JPH082907B2 - 新規免疫抑制剤 - Google Patents

新規免疫抑制剤

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JPH082907B2
JPH082907B2 JP1165524A JP16552489A JPH082907B2 JP H082907 B2 JPH082907 B2 JP H082907B2 JP 1165524 A JP1165524 A JP 1165524A JP 16552489 A JP16552489 A JP 16552489A JP H082907 B2 JPH082907 B2 JP H082907B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規免疫抑制剤「デメチムノマイシン」
（L-683,742:又は31−デスメトキシ−31−ヒドロキシ−
L-683,590）、その製造のための微生物アクチノプラナ
セテ種（Actinoplanacete sp.）（MA6559）、ATCC第537
71号を利用した新規醗酵法に関連する。本方法は、L-68
3,590のC31メトキシ基を脱メチル化する条件下にて、L-
683,590の存在下に微生物を培養する事を特徴とする。
更に又、自己免疫病、感染病の治療及び／又は臓器移植
拒否反応の予防のためのヒト宿主に対するその使用法に
ついても記述する。
1983年、米国FDAはシクロスポリンを認可した。これ
は非常に効果的な抗拒否反応剤であり、臓器移植外科の
分野に革命的な変化を与えた。この剤は、体免疫系が移
植による外部タンパク質を拒否するために、多量に蓄え
られた内因性の防御因子が可動するのを阻害する事によ
り作用する。
この剤は、臓器移植拒否反応を阻害するのに効果的で
あるけれども、多くの場合に非常に重い腎疾患、肝損傷
及び潰瘍を起こす欠点がある。
ここに引用するフジサワのEPO公告第0184162号には、
シクロスポリンよりも100倍効力があると評価される新
規マクロライド免疫抑制剤FK-506が記載されている。こ
のマクロライドは、ストレプトマイセス・ツクバエンシ
ス（Streptomyces tsukubaensis）の特定菌株の醗酵培
養により生産される。更に、S.ヒグロスコピクス亜種ヤ
クシマエンシス（S．hygroscopicus subsp.yakushimaen
sis)の生産する、近縁関連マクロライド免疫抑制剤、FK
-520についても記載がある。
T.アライの米穀特許第3,244,592号には、ストレプト
マイセス・ヒグロスコピクス変異体アスコマイセティク
ス(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyceticus)の
培養により抗カビ剤「アスコマイシン（ascomycin）」
が生産される事が記載されている。
しかしながら、いずれの免疫抑制剤製造の文献におい
ても、シクロスポリンの副作用を実質的に無くするとい
う記述はない。
副作用の少ない、新規で、より安全な薬剤が、本分野
で常にさがし求められている。
微生物アクチノプラナセテ種(Actinoplanacete sp.)
（MA6559）ATCCNo.53771をマクロライド免疫抑制剤L-68
3,590と共に、窒素栄養含有炭水化物培養液中、好気的
深部培養により得る事ができる事を発見した。この培養
条件は、L-683,590のC-31位を選択的に脱メチル化する
のに十分なpH約７で行なう。
得られた「デメチムノマイシン」は、免疫抑制活性を
有する。すなわちカルシウムイオノホア（イオノマイシ
ン）とホルボールミリステートアセテート（PMA）によ
り誘発するＴ−細胞刺激検定（本明細書では「Ｔ−細胞
増殖検定」ということもある。）で示されるＴ−細胞活
性化の阻害が陽性である。
本検定の原理はイオノマイシンとPMAの併用で刺激し
たマウスＴリンパ細胞の増殖を測定するものである。本
検定において陽性の試料は、Ｔ−細胞増殖を阻害する
が、これはトリチウム化したチミジンの取り込み減少で
示される。
本発明は、構造式（Ｉ） を有する新規化合物である。
更に本発明は、化合物（Ｉ）の治療上効果的な量及び
医薬的に許容される実質的に無毒性の担体又は賦形剤を
含んで成る免疫抑制剤である。
更に本発明は、窒素栄養源を含む水性炭水化物培養液
中、好気的深部培養条件下で、アクチノプラナセテ種の
菌株を構造式 を有する化合物と共に培養する段階を含んで成る、化合
物（Ｉ）の製造方法である。
更に本発明は、移植拒絶反応を防止するべくヒト宿主
を処置するのに有用な又は自己免疫疾患若しくは感染症
を治療するのに有用な免疫抑制剤を調製するために、化
合物（Ｉ）を使用する方法である。
更に本発明は、化合物（Ｉ）を含む、上記製造方法に
よって調製された発酵液である。
更に本発明は、上記製造方法によって製造された化合
物（Ｉ）である。
更に本発明は、Ｔ細胞増殖検定によるＴ細胞活性化の
陽性阻害（IC50約1.6〜1.9×10-9モル）を示し、且つ添
付の第１図に示されるプロトン核磁気共鳴スペクトルを
示す化合物である。
本発明に従い、窒素栄養含有炭水化物培養液中で、ア
クチノプラナセテ種（Actinoplanacete sp.）菌株をL-6
83,590と共に十分な時間好気的深部培養する工程から成
ることを特徴とする、「デメチムノマイシン」と称する
免疫抑制剤の製造方法が提供される。
更に、Ｔ−細胞増殖検定によるＴ−細胞活性化阻害が
陽性であり、別添の第１図に示すようなプロトン核磁気
共鳴スペクトルを有する新規免疫抑制剤「デメチムノマ
イシン」が提供される。
更に又、医薬的に許容される実質的に無毒性の担体又
は賦形剤と併用した、治療に効果的な量の「デメチムノ
マイシン」を含有する薬剤組成物が提供される。
加うるに、治療に効果のある量の「デメチムノマイシ
ン」を投与する事を特徴とする、移植拒否予防のために
ヒト宿主を治療し、又は自己免疫病もしくは感染病を治
療する方法が提供される。
本発明はL-683,590と共に、アクチノプラナセテ種(Ac
tinoplanacete sp.)MA6559を醗酵培養し「デメチムノマ
イシン」を生産する事を特徴とする。この微生物は現
在、American Type Culture Collection（メリーランド
州、ロックビル市パークローンドライブ12301）でATCC
第53771号として、またMerck Culture Collection（ニ
ュージャージー州、ローウェイ）でMA6559として、制限
寄託下にある。形態的、培養的、生物学的及び生理学的
特性を含む物理特性及び分類を以下に概設する。
今までに行なわれた分類学的分析に基づき、培養菌
は、アクチノマイセタレス(Actinomycetales)目、アク
チノプラナセア(Actinoplanacea)科に属するものと一時
的に同定された。更なる分類学的特性が属と種の中に本
微生物を位置づけるよう検討されている。
本培養菌は、トリプチカーゼ大豆寒天培地（28°及び
37℃）、イーストモルト抽出物寒天培地、グリセロール
アスパラギン寒天培地、無機塩デンプン寒天培地、オー
トミール寒天培地、Czapek Dox,Czapek溶液寒天培地、
ペプトン寒天培地及びBennett寒天培地（全て28℃）を
含む従来の培地上で良く増殖する。
形態学−本培養菌は直径0.2〜0.4ミクロンの分枝フィ
ラメント状菌糸体として増殖する。コロニーは不透明で
盛り上がり凹凸がある。コロニー構造は、イーストモル
ト抽出物寒天培地上では弾力性があるが、菌糸の有意な
分裂が観察される他の培地では牛酪様の傾向にある。コ
ロニー表面は外見上粉状の傾向にある。分散性色素は観
察されない。
胞子のう−胞子のうは、主として球状で直径４〜25ミ
クロンの範囲にある。胞子のうは一般には21日までに見
られ、グリセロールアスパラギン寒天培地上では融合す
る傾向にある。胞子は端が鈍な棒状であり（0.76×1.9
ミクロン）、運動性がなく、長くなり、長さ150ミクロ
ンまでは分枝しない。
MA6559の培養特性 イースト抽出物−モルト抽出物寒天培地（ISP培地２） 生長菌糸は透明〜黄色であり、好気菌糸は24〜72時間
で進展し淡黄色〜バラ桃色であり外見上粉状である。反
対側は褐色〜赤褐色である。
オートミール寒天培地（ISP培地３） 生長菌糸は透明〜黄色であり反対側は透明〜褐色であ
る。好気生長菌糸は白色〜淡バラベージュ色で外見上粉
状である。
無機塩−デンプン寒天培地（ISP培地４） 光生長、不完全好気的菌糸。生長菌糸は透明で、分裂
が多い。デンプンの透明化がコロニーの周囲で、７日経
過までに顕著となる。
グリセロールアスパラギン寒天培地（ISP培地５） 生長菌糸は透明〜黄色で、反対側は透明〜黄褐色であ
る。好気菌糸は粉状で白色〜バラ桃色である。
ペプチド−鉄−イースト抽出物寒天培地（ISP培地６） 生長菌糸は褐色である。好気的な増殖は認められず、
メラノイド色素は生産されない。
チロシン寒天培地（ISP培地７） 生長菌糸は褐色で培養が進むにつれて深紫色となる。
好気的菌糸はベルベット状〜灰色調バラ−ベージュ色で
ある。
Czapek-Dox寒天培地 生長菌糸は、培養が進むにつれて桃色調褐色である。
好気的菌糸は短く、もつれて、分泌物が発現する。
本発明の方法は多くのアクチノプラナセテ種(Actinop
lanacete sp.)の「デメチムノマイシン生産」菌株を用
いて実施できる。特にATCCNo.53771菌株が望ましい。
一般に「デメチムノマイシン」はデメチムノマイシン
物質生産菌株を同化できる炭素及び窒素源を含む栄養培
養液中で培養（醗酵）して製造する事ができるが、好気
的深部培養条件（例えば振とう培養、深部培養等）で行
なうのが望ましい。培養液は培養開始時及び終了時（収
穫時）のpHを約７に保つ事が望ましい。pHが高いと実質
的及び／又は全体の生成物が損失する。所望されるpHは
モルホリノエタンスルホン酸（MES）、モルホリノプロ
パンスルホン酸（MOPS）の如き緩衝液の使用又は以下に
示す生産培地の如き、固有に緩衝性を持つ栄養物を選択
する事により保つ事ができる。
栄養培地中で所望される炭素源はグルコース、キシロ
ース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキスト
リン等の如き炭水化物である。加える事のできる他の炭
素源はマルトース、ラムノース、ラッフィノース、アラ
ビノース、マンノース、サリチン、コハク酸ナトリウム
等である。
所望される窒素源は、イースト抽出物、牛肉抽出物、
ペプトン、グルテン粉、綿実粉、大豆粉及び他の野菜粉
（部分的又は全部脱脂）、カゼイン加水分解物、大豆加
水分解物及びイースト加水分解物、トウモロコシ浸出
液、乾燥イースト、小麦胚、羽粉、ピーナッツ粉、ジス
チラース・ソリューブルス等のみならず、アンモニウム
塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸等の如き無機及び
有機窒素化合物である。
炭素及び窒素源は利点を持って併用できるが、その純
粋な形で用いる必要がない。これは、完全に純粋でない
物質には、微量の増殖因子、かなりの量の無機栄養が含
まれており、これを使用するのが望ましいためである。
必要ならば、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナ
トリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、
ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅
塩、コバルト塩等の如き無機塩を培地に加える事ができ
る。必要なら特に培養培地がはげしく泡立つ場合、流動
パラフィン、脂油、植物油、鉱油、又はシリコンの如き
消泡剤を加える事ができる。
L-683,590の出発物質は、米国特許第3,244,592に記載
の如く、S.ヒグロスコピクス変異体アスコマイセティク
ス(S.hygroscopicus var.ascomyceticus)ATCCNo.14891
の醗酵培養、及びフジサワのEPO公告番号0184162（本特
定の目的のため参考文献としてここに引用）に記載の如
くS.ヒグロスコピクス亜種ヤクシマエンシス）(S.hygro
scopicus subsp.yakushimaensis)（L-683,590と同定す
るFR-900520又はFK-520を生産する）の醗酵培養により
得る事ができる。
大量にデメチムノマイシンを製造するための条件とし
て、好気的深部培養条件が望ましい。少量の製造には、
フラスコ又はビン中にて、振とう又は表面培養する。更
に、増殖を大型タンク中で行なう場合、デメチムノマイ
シン製造工程で、増殖の遅延を防ぐため、タンク中に接
種するための微生物の増殖物を用いるのが望ましい。し
たがって、最初比較的少量の培養液に、スラント中で生
産した微生物の胞子又は菌糸を接種し、この接種物、い
わゆる「種培地」を培養した後、培養増殖物を無菌的に
大量タンクに移すのが望ましい。接種菌を生産する培養
培地はデメチムノマイシンの製造に用いる培地と実質的
に同一か又は異なるものであり、一般的に接種に先だっ
て、オートクレーブで培地を殺菌する。培地のpHは一般
に、オートクレーブで殺菌する前に酸又は塩基を加えて
約7.0にするが、この場合緩衝液の形が望ましい。
培養混合物の撹拌と通気は種々の方法で行なう事がで
きる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌装置、ファ
ーメンターの回転又は振とう、種々のポンプ装置又は培
地への無菌空気の通風により行なう事ができる。通気
は、醗酵培養混合物に無菌空気を通風すると効果的であ
る。
醗酵培養は一般に約20℃〜40℃で行なわれるが、25〜
35℃が望ましく、約10時間〜20時間行なう。これは培養
条件と培養量により変化する。生産培養物は回転振とう
機で、220rpmにて、27℃で約17時間インキュベートす
る。この間、培地のpHは7.0に保って収穫する。
醗酵培養を行なうために望ましい培養／生産培地は以
下の培地である。種培地A g/l デキストロース 1.0 デキストリン 10.0 牛肉抽出物 3.0 アルダミンpH 5.0 NZアミンＥ型 5.0 MgSO4・7H2O 0.05 K2HPO4 0.37 pH7.1に調節 CaCO30.5g/lを加える。変換培地B g/l グルコース 10 ハイカーゼSF ２ 牛肉抽出物 １ トウモロコシ浸出液 ３ pH7.0に調節変換培地C g/l マンニトール ５ グリセロール ５ ハイカーゼSF ２ 牛肉抽出物 １ トウモロコシ浸出液 ３ pH7.0に調節 生産されたデメチムノマイシンは他の既知の生物活性
物質を得るのに一般に用いられている従来の方法で培養
培地から取り出す事ができる。生産されたデメチムノマ
イシンは培養菌体及び濾液中で検出される。したがって
菌体及び濾液から単離精製でき、培養液の濾過又は遠
心、従来の減圧濃縮、凍結乾燥、メタノールの如き従来
の溶媒による抽出、pH調節、従来の樹脂処理（例えば、
アニオン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂
等）、従来の吸着剤による処理（例えば、活性炭、ケイ
酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）、結晶化、
再結晶等により得られる。所望される方法は溶媒、特に
メタノールを用いた抽出である。
醗酵培養により得られるデメチムノマイシン生成物は
「Ｔ−細胞増殖検定」により免疫抑制活性を有し、これ
に基づき利用性があり、以下に示す物性を有する。
1.白色無定形粉末 2.メタノールに可溶 3.FABマススペクトルにより決定した分子量777（Ｍ＋Li
＝784を観察）は別添の図３の同定構造と合致し、L-68
3,590から14マス単位、CH2基の脱離に対応する。
同定したデメチムノマイシン構造（別添図３）の主要
なNMR特性は別添図２から別添図１へのメトキシシグナ
ルの消失である。3.1ppm近辺の特徴的化学シフトでH-31
共鳴の消失と関連する。OHと結合するCHは一般にCH-OCH
3に比べて0.1〜0.3ppm低磁場シフトするので、31メチル
が失われ、H-31が、H-13、H-21、H-33、残りのメトキシ
ル基を含む3.3-3.5ppmのマルチプレット中に移行したと
考えるのは妥当である。更にC-13又はC-15よりもむしろ
C-31のメトキシルが消失したものと帰属する根拠は、別
添図１のH-14及びH-15の化学シフトが別添図２における
親分子中のものと一致するという事実である。又、新し
い共鳴が観察されず、H-2からH-28のすべての認識可能
なプロトンシグナルが、事実上L-683,590のものと重ね
合わせられる事から、C-31脱メチル化が唯一の構造変化
と推定する事も妥当である。
上述の醗酵培養に従って得られたデメチムノマイシン
は、例えば、抽出、沈澱、分別結晶化、再結晶、クロマ
トグラフィー等の従来の方法により単離精製できる。
本物質の望ましい塩は、例えばアルカリ金属塩（例え
ば、ナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土類金属
塩（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）、アンモ
ニウム塩、アミン塩（例えばトリエチルアミン塩、Ｎ−
ベンジル−Ｎ−メチルアミン塩等）及び他の従来の有機
塩等の塩基性塩の如き医薬として所望される塩である。
前述の醗酵反応及び、そこでの醗酵混合物の後処理の
段階において、デメチムノマイシンの不整炭素又は二重
結合のため、幾何異性体及び／又は立体異性体が、場合
により、他の幾何異性体及び／又は立体異性体に変換す
る事があり、この場合も本発明の態様の範囲内にある事
に注意されたい。
本発明のデメチムノマイシンは免疫抑制活性、抗菌活
性等の如き薬理学的活性を有する。それ故、心臓、腎
臓、肝臓、骨髄、皮膚等の如き臓器又は組織移植拒否反
応、骨髄移植による移植−対−宿主病、リウマチ関節
炎、全身紅斑性狼瘡、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化
症、重症性筋無力症、Ｉ型糖尿病、葡萄膜炎等の如き自
己免疫病の予防及び治療に有用である。
本発明の薬剤組成物は、例えば、固形、半固形、液体
の如き製剤形で用いる事ができ、活性成分としてその中
に本発明のデメチムノマイシンを、内用又は外用薬に望
ましい有機又は無機担体又は賦形薬と混合して用いる事
ができる。活性成分は例えば、一般に用いられる無毒性
薬剤担体と混合して錠剤、丸剤、カプセル、坐薬、溶
液、乳剤、懸濁剤及び他の望ましい形にする事ができ
る。用いる事のできる担体は水、グルコース、乳糖、ア
ラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペース
ト、マグネシウムトリシリケート、タルク、トウモロコ
シデンプン、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトデン
プン、尿素及び製剤を製造するのに望ましい他の担体の
如き、固形、半固形、又は液体形であり、更に補助剤、
安定剤、濃厚化剤及び着色剤及び香料を用いる事ができ
る。本活性化合物は病気の過程又は症状に望ましい効果
を得るのに十分な量を薬剤組成物中に含有せしめる。
本組成物をヒトに適用するためには、非経口的又は経
腸的に適用するのが望ましい。治療効果のある量のデメ
チムノマイシンの投与量は、治療する個々の患者の年
令、及び症状に依存して変化するのが、一般に活性成分
の１日投与量は70kgのヒトに基づいて計算すると、病気
の治療に約0.01〜1000mgであり、0.1〜500mgが望まし
く、0.5〜100mgを投与するのが更に望ましい。一般に約
0.5mg、1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、250mg、及び500
mgの平均の単一投与量で投与する。
以下の実施例は本発明を例示する目的で示すものであ
り、本発明の態様と精神を限定するものと解釈すべきで
はない。
実施例１ 微生物及び培養条件 オートクレーブで滅菌した、デキストリン10.0％、デ
キストロース1.0％、牛肉エキス3.0％、アルダミンpH
（イーストプロダクト社）5.0％、N-ZアミンＥ型5.0
％、MgSO4・7H2O 0.05％、KH2PO4 0.37％、及びCaCO3
0.5％（グラム単位/l）から成る50mlの種培地を入れた2
50mlバッフルを付けた振とう用フラスコに、凍結乾燥し
た培養菌（MA6559）ATCCNo.53771を用いて接種した。オ
ートクレーブ前に種培地のpHを7.1に調節した。回転振
とう機上、220rpmにて、27℃で48時間種菌を培養した。
あるいは又、凍結した成長菌糸又はスラント源を用いる
場合は、培養は220rpmにて27℃で24時間インキュベート
する。得られた種培養物を2.5mlずつ、あらかじめオー
トクレーブで滅菌した変換培地B50mlを入れたバッフル
を付けない250mlの振とう用フラスコ中に接種した。最
終濃度を0.1mg/mlになるように、L-683,590をジメチル
スルホキサイド溶液として加え入れた。続いて、振とう
フラスコを回転振とう機上220rpmにて18時間27℃でイン
キュベートした。
1.変換培地Ｂはグルコース10.0、ハイカーゼSF2.0、
牛肉抽出物1.0、トウモロコシ浸出液3.0（グラム／リッ
トル）から成り、オートクレーブで滅菌前にpHを7.0に
調節した。
培養濾液からの単離及び精製 変換培地Ｂの培養濾液全体（100ml）をメチレンクロ
ライドで３回抽出した（３×100ml）。メチレンクロラ
イド抽出液を合併し、硫酸ナトリウムで乾燥後真空下濃
縮して油状残渣を得た。残渣をアセトニトリルに溶か
し、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）で精製した。
HPLCは、Whatman Partisil 10 ODS-3、9.4mm×25cmカ
ラムを用い、205nm及び225nmで60℃にてモニターした。
カラムは30分間で0.1％ H3PO4水−CH3CN、45:55から0.1
％ H3PO4水−CH3CN 20:80まで直線濃度こう配にて展開
した。上述抽出物をくり返し注入して化合物を分取し
た。保持時間24分の分画を集めpH6.5に調節後アセトニ
トリルを留去した。更に、C18Sep-Pak（Waters Associa
tion）を用い、アセトニトリル−水流出液にて化合物を
精製しL-683,742、「デメチムノマイシン」と命名した
生成物を1.4mg得た。変換培地Ｃを用いても同様の結果
を得た。
特性化 デメチムノマイシンは、NMRスペクトロメトリーによ
り、特性化し、別添図１のNMRスペクトルを得た。帰属
分子構造を別添図３に示す。
実施例２ Ｔ−細胞増殖検定 1.試料調製 上述HPLCで製造した精製デメチムノマイシンを1mg/ml
濃度で無水エタノールに溶かした。
2.検定 C57B1/6マウスの脾臓を無菌的に取り、10％熱処理不
活性化牛胎児血清（GIBCO,Grand Island,N.Y.）を加え
た氷冷RPMI1640培地（GIBCO）中に、静かに分散させ
た。1500rpmにて８分間遠心し細胞をペレット状にし
た。ペレットを塩化アンモニウム分解緩衝液（GIBCO）
と４℃、２分間処理し、混在する赤血球細胞を除いた。
冷却培養液を加え、細胞を再び1500rpmにて８分間遠心
した。次に、以下に示すナイロンウールカラムにて細胞
懸濁液を分離し、Ｔ−リンパ球を単離した。ナイロンウ
ールカラムは20mlのプラスチックシリンジ中に約4gの洗
浄し乾燥したナイロンウールを充てんして作製した。カ
ラムは250゜F、30分間オートクレーブにて滅菌した。ナ
イロンウールカラムを加温した（37℃）培地で湿らせ、
同じ培地でゆすいだ。加温した培地中に再び懸濁させた
洗浄脾臓細胞をナイロンウールカラムにゆっくり乗せ、
37℃で１時間、垂直にしてインキュベートした。非吸着
Ｔリンパ球が加温培地によりカラムから流出した。細胞
懸濁液を上述の如く遠心した。
精製したＴリンパ球を10％熱処理不活性化牛胎児血
清、100mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、２×
10-5M 2−メルカプトエタノール及び50μg/mlゲンタマ
イシン含有のRPMI1640培地から成る完全培地中に2.5×1
05細胞/mlで再び懸濁させた。イオノマイシンを250ng/m
l、PMAを10ng/ml加えた。細胞懸濁液をすぐに96穴の平
板底マイクロカルチャープレート（Costar）に200μl/
穴ずつ分配した。対照としての検定薬物のない培養液及
び検定すべき以下に示す試料の種々の希釈物（上述の精
製デメチムノマイシン）を20μl/穴で３穴ずつトリプリ
ケートで加えた。L-679,934を基準として用いた。培養
プレートを５％CO2-95％空気の湿潤環境下、37℃で44時
間インキュベートした。Ｔリンパ球の増殖はトリチウム
化チミジンの取り込みの測定で調べた。44時間培養後、
細胞をトリチウム標識チミジン（NEN,Cambridge,MA）で
２μCi/穴ずつパルス標識した。さらに４時間インキュ
ベート後、マルチプル試料収集機を用い、グラスファイ
バー濾紙上に培養物を集めた。個々の穴に対応する濾紙
ディスクの放射活性を基本的液体シンチレーション測定
法により測定した（ベータカウンター）。重複して検定
した穴毎の１分間のカウント数（cpm）の平均を計算
し、結果は以下の如くトリチウム化チミジン取り込み
（増殖）のパーセント阻害として表わした。
デメチムノマイシンの種々の濃度での％阻害の結果を
以下の表に示す。
注1.マウスＴ細胞培養物は48時間後に収集する前の４時
間前に3H−チミジンでパルス標識した。
2.基準のL-679,934（10ng/ml）は99％阻害を示した。
3.デメチムノマイシン、（L-683742）はIC50＝1.4ng/ml
＝1.81nM。一般には1.6〜1.9×10-9モルの範囲である。
4.デメチムノマイシンによるＴ−細胞増殖阻害は培養開
始時に50μ/mlのIL-2（遺伝子組換えにより作製した細
胞系により出来たIL-2）を添加すると逆転する。
【図面の簡単な説明】
第１図はCDCl3中400MHzで測定した「デメチムノマイシ
ン」の1H核磁気共鳴（NMR）スペクトルである。 第２図はCDCl3中400MHzで測定したL-683,590の1H NMRス
ペクトルである。 第３図は同定した「デメチムノマイシン」の分子構造で
ある。
フロントページの続き (72)発明者 バイロン エツチ．アリソン アメリカ合衆国，07060 ニユージヤーシ イ，ウオツチユング，センチユリー レー ン 88 (72)発明者 リンダ エス．ウイカー アメリカ合衆国，07090 ニユージヤーシ イ，ウエストフイールド，アロウウツド ドライブ 2096

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】窒素栄養含有炭水化物培養液中、好気的深
    部培養条件下、 構造式 を有する化合物と共に、アクチノプラナセテ種菌株を充
    分な時間培養する工程から成ることを特徴とする、構造
    式 を有する化合物の製造方法。
  2. 【請求項２】上記微生物がATCC第53771号である請求項
    １記載の方法。
  3. 【請求項３】上記培地が、グルコース、ハイカーゼSF、
    牛肉抽出物、及びトウモロコシ浸出液を含有する、培地
    Ｂと称する発酵培地である請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】上記培地が、マンニトール、グリセロー
    ル、ハイカーゼSF、牛肉抽出物、及びトウモロコシ浸出
    液を含有する培地Ｃと称する発酵培地である請求項１記
    載の方法。
  5. 【請求項５】構造式 を有する化合物を含有する、請求項１記載の方法により
    得られた発酵液。
  6. 【請求項６】請求項１記載の方法により生産された構造
    式 を有する化合物。
  7. 【請求項７】Ｔ−細胞増殖検定によるＴ−細胞活性化阻
    害が陽性、すなわちIC50が約1.6〜1.9×10-9モルであ
    り、別添の第１図に示すようなプロトン核磁気共鳴スペ
    クトルを有し、 構造式 によって示される分子構造を有する化合物。
  8. 【請求項８】構造式 によって示される分子構造を有する化合物。
  9. 【請求項９】医薬的に許容される実質的に無毒性の担体
    又は賦形剤と併用した、治療に効果的な量の構造式 を有する化合物を含有する免疫抑制剤。
  10. 【請求項１０】移植拒絶反応を防止するべくヒト宿主を
    処置するのに有用な又は自己免疫疾患若しくは感染症を
    治療するのに有用な免疫抑制剤を調製するために構造式 を有する化合物を使用する方法。
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