JPH0753735B2 - 新規免疫抑制剤 - Google Patents

新規免疫抑制剤

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JPH0753735B2
JPH0753735B2 JP2062848A JP6284890A JPH0753735B2 JP H0753735 B2 JPH0753735 B2 JP H0753735B2 JP 2062848 A JP2062848 A JP 2062848A JP 6284890 A JP6284890 A JP 6284890A JP H0753735 B2 JPH0753735 B2 JP H0753735B2
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メルク エンド カムパニー インコーポレーテツド
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ストレプトマイセス ヒグロスコピクス 亜
種 アスコマイセティクス（Streptomyces hygroscopic
us subsp.asco-myceticus）（MA6475）、ATCC No.14891
の変異化菌株ストレプトマイセスヒグロスコピクス亜種
アスコマイセティクス（Streptomyces hygroscopicus s
ubsp.ascomyceticus）（MA6646,ATCC No.53855）の醗酵
により生産される新規免疫抑制剤Ｌ−687,819に関連す
る。本方法は窒素栄養含有の炭水化物培養液中、好気的
条件下、新規微生物を培養するものである。
1983年、米国FDAは、臓器移植手術の分野で革命を起こ
した非常に効果のある抗拒否剤であるシクロスポリンを
認可した。本薬剤の作用は、移植外部タンパク質を拒否
するために体免疫系が天然の防御因子の貯蔵を用意する
のを阻害するものである。
本薬剤は移植拒否と戦うのに効果的であるが、腎疾患、
肝損傷及び潰瘍を引き起こし、多くの場合、重篤な状態
となる欠点を有する。
本出願に参考文献として引用するフジサワ（Fujisawa）
のEPO Publication No.0184162において、シクロスポリ
ンよりも100倍活性があると云われる新規マクロライド
免疫抑制剤FK-506についての記載がある。構造的に関連
したFK-525のみならず、本マクロライドは特定菌株スト
レプトマイセス ツクバエンシス（Streptomyces tsuku
baensis）の醗酵により生産される。更に又、S.ヒグロ
スコピクス亜種ヤクシマエンシス（S.hygroscopicus su
bsup.yakushimaensis）の生産する関連マクロライド免
疫抑制剤FK-520及びFK-523についての記載もある。
T.アライ（T.Arai）に対するUSP3,244,592においては、
抗真菌剤「アスコマイシン」を生産するストレプトマイ
セス ヒグロスコピクスvar.アスコマイセティクス（St
reptomyces hygroscopicus var ascomyceticus）の培養
についての記載がある。
S.T.Chen,E.S.Inamine,B.H.Arison,L.S.Wicker（Merk
＆ Co.Inc.）等による、本出願で参考文献として引用す
る米国特許出願番号213,025 Docket 17767）において、
Ｌ−683,590の存在下、菌株アクチノプラナセテ Sp.
（Actinoplanacete Sp.）（MA6559）,ATCC No.53771の
培養によりＬ−683,590を微生物変換させて生産した新
規免疫抑制剤である「デメトイムノマイシン」（「deme
thimmunomycin」）Ｌ−683,742（Ｌ−683,590のＣ−31
脱メチル化同族体）について記載されている。
しかしながら、Ｌ−687,819の製造文献中、Ｌ−683,795
（FK-523）のＣ−31脱メチル化誘導体であるとの記述は
されていない。
本分野において、FK-506に構造関連した新規マクロライ
ド免疫抑制剤が探し求められている。
本免疫抑制剤Ｌ−687,819はATCC No.14891（MA6475）を
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンで
変異化処理して得た変異株、ストレプトマイセス ヒグ
ロスコピクス亜種アスコマイセティクス（Streptomyces
hygroscopicus subsp.ascomyceticus）（MA6646）の醗
酵により直接得られる。醗酵はマクロライド免疫抑制剤
Ｌ−683,795（FK-523）の存在を必要とせず、窒素栄養
含有の炭水化物培養液中、深部好気的培養条件下で行な
う。本培養は、pH 8.0以下、例えば約７でＬ−683,795
（FK-523）のモノ−Ｃ−31脱メチル化物であるＬ−687,
819を生産せしめるのに十分な時間かけて行なう。
得られたＬ−687,819は免疫抑制活性を有する。すなわ
ち本出願において、「Ｔ細胞増殖検定」として言及され
ている。カルシウムイオノホア（イオノマイシン）及び
ホルボールミリステートアセテート（PMA）併用誘発の
Ｔ細胞刺激検定により示された如く、Ｔ細胞活性化の阻
害が陽性である。本検定の原因は、イオノマイシン及び
PMAを併用して刺激したマウスＴリンパ球の増殖を測定
するものである。本検定において陽性試料は、トリチウ
ム標識チミジンの取り込みの減少で明らかなようにＴ−
細胞増殖を阻害する。
本発明において、菌株ストレプトマイセスヒグロスコピ
クス亜種アスコマイセティクス（Streptomyces hygrosc
opicus subsp.ascomyceticus）（MA6646）ATCC No.5385
5を、窒素栄養含有水性炭水化物培養液中、深部好気的
培養条件下で十分な時間培養して生産された新規免疫抑
制剤Ｌ−687,819を提供する。Ｌ−687,819は電子衝撃マ
ススペクトル法により決定された分子式C41H65NO12（C
41H65NO12＋T4,T＝SiC3H8として計算値1051.6088、実測
値1051.6089）を有し、図１に示す如きプロトン核磁気
共鳴スペクトルを有する。
本発明はＬ−687,819を製造するためのストレプトマイ
セスヒグロスコピクス亜種アスコマイセティクス（Stre
ptomyces hygroscopicus subsp.ascomyceticus）ATCC N
o.53855の醗酵を含む。本微生物は米国メリーランド州
ロックビル市パークローン通り12301のAmerican Type C
ulture Collectionに1989年１月12日、ATCC No.53855と
して記録された制限寄託物であり、ニュージャージー州
ローウェイ市のMerk Culture CollectionにMA6646とし
て現在記録されている。本微生物の形態学的、培養学
的、生物学的及び生理学的特性を含む物理的特性及びタ
キソノミーを以下に示す。
菌株MA6646 顕微鏡観察 枝分れフィラメント様菌体。
直径0.6ミクロン、胞子体は短く、密集したラセン形。
オートミール寒天培地 栄養増殖：裏面：灰〜白色 気生集団：豊富で鈍い灰色〜黒色 可溶性色素：なし グリセロール−アスパラギン 栄養増殖：裏面：灰白色、半透明 前面：灰白色、半透明 へりは、でこぼこ 気生菌糸：希薄な灰白色、粉状 可溶性色素：なし 無機塩−デンプン寒天 栄養増殖：裏面：クリーム色〜黄色 気生集団：豊富でベルベット状、淡灰色〜黒色 気生菌糸：白色、ベルベット状 可溶性色素：なし イースト抽出物−モルト抽出物 栄養増殖：裏面：灰色〜黄色 気生集団：豊富で明〜中灰色、鈍く綿状 可溶性色素：なし 炭水化物利用パターン ｄ−グルコース＋＋ ｄ−マルトース＋ シュークロース− ｄ−アラビノース＋／− ｄ−マンニトール＋＋ ｄ−キシロース＋＋ ｌ−アラビノース＋／− ｄ−マンノース＋＋ ｌ−キシロース− ｄ−フルクトース＋＋ ｌ−マンノース− アルファｄ−ラクトース＋＋ ｌ−グルコース− ｄ−ラフィノース− ベータｄ−ラクトース＋＋ イノシトール＋／− ｌ−ラムノース＋＋ ＋＋は実質的増殖；＋は緩和な増殖；＋／−は僅かに増
殖；−は増殖しないことを示す。
多くの「Ｌ−687,819−生産」変異株 ストレプトマイセスヒグロスコピクス亜種アスコマイセ
ティクス（Streptomyces hygroscopicus subsp.ascomyc
eticus）を用いて本発明の工程を実施できるが、特にAT
CC No.53855菌株が望ましい。
一般には、Ｌ−687,819は上述の「Ｌ−687,819生産菌
株」を、同化できる炭素及び窒素源を含む栄養培養液
中、深部好気的条件下（例えば、振盪培養、深部培養
等）で培養（醗酵）して製造することができる。培養液
は醗酵工程の開始時及び終了時（採取時）にpHを約７に
保つことが望ましい。pHが高いと、実質的及び／又は全
体的な生成物の損失につながる。望ましいpHは、モルホ
リノエタンスルホン酸（MES）、モルホリノプロパンス
ルホン酸（MOPS）等の如き緩衝剤を用いて保持させる
か、又は以下に示す生産培地の如き緩衝性を本来から持
つ栄養物を選んで望ましいpHを保つ。
栄養培地中の所望な炭素源は、グルコース、キシロー
ス、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキストリ
ン等の如き炭水化物である。使用できる他の炭素源は、
マルトース、ラムノース、ラフィノース、アラビノー
ス、マンノース、サリチン、スクシン酸ナトリウム等で
ある。
好ましい窒素源は、イースト抽出物、肉抽出物、ペプト
ン、グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール、及び他
の野菜ミール（部分的又は全体に脱脂）、カゼイン加水
分解物、大豆加水分解物、イースト加水分解物、トウモ
ロコシ浸出液、乾燥イースト、麦芽、羽毛ミール、ピー
ナツ粉、醸造家の可溶成分のみならず、アンモニウム塩
（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン
酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸等の如き無機及び
有機窒素化合物である。
炭素及び窒素源は併用するのが好ましいものであるが、
その純粋なものを使用する必要はない。これは微量の増
殖因子、適量のミネラルを含む不純物を使用するのが望
ましいためである。必要ならば、培養液中に炭酸ナトリ
ウム又はカルシウム、リン酸ナトリウム又はカリウム、
塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ化ナトリウム又はカ
リウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩の如きミネ
ラルの塩を加えることことができる。もし必要ならば、
特に培地がはげしく泡立つ場合、流動パラフィン、脂
油、植物油、鉱油、又はシリコンの如き消泡剤を加える
ことができる。
大量のＬ−687,819を生産させるための条件として深部
好気的培養条件が望ましい。少量の生産にはフラスコ、
ビン、又は培養皿にて振盪又は表面培養を用いる。更
に、増殖を大きいタンク中で行なう場合はＬ−687,819
の生産工程で増殖の遅れを防ぐため、生産用タンク中に
接種する微生物の発育形（vegetative form）を用いる
ことが望ましい。したがって、スラント中に生成した微
生物の胞子又は菌糸を比較的少量の培養液に接種するこ
とにより最初に発育接種物、いわゆる「種培地」を作
り、次に培養した発育接種物を無菌的にタンク中に移す
ことが望ましい。接種物を作る醗酵培地はＬ−687,819
の製造で用いる培地と実質的に同じか、又は異なるもの
であり、一般には接種前に培地を滅菌するのにオートク
レーブを用いる。培地のpHは一般にオートクレーブ工程
の前に、酸又は塩基を加えて約7.0に調節するが緩衝液
の形が望ましい。
培養混合物の撹拌及び通気は種々の方法で行なうことが
できる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌、ファー
メンターの回転又は振盪、種々のポンプ装作又は培地へ
の無菌的な通気により行なうことができる。通気は醗酵
混合物中に無菌空気を通ずると効果的に行なえる。
醗酵は、一般に、約20℃〜40℃（25〜35℃が望ましい）
で、48時間〜96時間行なうが、醗酵条件及び用いたスケ
ールにより変化させることができる。生産培地は回転振
盪機上、27℃で96時間インキュベートし、醗酵培地のpH
を採取するまで7.0に保つことが望ましい。
実施のための好ましい培養／生産培地は以下の培地であ
る。種培地Ａ g/リトッル グルコース 20.0 Difcoイースト抽出物 20.0 ハイカーゼSF 20.0 KNO3 2.0 FeSO4・７H2O 0.025 NaCl 0.5 MgSO4・７H2O 0.5 MnSO4・７H2O 0.005 ZnSO4・７H2O 0.01 CaCl2・７H2O 0.02 製造培地Ａ g/リトッル グルコース 22 グリセリン 25 トウモロコシ浸出液 10 Difcoイースト抽出物 25 乳酸 ２ Ｌ−チロシン ４ MOPS 10 CaCO3 0.25 pHを6.8に調節 生産されたＬ−687,819は、他の既知の生物活性物質を
取るのに一般に用いられている従来の方法を用いて培地
中から単離できる。生産されたＬ−687,819物質は、培
養菌体及び液中に発見される。したがって培養培地の
過又は遠心により得られる菌体及び液の減圧濃縮、
凍結乾燥、メタノールの如き従来から用いている溶媒で
の抽出、pH調節、従来の樹脂処理（例えば、アニオン又
はカチオン樹脂、非イオン性吸着樹脂等）、従来の吸着
剤（例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロー
ス、アルミナ等）、結晶化、再結晶等の方法により単離
精製できる。望ましい方法は溶媒、特にメタノールを用
いた抽出法である。
醗酵により生産されたＬ−687,819はＴ細胞増殖検定で
調べた結果、陽性の免疫抑制作用を有し、これに基づく
利用性がある。Ｌ−687,819は以下の物性を持つ。
1.白色無定形粉末 2.メタノールに可溶 3.電子衝撃マススペクトル法で決定した分子式C41H65NO
12，C41H65NO12＋T4（T4＝SiC3H8）として計算値、105
1.6088;実測値、1051.6089。これは図３に示す分子構造
に一致。上述の如く醗酵工程で得られるＬ−687,819は
例えば、抽出、沈澱、分別結晶化、再結晶、クロマトグ
ラフィー等により単離精製できる。
例えばアセテートの如き分子の水酸基を用いて形成し
た、従来の医薬として望ましい、Ｌ−687,819の生物体
内不安定エステルも本物質の望ましい形である。
前述の醗酵反応及び醗酵混合物の後処理におけるＬ−68
7,819の互変異性体及び構造異性体も本発明の態様内に
あることに注意されたい。
本発明のＬ−687,819は免疫抑制活性、抗菌活性の如き
薬理活性を有する。したがって、心臓、腎臓、肝臓、骨
髄、皮膚等の臓器及び組織移植の拒否反応、骨髄移植に
よる移植−対−宿主疾患、リュウマチ関節炎、全身性紅
斑性狼瘡、橋本甲状腺炎、多発性硬化症、重症性筋無力
症、タイプ工糖尿病、葡萄膜炎等の自己免疫病の治療及
び予防に有益である。
本発明の薬剤組成物は、本発明のＬ−687,819を活性成
分として含有し、外用、内服用又は注射用に用いるのに
望ましい有機又は無機担体又は賦形剤と混合した固形、
半固形又は液剤の如き薬剤形で用いることができる。活
性成分は、例えば錠剤、ペレット、カプセル、カプセ
ル、坐薬、溶液、乳剤、懸濁剤、及びその他の使用に望
ましい形態のための、一般に用いられる無毒性の医薬と
して望ましい担体と混合できる。使用できる担体は、
水、グルコース、乳糖、アラビアゴム、ゼラチン、マン
ニトール、デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、
タルク、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド状
シリカ、ポテトデンプン、尿素、工業製品に用いるのに
望ましいその他の担体であり、固形、半固形、又は液体
形の担体である。加えて、補助剤として安定剤、濃厚化
剤及び着色剤、香料を用いることができる。活性の、本
目的化合物は疾病の状況又は症状に対して望ましい効果
が得られるよう十分な量の薬剤組成物中に含有される。
本組成物をヒトに投与する場合、注射又は内服投与が望
ましい。Ｌ−687,819の治療効果が得られるための量
は、年令、治療をほどこす患者の症状に依存して変化す
るが、一日の投与量は（70kgの人に基づいて計算する
と）活性成分が約0.01-1000mgであり、0.1-500mgが望ま
しく、0.5-100mgを治療する疾病に与えるのが一般には
最良である。一般に１回の平均投与量は0.5mg,1mg,5mg,
10mg,50mg,100mg,250mg及び500mgを投与する。
以下の実施例は本発明を例示する目的で示したものであ
り、本発明の態様又は精神を限定するものと解釈すべき
ではない。
実施例１ 培養条件 KNO3、0.2％；ハイカーゼSF、２％;difcoイースト抽出
物、２％；グルコース、２％；FeSO4・７H2O、0.0025
％;NaCl、0.05％；MgSO4・７H2O、0.05％；MnSO4・７H2
O、0.0005％；ZnSO4・７H2O、0.001％；CaCl2・２H2O、
0.002％からなる44mlのオートクレーブ滅菌種培地を入
れた250mlバッフルエーレンメイヤーフラスコにMA6646
を接種して醗酵を行なった。Bennett培地からMA6646（A
TCC No.53855）の胞子を取り種培地に接種し、回転振盪
機上220rpmにて42-48時間27℃でインキュベートした。
オートクレーブ前にNaOHでpH 6.8に調節した、グリセリ
ン2.5％；グルコース2.2％；トウモロコシ浸出液１％;D
ifcoイースト抽出物1.5％；乳酸0.2％（v/v）;L−チロ
シン0.4％;MOPS 1％；CaCO30.025％からなる製造培地の
入ったバッフルしてないエーレンメイヤーフラスコ中に
上述で出来た種培養菌を1.0mlずつ加えて接種した。製
造培地を回転振盪機上220rpmにて27℃で96時間インキュ
ベートした。培養液と同量のメタノールを加え、エーバ
ーバッハ（Eberbach）往復振盪機上高速で30分間撹拌
し、次に遠心してメタノール抽出を行なった。水性メタ
ノール性抽出液をTLC及びHPLCで分析した。
逆相HPLC（Whatman Partisil 5 ODS−３、0.1％水性H3P
O4：CH3CN、40:60、1ml/分）により全抽出物の主要成分
の保持時間は7.79分であり、どれもHPLCの保持時間とTL
CのRfが同一であり、31-デスメチル-Ｌ-683-590（Ｌ−6
87,819）であった。
保持時間6.98分に副成分を認めた。副成分は半プレパラ
ティブ逆相オクタデシル（C18）HPLCカラム（RAININTMD
ynamax C−18カラム）にて単離した。６本の、変異株振
盪フラスコ培養物を同量のメタノールで抽出し、遠心
し、上清を留去してメタノールを除いた。得られた水相
を酢酸エチルで２回抽出し、窒素気流下留去した。残渣
をメタノールに再懸濁させ、50マイクロリットルずつ半
プレパラティブカラムに注入した。溶媒系は0.1％水性H
3PO4：CH3CN（50:50）であり、流速は4ml/分であった。
12.5分に流出した巾広ピークを1mlずつのフラクション
に取り、MOPS緩衝液でpH 6.0にした。試料をＴ細胞増殖
（IL−２）検定を用い、免疫抑制活性を有することが判
明した。
実施例２ プレパラティブ単離 多量の物質を生産せしめるため、実施例１の醗酵法を大
規模で行なった。遠心して、培養固形物を45リットルの
培養液から除去した。得られた固形物をメタノールで２
回（１回１リットル）抽出した。培養液は1/2量の酢酸
エチル（20リットル）で抽出し、得られた酢酸エチル抽
出液を培養固形物抽出液と合併し、フラッシュエバポレ
ーターにて減圧下、有機溶媒を除去し水性懸濁液を得
た。水性懸濁液を蒸留水で最終容量1.5リットルに希釈
し、同量の酢酸エチルで抽出した。次に酢酸エチル抽出
物を蒸留水で洗浄し、水溶性不純物を除去した。洗浄し
た酢酸エチル抽出液をフラッシュエバポレーターで減圧
下溶媒留去し、55.3グラムの粗活性抽出物を得た。
粗活性抽出物をシリカゲル（Aldrich Chemical,＃24398
−１、グレード62、60-200メッシュ）の５リットルカラ
ムにより、ヘキサン：アセトン（3:1）でクロマトグラ
フィーを行なった。試料をカラムに乗せた後、同じ溶媒
でベッド容積２回分でカラムを洗浄し、次にヘキサン：
アセトン（11:9）で流出させ、２リットルずつ分取りし
た。目的化合物含有の画分10-14を合併し、減圧濃縮し
て4.05グラムの濃含有物を得た。本品をシリカゲル−60
（E.Merk、＃9385,230-400メッシュ）の１リットルカラ
ムにて、ヘキサン：アセトン（11:9）を用いた再カラム
クロマトグラフィーにて精製した。試料をカラムに乗せ
た後、同じ組成の溶媒で25ml/分にて流出させた。240ml
ずつ分画し、流出画分22-40に濃含有物を認めた。これ
らの画分を合併し、留去して2.91グラムの油状残渣を得
た。プレパラティブ逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）により、更に精製を行なった。約100ミリグラ
ムの濃含有物を1mlのメタノールに溶かしRainin Dynama
x-C18カラム、21.4×250mmを用い、アセトニトリル：水
（3:2）で10ml/分にて流出し、205nmの吸光度で検出す
るクロマトグラフィーを60℃で２回に分けて行なった。
クロマトグラフィー分離では、15mlずつ分画した。画分
９−11に目的化合物が含有し、これを合併して減圧濃縮
した。残渣について上述と同一のカラムを用い、アセト
ニトリル：水（1:1）で10ml/分にて流出するクロマトグ
ラフィーを60℃で再度行なった。この条件下、42〜48分
に目的化合物が流出した。このピークの中心画分の留去
により目的化合物を高純度で2.7mg得た。白色無定形固
形物。
本生成物のCDCl3中におけるプロトンNMRスペクトルを図
１に示す。ケミカルシフトはテトラメチルシランを基準
とするPPM（デルタ）で表わした（TMS＝０、PPM）。残
存の溶媒プロトンを内部標準として用いた（7.24 PP
M）。本生成物のCDCl3中での炭素−13NMRスペクトルを
図２に示す。ケミカルシフトはテトラメチルシランを基
準にしたPPM（デルタ）で表わした（TMS＝0ppm）。溶媒
の炭素共鳴シグナルを内部標準として用いた（77.0PP
M）。目的化合物のテトラ−（トリメチルシリル）−誘
導体の高分解電子衝撃マススペクトルでは分子イオン10
51.6089を与えた（C41H65NO12＋T4、T4＝SiC3H8として
計算値1051.6088）。各フラグメントは提唱構造に一致
した。純品をＴ細胞増殖検定（IL−２）に用いた。結果
は実施例３に示す。
実施例３ Ｔ−細胞増殖検定 1.試料作製 上述HPLCにて得られた純Ｌ−687,819を無水エタノール
に1mg/mlで溶かした。
2.検定 C57Bl/6マウスの脾臓を無菌条件下で取り、10％熱不活
化牛胎児血清（GIBCO）を加えた氷冷RPMI 1640培地（GI
BCO、ニューヨーク州グランドアイランド）中にて、ゆ
っくりと分離した。細胞を1500rpm、８分間遠心して、
ペレットとして取った。ペレットを塩化アンモニウム分
解緩衝液（GIBCO）で４℃、２分間処理して混在する赤
血球細胞を除去した。冷却培地を加え、細胞を再び1500
rpm、８分間遠心した。以下に示す如きナイロンウール
カラムを用いて細胞懸濁液を分離し、Ｔリンパ球を単離
した。ナイロンウールカラムは約４グラムの洗浄、乾燥
したナイロンウールを20mlのプラスチックシリンジ中に
充填して作製した。オートクレーブで30分間250゜Fにて
カラムを滅菌した。ナイロンウールカラムを加温（37
℃）培養液で湿潤させ、同培養液でリンスした。洗浄し
た脾臓細胞を温培養液に懸濁させ、ゆっくりナイロンウ
ールカラムに乗せた。カラムを垂直にして37℃で１時間
インキュベートした。非吸着Ｔリンパ球は温培養液によ
りカラムから流出した。細胞懸濁液を用い、上述の如き
操作を繰り返した。
10％熱不活性化牛胎児血清、10mMグルタミン、1mMピル
ビン酸ナトリウム、２×10-5M 2−メルカプトエタノー
ル及び50μg/mlゲンタマイシンを含むRPMI 1640培地か
ら成る完全培養液中に2.5×105細胞数/mlで精製Ｔリン
パ球を懸濁した。イオノマイシンを250ng/ml、PMAを10n
g/ml加えた。直ちに96穴平底微量培養板（Costar）中に
細胞懸濁液を200ml/穴ずつ分配した。検定試料のない培
養液であるコントロールと検定すべき以下に示す如き種
々の試料希釈物（上述のＬ−687,819）を３穴ずつ20μl
/穴で加えた。Ｌ−679,934（FK-506）を標準として用い
た。次に培養板を５％CO2-95％空気の湿潤環境下37℃で
44時間インキュベートした。Ｔリンパ球の増殖は、トリ
チウム標識チミジンの取り込みを測定して検定した。44
時間培養後、トリチウム標識チミジン（NEN、ケンブリ
ッジ、MA）を２μCi/穴用いて細胞をパルス標識した。
さらに４時間インキュベート後、複数試料採取機を用い
てグラスファイバー紙上に培養物を採取した。個々の
穴に対応する円形フィルターの放射活性を標準の液体シ
ンチレーションカウンター（ベータカウンター）で測定
した。各穴からの複写物の１分間当りの平均カウント数
を計算し、結果を以下に示す如くトリチウム標識チミジ
ン取り込み（増殖）のパーセント阻害で表わした。
Ｌ−687,819の種々の濃度でのパーセント阻害の結果を
以下の表に示す。
表 L-687,819によるＴ細胞増殖の阻害 L-687,819(ng/ml) ％阻害 100 98.8 10 76.1 6.6 51.3 4.4 15.9 2.9 ０ 1.3 ０ 0.58 ０ 0.26 9.1 0.11 9.5 注:1.マウスＴ細胞培養物を3H−チミジンで採取48時間
前に４時間パルス標識する。
2.標準Ｌ−679.934（10ng/ml）は99％阻害を示し
た。
3.L−687,819のIC50＝7.0ng/ml＝9.17nM 4.増殖阻害は50単位/mlの組変えトIL−２を加える
と消滅した。
【図面の簡単な説明】 図１はＬ−687,819のCDCl3中における400MHzでのプロト
ン（1H）核磁気共鳴（NMR）スペクトルである。 図２はＬ−687,819のCDCl3中における100MHzでの炭素−
13（13C）NMRスペクトルである。 図３はスペクトル及びマススペクトルの根拠に基づくＬ
−687,819の同定化学構造を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロバート ピー．ボリス アメリカ合衆国，08826 ニユージヤーシ イ，グレン ガードナー，フオツクス ホ ロー ロード 134，アールデー．２，ボ ツクス 134 (72)発明者 ケヴイン エム．バイン アメリカ合衆国，08628 ニユージヤーシ イ，ウエスト トレントン，フオレスト レーン ６ (72)発明者 リンダ エス．ウイツカー アメリカ合衆国，07090 ニユージヤーシ イ，ウエストフイールド，アロウウツド ドライヴ 2096 (72)発明者 デボラ エル．ツインク アメリカ合衆国，07726 ニユージヤーシ イ，マナラパン，ブレンハイム ロード 37

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】分子構造： を有する化合物Ｌ−687,819。
  2. 【請求項２】医薬的に許容しうる実質的に無毒性担体又
    は賦形剤と併用した免疫抑制量のＬ−687,819を含有す
    る免疫抑制用組成物。
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