仅在雄性大鼠中尼日利亚菌素的血浆浓度可定量直至24小时,因为在第14天之前该类别中的雌性大鼠的情况中观察到死亡。
第1天和第14天各剂量的平均Tmax范围为0.08-0.42小时。但是,在这两天(即第1天和第14天)分别观察到了随剂量提高的血浆暴露量(AUClast)的剂量相关的提高。
在第14天之前,观察到5mg/kg/天下雌性动物组中的死亡。在两种性别中第14天的血浆浓度在0.5mg/kg/天下可定量至8小时和在1.5mg/kg/天下直至24小时,及在雄性大鼠中的0.5mg/kg/天剂量组。第1天和第14天各剂量的平均Tmax范围为0.08-0.42小时。但是,在这两天(即第1天和第14天)均观察到了随剂量提高的血浆暴露量(AUClast)的剂量相关的提高。
在雄性SD大鼠中第1天随着0.5-1.5mg/kg/天和1.5-5mg/kg/天的剂量提高,剂量暴露率(dose exposure ratio)分别为1.91和3.93;和第14天为3.89和4.26。雌性SD大鼠的剂量暴露率在第1天为5.91和2.33,和在第14天为2.89(0.5-1.5mg/kg/天)。重复腹膜内剂量施用后,在各个剂量和两种性别中未观察到累积趋势。在第14天,雄性SD大鼠的累积率(accumulation ratio)(AUClast)发现为0.44(0.5mg/kg/天)、0.90(1.5mg/kg/天)和0.98(5mg/kg/天),而雌性大鼠中的累积率为1.04(0.5mg/kg/天)和0.51(1.5mg/kg/天)。除第1天的0.5mg/kg剂量(雄性/雌性暴露率2.11)外,第1天和第14天的剂量中未观察到性别特异性的差异。发现第1天的雄性/雌性暴露率(AUClast)为2.11(0.5mg/kg/天)、0.68(1.5mg/kg/天)和1.15(5mg/kg/天),且第14天为0.90(0.55mg/kg/天)和1.21(1.5mg/kg/天)。从第1天到第14天,除了第1天的0.5mg/kg/天剂量类别的情况(其中雄性/雌性暴露率为2.11)外,未观察到明显的性别特异性的差异。表3列出了所有组的雄性/雌性暴露率(AUClast)值。
图5描绘了在第1天来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素(剂量:0.5、1.5和5mg/kg/天)的14天重复腹膜内施用后,雄性和雌性SD大鼠中的血浆浓度-时间曲线。
表3:雄性和雌性SD大鼠的平均毒代动力学参数(n=3)a。
a在第1天和第14天尼日利亚菌素的14天重复腹膜内施用(剂量:0.5、1.5和5mg/kg/天)。NC:未计算,因为样品由于动物死亡而丢失
以0.5、1.5和5mg/kg/天通过腹膜内途径连续14天每天一次施用于SD大鼠的尼日利亚菌素在0.5mg/kg/天下未导致异常临床征兆和在最高1.5mg/kg/天下未导致死亡。在最高存活剂量1.5mg/kg/天下不存在检眼镜检查、凝血、尿分析和网织红细胞计数上的测试项目相关的影响。5mg/kg/天在雌性中是致死的。
因此,在目前的研究条件下,可以得出结论,剂量≤1.5mg/kg的尼日利亚菌素不会导致任何临床不良反应。然而,超过5毫克/千克的剂量可能是致死的。
实施例9:
链霉菌MCC-0151合成的尼日利亚菌素的抗细菌活性
通过使用本发明方法由链霉菌属sp MCC0151合成的尼日利亚菌素被发现对革兰阳性微生物金黄色葡萄球菌(ATCC 29737)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、藤黄微球菌(ATCC11880)、蜡样芽孢杆菌(ATCC 11778)和单核细胞增多性李斯特氏菌(ATCC 19111)具有活性,最低抑制浓度(MIC)范围为250-500nM。图1(a)描绘了在来自链霉菌属sp.MCC-0151的不同浓度尼日利亚菌素下对金黄色葡萄球菌生长的抑制。图1(b)描绘了来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。
图1(c)描绘了sigma标准品尼日利亚菌素对金黄色葡萄球菌的抗细菌活性。
从本实验可以得到结论,由链霉菌MCC-0151合成的尼日利亚菌素具有优异的抗细菌效力。尼日利亚菌素对金黄色葡萄球菌的MIC为0.21μg/ml且MIC浓度为287.7nM。
实施例10:
链霉菌MCC-0151合成的尼日利亚菌素的抗疟活性
无性期的恶性疟原虫3D7株(由合作者小组赠予)在含有15mM HEPES、50mg/L硫酸庆大霉素、10mg/L次黄嘌呤、2g/L碳酸氢钠(Sigma-Aldrich)和2.5g/L AlbuMAX II(ThermoFisher Scientific)的RPMI1640中在2%血细胞比容与O+人红细胞(获自PoonaSerological Trust Blood Bank,Pune的血液)的标准条件下维持。使用5%的山梨醇(Sigma-Aldrich)对寄生虫进行同步以富集环状体阶段的寄生虫。简而言之,通过在25℃下以1000g离心5分钟收集恶性疟原虫培养物,并将寄生的RBC沉淀重新悬浮于5%的山梨醇中,随后在37℃下孵育10分钟。孵育后,在将寄生虫以2%的血细胞比容和2%的寄生虫血症(parasitemia)放回培养瓶之前,将细胞沉淀并用完全培养基洗涤。
分析通常以96孔平板的形式进行,且每孔使用2%的寄生培养物。尼日利亚菌素的储备溶液在DMSO中制备,因此使用0.5%的DMSO(相当于尼日利亚菌素处理样品中存在的DMSO)处理作为对照。在对于恶性疟原虫生长的最佳条件下进行60小时的分析培养,之后将培养样品用0.01%triton X裂解,并用SybrGreen I核酸染料染色以估计每一样品中寄生虫的相对生长。结果以生长抑制百分比报告,并进一步测试活性分子以确定化合物的IC50值。图2描绘了抑制红内阶段疟疾寄生虫生长的EC50值。“■”代表来自链霉菌属sp.MCC0151的尼日利亚菌素和“●”代表标准品尼日利亚菌素。所有样品的重复数n=3。从链霉菌属sp.MCC0151分离的尼日利亚菌素的抗疟疾EC50值为2.4nM。经测定尼日利亚菌素对恶性疟原虫的IC50为~0.986nM。
本发明的优点:
1.在本领域已知的格尔德霉素的商业生产过程中,作为污染物从吸水链霉菌中获得尼日利亚菌素,而本发明提供了一种从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,其中尼日利亚菌素是高产率的主要代谢物。
2.从本发明的链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法以高纯度产生33%的尼日利亚菌素。
3.从本发明的链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法可用于以显著更低的投资以工业规模生产尼日利亚菌素。
Claims (9)
1.一种用于从链霉菌属sp.MCC 0151合成尼日利亚菌素的方法,包括:
(i)在代谢物生产培养基中培养包含链霉菌属sp.MCC 0151的接种物;
(ii)以1:1的比率混合含有链霉菌属sp.MCC 0151细胞的所述代谢物生产培养基和乙酸乙酯以获得混合物;
(iii)对步骤(ii)中获得的所述混合物进行离心以获得上清液和包含尼日利亚菌素的乙酸乙酯提取物;
(iv)蒸发步骤(iii)中获得的所述乙酸乙酯提取物以获得干燥的粗提取物;
(v)通过柱色谱纯化步骤(iv)中获得的所述干燥的粗提取物以获得纯化的尼日利亚菌素,其中尼日利亚菌素以具有最高500mg/L浓度的高产率产生。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述接种物包含浓度范围为所述代谢物生产培养基体积的5%至10%的链霉菌属sp.MCC 0151。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述培养在28℃至32℃的温度范围内进行5-8天。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述柱色谱包括作为固定相的硅胶网和作为流动相的包含二氯甲烷和甲醇的梯度。
5.根据权利要求1所述的方法,其中所述代谢物生产培养基包含碳源、作为氮源的酵母抽提物、K2HPO4和MgSO4.7H2O。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述碳源选自淀粉。
7.根据权利要求1所述的方法,其中产生的所述尼日利亚菌素具有33重量%的产率。
8.根据权利要求1所述的方法,其中产生的所述尼日利亚菌素具有抗细菌和抗疟疾的性质。
9.一种微生物组合物,其包含浓度范围为代谢物生产培养基重量的5%至10%的登录号为MCC-0151的链霉菌属菌的生物纯培养物及合适的赋形剂。
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