JPH06153974A - 新規なｃ−２１ヒドロキシル化ｆｋ−５０６拮抗剤 - Google Patents
新規なｃ−２１ヒドロキシル化ｆｋ−５０６拮抗剤Info
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- JPH06153974A JPH06153974A JP4167455A JP16745592A JPH06153974A JP H06153974 A JPH06153974 A JP H06153974A JP 4167455 A JP4167455 A JP 4167455A JP 16745592 A JP16745592 A JP 16745592A JP H06153974 A JPH06153974 A JP H06153974A
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- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 新規な微生物、ストレプトミセス・ハイグロ
スコピクス（メルク・カルチュアー・コレクションＭＡ
６８３２）ＡＴＣＣ No.５５１６６を用いた新規な醗酵
条件下で、新規なＦＫ−５０６拮抗剤、ＦＲ−９００５
２０のＣ−２１ヒドロキシル化同類物を製造する製法を
記述した。 【効果】 本マクロライド拮抗物質は、自己免疫疾患又
は例えば骨髄、肝臓、肺、腎臓及び心臓移植のような臓
器移植時のヒト宿主拒絶反応を防止するように設計され
たＦＫ−５０６治療計画での不測又は不注意によるＦＫ
−５０６過剰投与を防止及び／又は中和するのに有益な
ものである。
スコピクス（メルク・カルチュアー・コレクションＭＡ
６８３２）ＡＴＣＣ No.５５１６６を用いた新規な醗酵
条件下で、新規なＦＫ−５０６拮抗剤、ＦＲ−９００５
２０のＣ−２１ヒドロキシル化同類物を製造する製法を
記述した。 【効果】 本マクロライド拮抗物質は、自己免疫疾患又
は例えば骨髄、肝臓、肺、腎臓及び心臓移植のような臓
器移植時のヒト宿主拒絶反応を防止するように設計され
たＦＫ−５０６治療計画での不測又は不注意によるＦＫ
−５０６過剰投与を防止及び／又は中和するのに有益な
ものである。
Description
【０００１】本発明は新規なＦＫ−５０６拮抗剤、Ｃ−
２１−ヒドロキシ−ＦＲ−９００５２０、その製造のた
めの新規な微生物ストレプトミセス・ハイグロスコピク
ス(Streptomyces hygroscopicus) （ＭＡ６８３２）、
ＡＴＣＣ No.５５１６６を利用する新規な発酵方法に関
するものである。本方法はＦＲ−９００５２０のＣ21炭
素をヒドロキシル化する条件下でＦＲ−９００５２０の
存在で本微生物を培養することを含む。また自己免疫疾
患、及び／又は臓器移植拒絶反応をヒト宿主において防
止するように設計された治療計画でのＦＫ−５０６の偶
然又は不注意による過剰投与の防止及び／又は中和のた
めのその使用方法も明らかにされている。
２１−ヒドロキシ−ＦＲ−９００５２０、その製造のた
めの新規な微生物ストレプトミセス・ハイグロスコピク
ス(Streptomyces hygroscopicus) （ＭＡ６８３２）、
ＡＴＣＣ No.５５１６６を利用する新規な発酵方法に関
するものである。本方法はＦＲ−９００５２０のＣ21炭
素をヒドロキシル化する条件下でＦＲ−９００５２０の
存在で本微生物を培養することを含む。また自己免疫疾
患、及び／又は臓器移植拒絶反応をヒト宿主において防
止するように設計された治療計画でのＦＫ−５０６の偶
然又は不注意による過剰投与の防止及び／又は中和のた
めのその使用方法も明らかにされている。
【０００２】１９８３年にアメリカ合衆国食品医薬品局
（ＵＳ ＦＤＡ）は臓器移植の分野に大変革をもたらし
た極めて有用な抗拒絶反応薬、シクロスポリンを認可し
た。本薬は移植された異種蛋白質を拒絶するために体内
の免疫システムが広大に蓄積された天然防御物質を起動
させるのを阻止する働きがある。
（ＵＳ ＦＤＡ）は臓器移植の分野に大変革をもたらし
た極めて有用な抗拒絶反応薬、シクロスポリンを認可し
た。本薬は移植された異種蛋白質を拒絶するために体内
の免疫システムが広大に蓄積された天然防御物質を起動
させるのを阻止する働きがある。
【０００３】本薬は移植拒絶反応に対抗するには有用で
あるが、多くの場合極めて重症となることがある腎臓機
能不全、肝臓損傷及び潰瘍を起す欠点がある。
あるが、多くの場合極めて重症となることがある腎臓機
能不全、肝臓損傷及び潰瘍を起す欠点がある。
【０００４】ここに引用して組み入れるFujisawaに対す
る欧州特許公報No. ０１８４１６２はシクロスポリンよ
り１００倍有効であると評される新規なマクロライド免
疫抑制剤、ＦＫ−５０６について記述している。本マク
ロライドはストレプトミセス・ツクバエンシス(Strepto
myces tsukubaensis) の特定菌株の発酵によって製造さ
れる。またストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種
ヤクシマエンシス(S.hygroscopicus subsp.yakushimaen
sis)によって製造される密接に関連するマクロライド免
疫抑制剤ＦＲ−９００５２０も記述されている。
る欧州特許公報No. ０１８４１６２はシクロスポリンよ
り１００倍有効であると評される新規なマクロライド免
疫抑制剤、ＦＫ−５０６について記述している。本マク
ロライドはストレプトミセス・ツクバエンシス(Strepto
myces tsukubaensis) の特定菌株の発酵によって製造さ
れる。またストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種
ヤクシマエンシス(S.hygroscopicus subsp.yakushimaen
sis)によって製造される密接に関連するマクロライド免
疫抑制剤ＦＲ−９００５２０も記述されている。
【０００５】Ｔ．Araiに対するアメリカ合衆国特許３，
２４４，５９２はＦＲ−９００５２０と同一の化合物で
あることが示されている抗真菌剤“アスコマイシン”を
製造するためのストレプトミセス・ハイグロスコピクス
変種アスコミセチクス(Streptomyces hygroscopicus va
r.ascomyceticus)の培養を記述している。
２４４，５９２はＦＲ−９００５２０と同一の化合物で
あることが示されている抗真菌剤“アスコマイシン”を
製造するためのストレプトミセス・ハイグロスコピクス
変種アスコミセチクス(Streptomyces hygroscopicus va
r.ascomyceticus)の培養を記述している。
【０００６】しかし、副作用又はシクロスポリンに対す
る類似した副作用が実質的にないものは、ＦＫ−５０６
型免疫抑制剤製造の文献のいずれにも記述が存在しな
い。
る類似した副作用が実質的にないものは、ＦＫ−５０６
型免疫抑制剤製造の文献のいずれにも記述が存在しな
い。
【０００７】またＦＫ−５０６治療を含む治療計画にお
いてＦＫ−５０６又はＦＫ−５０６同類物の不注意又は
偶然の過剰投与の影響を防止又は中和する薬剤も探され
ている。
いてＦＫ−５０６又はＦＫ−５０６同類物の不注意又は
偶然の過剰投与の影響を防止又は中和する薬剤も探され
ている。
【０００８】新規なＦＫ−５０６拮抗剤、Ｃ−２１ヒド
ロキシル化ＦＲ−９００５２０は窒素栄養分を含む液体
炭水化物培地中の液面下の好気的条件で、約７のpHとい
うＦＲ−９００５２０をＣ−２１位置で選択的にヒドロ
キシル化するに十分な条件下で実施する本微生物、スト
レプトミセス・ハイグロスコピクス（ＭＡ６８３２）、
ＡＴＣＣ No.５５１６６をマクロライド免疫抑制剤ＦＲ
−９００５２０と共に発酵させることにより得ることが
できる。
ロキシル化ＦＲ−９００５２０は窒素栄養分を含む液体
炭水化物培地中の液面下の好気的条件で、約７のpHとい
うＦＲ−９００５２０をＣ−２１位置で選択的にヒドロ
キシル化するに十分な条件下で実施する本微生物、スト
レプトミセス・ハイグロスコピクス（ＭＡ６８３２）、
ＡＴＣＣ No.５５１６６をマクロライド免疫抑制剤ＦＲ
−９００５２０と共に発酵させることにより得ることが
できる。
【０００９】生成されたＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−
９００５２０はＦＫ−５０６拮抗剤活性を示す、即ち、
本薬剤はカルシウム・イオン透過担体（イオノマイシ
ン）プラス・ホルボール・ミリスチン酸塩・酢酸塩（Ｐ
ＭＡ）が誘発するＴ−細胞刺激検定により示され、また
ここに“Ｔ−細胞増殖検定”として引用したようにＴ−
細胞活性の陽性阻害を含むＦＫ−５０６の生理学的効果
を反転させる。
９００５２０はＦＫ−５０６拮抗剤活性を示す、即ち、
本薬剤はカルシウム・イオン透過担体（イオノマイシ
ン）プラス・ホルボール・ミリスチン酸塩・酢酸塩（Ｐ
ＭＡ）が誘発するＴ−細胞刺激検定により示され、また
ここに“Ｔ−細胞増殖検定”として引用したようにＴ−
細胞活性の陽性阻害を含むＦＫ−５０６の生理学的効果
を反転させる。
【００１０】この検定の原理はイオノマイシン・プラス
・ＰＭＡの組合わせにより刺激されたマウスＴ−細胞の
増殖を測定することである。例えば、この検定でのＦＫ
−５０６のような陽性サンプルはトリチウム化チミジン
の摂取の減少により示されるようにＴ−細胞増殖を抑制
する。この検定でのＦＫ−５０６の効果の反転はＦＫ−
５０６の拮抗剤活性を示す。
・ＰＭＡの組合わせにより刺激されたマウスＴ−細胞の
増殖を測定することである。例えば、この検定でのＦＫ
−５０６のような陽性サンプルはトリチウム化チミジン
の摂取の減少により示されるようにＴ−細胞増殖を抑制
する。この検定でのＦＫ−５０６の効果の反転はＦＫ−
５０６の拮抗剤活性を示す。
【００１１】本発明により窒素栄養素を含む液体炭水化
物培地中の液面下の好気的発酵条件下でＣ−２１ヒドロ
キシル化ＦＲ−９００５２０製品を製造するのに十分な
時間、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス、ＭＡ６
８３２、ＡＴＣＣ No.５５１６６の菌株をＦＲ−９００
５２０と共に培養する工程を含む、Ｃ−２１ヒドロキシ
ル化ＦＲ−９００５２０として同定された新規なＦＫ−
５０６拮抗剤の製造方法を提供する。
物培地中の液面下の好気的発酵条件下でＣ−２１ヒドロ
キシル化ＦＲ−９００５２０製品を製造するのに十分な
時間、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス、ＭＡ６
８３２、ＡＴＣＣ No.５５１６６の菌株をＦＲ−９００
５２０と共に培養する工程を含む、Ｃ−２１ヒドロキシ
ル化ＦＲ−９００５２０として同定された新規なＦＫ−
５０６拮抗剤の製造方法を提供する。
【００１２】更に、上記の方法により製造され、Ｔ−細
胞増殖検定によりＴ−細胞活性のＦＫ−５０６陽性阻害
の反転を示し、図１で説明したプロトン核磁気共鳴スペ
クトルを示し、図１で同定したような指定された構造式
を持つ新規なＦＫ−５０６拮抗剤、Ｃ−２１ヒドロキシ
ル化ＦＲ−９００５２０を提供する。
胞増殖検定によりＴ−細胞活性のＦＫ−５０６陽性阻害
の反転を示し、図１で説明したプロトン核磁気共鳴スペ
クトルを示し、図１で同定したような指定された構造式
を持つ新規なＦＫ−５０６拮抗剤、Ｃ−２１ヒドロキシ
ル化ＦＲ−９００５２０を提供する。
【００１３】また、薬理学的に受容され、実質的に非毒
性の担体又は賦形剤との組み合わせでＣ−２１ヒドロキ
シル化ＦＲ−９００５２０の治療面での有効量を含む薬
理学的構成物を提供する。
性の担体又は賦形剤との組み合わせでＣ−２１ヒドロキ
シル化ＦＲ−９００５２０の治療面での有効量を含む薬
理学的構成物を提供する。
【００１４】更に、移植拒絶反応を防止するためのヒト
宿主の処置又は自己免疫疾患又は感染症の処置のために
治療面での有効量のＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９０
０５２０を宿主に投与することを含む治療計画において
ＦＫ−５０６の過剰投与を反転させ又は中和させるため
の使用方法を提供する。
宿主の処置又は自己免疫疾患又は感染症の処置のために
治療面での有効量のＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９０
０５２０を宿主に投与することを含む治療計画において
ＦＫ−５０６の過剰投与を反転させ又は中和させるため
の使用方法を提供する。
【００１５】更に、ストレプトミセス・ハイグロスコピ
クス、（ＭＡ６８３２）、ＡＴＣＣNo. ５５１６６の微
生物学的に純粋な培養菌を提供する。
クス、（ＭＡ６８３２）、ＡＴＣＣNo. ５５１６６の微
生物学的に純粋な培養菌を提供する。
【００１６】以下、本発明を詳細に説明する。本発明は
ストレプトミセス・ハイグロスコピクス、ＭＡ６８３
２、ＡＴＣＣ No.５５１６６をＦＲ−９００５２０と共
に発酵させＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０
（ＦＫ−５２０）を製造することを含むものである。本
微生物は現在、メリーランド州ロックビルのパークロー
ン・ドライブ１２３０１にあるアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション(American Type Culture Colle
ction)にＡＴＣＣ No.５５１６６として及びニュージャ
ージー州ローウェイのメルク・カルチャー・コレクショ
ン(Merck Culture Collection)にＭＡ６８３２として寄
託されている。形態学的、培養的、生物学的及び生理学
特徴を含む物理的特徴及び分類は簡単に以下に記述され
ている。
ストレプトミセス・ハイグロスコピクス、ＭＡ６８３
２、ＡＴＣＣ No.５５１６６をＦＲ−９００５２０と共
に発酵させＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０
（ＦＫ−５２０）を製造することを含むものである。本
微生物は現在、メリーランド州ロックビルのパークロー
ン・ドライブ１２３０１にあるアメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション(American Type Culture Colle
ction)にＡＴＣＣ No.５５１６６として及びニュージャ
ージー州ローウェイのメルク・カルチャー・コレクショ
ン(Merck Culture Collection)にＭＡ６８３２として寄
託されている。形態学的、培養的、生物学的及び生理学
特徴を含む物理的特徴及び分類は簡単に以下に記述され
ている。
【００１７】下記は菌株ＭＡ６８３２の一般的記述であ
る。発育、一般的な培養特徴及び炭素源利用の観察はSh
irling,Gottleib(Internat.J.System.Bacteriol.１６：
３１３−３４０）の方法により行った。細胞の化学的組
成はLechevalier,Lechevalier(Actinomycete Taxonomy,
A.Dietz,D.W.Thayer,Ed.Society for Industrial Micro
biology,１９８０）の方法を使用して測定した。培養菌
の色調は国際学会色調協議会−国立標準局セントロイド
・カラー・チャート（米国商務省国立標準局の国立標準
局回状５５３に対する補足、１９８５年）に含まれる色
調標準と比較して測定した。
る。発育、一般的な培養特徴及び炭素源利用の観察はSh
irling,Gottleib(Internat.J.System.Bacteriol.１６：
３１３−３４０）の方法により行った。細胞の化学的組
成はLechevalier,Lechevalier(Actinomycete Taxonomy,
A.Dietz,D.W.Thayer,Ed.Society for Industrial Micro
biology,１９８０）の方法を使用して測定した。培養菌
の色調は国際学会色調協議会−国立標準局セントロイド
・カラー・チャート（米国商務省国立標準局の国立標準
局回状５５３に対する補足、１９８５年）に含まれる色
調標準と比較して測定した。
【００１８】由来−スペイン国、マドリッド市、ミラフ
ローラの庭土
ローラの庭土
【００１９】細胞膜組成の分析−ペプチドグリカンはＬ
−ジアミノピメリン酸を含み、全細胞糖質分析ではグル
コース、リボース及び痕跡量のキシロースが示された。
−ジアミノピメリン酸を含み、全細胞糖質分析ではグル
コース、リボース及び痕跡量のキシロースが示された。
【００２０】一般的発育特徴−本菌は酵母・麦芽エキ
ス、グリセリン・アスパラギン、無機塩・澱粉、オート
ミール、及びトリプチケース・大豆寒天培地で良好に発
育する。２７℃及び３７℃で発育し、酵母・デキストロ
ース・ブロスのような液体培地で良好に発育する。
ス、グリセリン・アスパラギン、無機塩・澱粉、オート
ミール、及びトリプチケース・大豆寒天培地で良好に発
育する。２７℃及び３７℃で発育し、酵母・デキストロ
ース・ブロスのような液体培地で良好に発育する。
【００２１】コロニーの形態−（２１日間の酵母・麦芽
エキス寒天培地で）−基底菌糸は中間の黄色（８７ｍ．
Ｙ）で、コロニーは不透明で、台形で、ぎざぎざで、弾
性がある。コロニー表面は鈍く、粗面である。気菌糸は
５日間の培養後に出現し、白色（２６３白色）である。
胞子塊は、存在する場合、暗灰色から白色（２６６
ｄ．Ｇｙ−２６３白色）である。
エキス寒天培地で）−基底菌糸は中間の黄色（８７ｍ．
Ｙ）で、コロニーは不透明で、台形で、ぎざぎざで、弾
性がある。コロニー表面は鈍く、粗面である。気菌糸は
５日間の培養後に出現し、白色（２６３白色）である。
胞子塊は、存在する場合、暗灰色から白色（２６６
ｄ．Ｇｙ−２６３白色）である。
【００２２】微細構造−気菌糸（０．５７μm 径）は基
底菌糸から放射状に発生し、直線である。成熟した培養
菌では、気菌糸は、最後に螺旋状に生えた胞子鎖を形成
する。培養菌が古くなると、胞子塊は不定形の塊に合体
する傾向がある。
底菌糸から放射状に発生し、直線である。成熟した培養
菌では、気菌糸は、最後に螺旋状に生えた胞子鎖を形成
する。培養菌が古くなると、胞子塊は不定形の塊に合体
する傾向がある。
【００２３】種々の生理学的反応−培養菌はメラノイド
色素を生産しない。澱粉は弱く加水分解される。硫化水
素は生産されない。拡散性黄色色素は活発な発育を助け
る殆どの固体培地で生産される。炭素源の利用パターン
は下記のようである：セロビオース、Ｄ−フラクトー
ス、イノシトール、α−Ｄ−乳糖、β−Ｄ−乳糖、Ｄ−
マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−
ラフィノース、蔗糖、Ｄ−キシロースを良好に利用する
が、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノ
ース、Ｌ−キシロースはあまり利用しない。
色素を生産しない。澱粉は弱く加水分解される。硫化水
素は生産されない。拡散性黄色色素は活発な発育を助け
る殆どの固体培地で生産される。炭素源の利用パターン
は下記のようである：セロビオース、Ｄ−フラクトー
ス、イノシトール、α−Ｄ−乳糖、β−Ｄ−乳糖、Ｄ−
マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−
ラフィノース、蔗糖、Ｄ−キシロースを良好に利用する
が、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−ラムノ
ース、Ｌ−キシロースはあまり利用しない。
【００２４】識別−本菌の化学分類的及び形態学的特徴
は特にストレプトミセス属の菌株の公表されている記述
と比較した。ＭＡ６８３２はストレプトミセス・ハイグ
ロスコピクス複合体に対して報告されているものに類似
した胞子塊の色調及び合体を示す。本菌はストレプトミ
セス・ハイグロスコピクスの新規菌株として推定的に同
定される。
は特にストレプトミセス属の菌株の公表されている記述
と比較した。ＭＡ６８３２はストレプトミセス・ハイグ
ロスコピクス複合体に対して報告されているものに類似
した胞子塊の色調及び合体を示す。本菌はストレプトミ
セス・ハイグロスコピクスの新規菌株として推定的に同
定される。
【００２５】 ２１日目でのＭＡ６８３２の炭水化物利用パターン 炭素源 ＭＡ６８３２による利用 Ｄ−アラビノース １ Ｌ−アラビノース １ セロビオース ３ Ｄ−フラクトース ３ イノシトール ３ α−Ｄ−乳糖 ３ β−Ｄ−乳糖 ３ Ｄ−マルトース ３ Ｄ−マンニトール ３ Ｄ−マンノース ３ Ｄ−ラフィノース ３ Ｌ−ラムノース １ 蔗糖 ３ Ｄ−キシロース ３ Ｌ−キシロース ０ａ−Ｄ−グルコース（コントロール） ３ ３＝良好な利用、２＝中程度の利用 １＝殆ど利用しない、０＝利用しない
【００２６】 ２１日目でのＭＡ６８３２の培養上の特徴 培地 ＭＡ６８３２の発育量 ＭＡ６８３２の気菌糸 酵母エキス 良好 暗灰色（２６６ ｄ．Ｇｙ） 麦芽エキス ラセン状担胞子体は不定形塊に合体す る。 グルコース 良好 茶色がかった灰色( 64 b rGy ) アスパラギン ラセン状担胞子体は不定形塊に合体す る。 無機塩 良好 黒色（２６７黒色） 澱粉 ラセン状担胞子体は不定形塊に合体す る。澱粉は加水分解される。 オートミール 良好 黒色（２６７黒色） ラセン状担胞子体は不定形塊に合体す る。 シグマ水 貧弱 暗灰色（２６６ ｄＧｙ） ラセン状担胞子体は不定形塊に合体す る。 ツァペック 良好 明るい灰色（２６４ ｌＧｙ） ラセン状担胞子体は不定形塊に合体す る。 ペプトン・鉄 良好 ２１日目でのＭＡ６８３２の培養上の特徴（続き） 培地 ＭＡ６８３２の可溶性色素 ＭＡ６８３２の基底菌糸 酵母エキス 黄色 中間の黄色（８７ ｍ．Ｙ） 麦芽エキス グルコース 黄色 淡黄色（８９ ｐ．Ｙ） アスパラギン 無機塩 黄色 明るい灰オリーブ色（１０９ 澱粉 １．ｇｙ．０１） オートミール 黄色 灰オリーブ色（１１３ ０１Ｇ ｙ） シグマ水 認められない 黒色（２６７黒色） ツァペック 認められない 明るい黄色（８６ １．Ｙ） ペプトン・鉄 メラニンは陰性 Ｈ2 Ｓは陰性
【００２７】本発明の方法はストレプトミセス・ハイグ
ロスコピクスの全てのＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９
００５２０生産菌株を使用して実施できるものであり、
特に望ましいのはＡＴＣＣ No.５５１６６菌株（ＭＡ６
８３２）である。
ロスコピクスの全てのＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９
００５２０生産菌株を使用して実施できるものであり、
特に望ましいのはＡＴＣＣ No.５５１６６菌株（ＭＡ６
８３２）である。
【００２８】一般的にＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９
００５２０は、ＦＲ−９００５２０をＣ−２１位置でヒ
ドロキシル化できるストレプトミセス・ハイグロスコピ
クス菌株を資化性炭素及び窒素源を含む液体栄養培地
で、望ましくは液面下の好気的条件（例えば、振盪培
養、液面下培養、その他）で培養（発酵）を行うことに
より製造できる。望ましくは液体培地のpHを発酵工程の
最初と終了（収穫）時に約７に維持する。これより高い
pHは製造物の実質的な及び／又は全面的なロスをもたら
す。望ましいpHはモルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）、モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、
及び同類物のような緩衝物質の使用により、又は以下に
記述した生産培地のような本質的に緩衝作用を持つ栄養
物質を選択することにより維持しても良い。
００５２０は、ＦＲ−９００５２０をＣ−２１位置でヒ
ドロキシル化できるストレプトミセス・ハイグロスコピ
クス菌株を資化性炭素及び窒素源を含む液体栄養培地
で、望ましくは液面下の好気的条件（例えば、振盪培
養、液面下培養、その他）で培養（発酵）を行うことに
より製造できる。望ましくは液体培地のpHを発酵工程の
最初と終了（収穫）時に約７に維持する。これより高い
pHは製造物の実質的な及び／又は全面的なロスをもたら
す。望ましいpHはモルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）、モルフォリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、
及び同類物のような緩衝物質の使用により、又は以下に
記述した生産培地のような本質的に緩衝作用を持つ栄養
物質を選択することにより維持しても良い。
【００２９】栄養培地の望ましい炭素源は、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デ
キストリン、及び同類物のような炭水化物である。その
他の含まれても良い炭素源はマルトース、ラフィノー
ス、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウム及び同
類物である。
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デ
キストリン、及び同類物のような炭水化物である。その
他の含まれても良い炭素源はマルトース、ラフィノー
ス、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウム及び同
類物である。
【００３０】望ましい窒素源は、アンモニウム塩（たと
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモ
ニウム、その他）、尿素、アミノ酸、及び同類物のよう
な無機及び有機窒素化合物ばかりでなく、酵母エキス、
肉エキス、ペプトン、グルテン・ミール、綿実ミール、
大豆ミール及びその他の植物性ミール（部分的に又は全
面的に脱脂したもの）、カゼイン加水分解物、大豆加水
分解物及び酵母加水分解物、コーン・スチープ・リカ
ー、乾燥酵母、小麦胚芽、羽毛ミール、ピーナッツ粉、
ジスチラーズ・ソリュブル、その他である。
えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、燐酸アンモ
ニウム、その他）、尿素、アミノ酸、及び同類物のよう
な無機及び有機窒素化合物ばかりでなく、酵母エキス、
肉エキス、ペプトン、グルテン・ミール、綿実ミール、
大豆ミール及びその他の植物性ミール（部分的に又は全
面的に脱脂したもの）、カゼイン加水分解物、大豆加水
分解物及び酵母加水分解物、コーン・スチープ・リカ
ー、乾燥酵母、小麦胚芽、羽毛ミール、ピーナッツ粉、
ジスチラーズ・ソリュブル、その他である。
【００３１】炭素及び窒素源は都合良く組み合わせて使
用するが、純品を使用する必要はない。というのは微量
の発育因子及び多量のミネラル栄養素を含有している純
度の劣る物質も同様に使用に適しているからである。望
むならば培地に炭酸ナトリウム又はカルシウム、燐酸ナ
トリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、
ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅
塩、コバルト塩などを加えても良い。もし必要ならば、
特に栄養培地がひどく泡立つ場合は液体パラフィン、脂
肪性油、植物油、ポリプロピレン・グリコール、鉱油又
はシリコンのような消泡剤を添加しても良い。
用するが、純品を使用する必要はない。というのは微量
の発育因子及び多量のミネラル栄養素を含有している純
度の劣る物質も同様に使用に適しているからである。望
むならば培地に炭酸ナトリウム又はカルシウム、燐酸ナ
トリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、
ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅
塩、コバルト塩などを加えても良い。もし必要ならば、
特に栄養培地がひどく泡立つ場合は液体パラフィン、脂
肪性油、植物油、ポリプロピレン・グリコール、鉱油又
はシリコンのような消泡剤を添加しても良い。
【００３２】ＦＲ−９００５２０出発物質はアメリカ合
衆国特許３，２４４，５９２に記載のストレプトミセス
・ハイグロスコピクス変種アスコミセチクス、ＡＴＣＣ
No.１４８９１の発酵により、及びFujisawaに対する欧
州特許庁公報No. ０１８４１６２、及びアメリカ合衆国
特許４，８９４，３６６に記載のＦＲ−９００５２０製
造用ストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種ヤクシ
マエンシスNo. ７２７８の発酵により得ることができ
る。
衆国特許３，２４４，５９２に記載のストレプトミセス
・ハイグロスコピクス変種アスコミセチクス、ＡＴＣＣ
No.１４８９１の発酵により、及びFujisawaに対する欧
州特許庁公報No. ０１８４１６２、及びアメリカ合衆国
特許４，８９４，３６６に記載のＦＲ−９００５２０製
造用ストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種ヤクシ
マエンシスNo. ７２７８の発酵により得ることができ
る。
【００３３】大量のＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９０
０５２０の製造条件として、液面下の好気的培養条件が
そのために望ましいものである。少量の製造にはフラス
コ又は瓶での振盪又は表面培養が使用される。更に、発
育を大容量タンクで行わせる場合は、Ｃ−２１ヒドロキ
シル化ＦＲ−９００５２０の製造工程での発育の遅れを
避けるために本微生物の栄養細胞形を製造タンクへの接
種に使用することが望ましい。よって最初に比較的少量
の培養培地に“スラント”で製造した本微生物の胞子又
は菌糸体を接種し、“種菌培地”とも呼ばれるこの接種
済み培地を培養することにより本微生物の栄養細胞接種
物を製造して、次に培養した栄養細胞接種物を無菌的に
大容量タンクに接種することが望ましい。栄養細胞接種
物を製造する発酵培地は本質的にＣ−２１ヒドロキシル
化ＦＲ−９００５２０の製造に使用する培地と同一又は
異なるものであり、一般的に接種前にオートクレーブ処
理して培地を滅菌する。培地のpHは一般的にオートクレ
ーブ工程の前に酸又は塩基を、望ましくは緩衝液の形で
適度に加えることにより約pH７．０に調整する。
０５２０の製造条件として、液面下の好気的培養条件が
そのために望ましいものである。少量の製造にはフラス
コ又は瓶での振盪又は表面培養が使用される。更に、発
育を大容量タンクで行わせる場合は、Ｃ−２１ヒドロキ
シル化ＦＲ−９００５２０の製造工程での発育の遅れを
避けるために本微生物の栄養細胞形を製造タンクへの接
種に使用することが望ましい。よって最初に比較的少量
の培養培地に“スラント”で製造した本微生物の胞子又
は菌糸体を接種し、“種菌培地”とも呼ばれるこの接種
済み培地を培養することにより本微生物の栄養細胞接種
物を製造して、次に培養した栄養細胞接種物を無菌的に
大容量タンクに接種することが望ましい。栄養細胞接種
物を製造する発酵培地は本質的にＣ−２１ヒドロキシル
化ＦＲ−９００５２０の製造に使用する培地と同一又は
異なるものであり、一般的に接種前にオートクレーブ処
理して培地を滅菌する。培地のpHは一般的にオートクレ
ーブ工程の前に酸又は塩基を、望ましくは緩衝液の形で
適度に加えることにより約pH７．０に調整する。
【００３４】培養混合物の攪拌及び通気は種々の方法で
行える。攪拌はプロペラ又は類似の攪拌装置により、又
は発酵槽の回転又は振盪により、種々のポンプ装置又は
培地に無菌空気を通すことにより行っても良い。
行える。攪拌はプロペラ又は類似の攪拌装置により、又
は発酵槽の回転又は振盪により、種々のポンプ装置又は
培地に無菌空気を通すことにより行っても良い。
【００３５】発酵は通常、約２０℃から４０℃、望まし
くは２５−３５℃の温度で約１０時間から２０時間行う
が、これらの条件は発酵状態及び規模に応じて変更して
も良い。望ましくは、製造用培養菌は２２０rpm で運転
している回転式振盪器で２７℃で約１７時間培養する。
この場合、発酵培地のpHを収穫時まで７．０に維持す
る。
くは２５−３５℃の温度で約１０時間から２０時間行う
が、これらの条件は発酵状態及び規模に応じて変更して
も良い。望ましくは、製造用培養菌は２２０rpm で運転
している回転式振盪器で２７℃で約１７時間培養する。
この場合、発酵培地のpHを収穫時まで７．０に維持す
る。
【００３６】発酵を行うための望ましい培養／製造培地
は下記の物を含む：
は下記の物を含む：
【００３７】製造されたＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−
９００５２０は、他の既知である生物学的に活性のある
物質の回収に一般的に使用されている従来の手段により
培養培地から回収することができる。製造されたＣ−２
１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０物質は培養菌糸体
及び濾液中に認められ、そのために培養したブロスを濾
過し、遠心分離することにより得た菌糸体及び濾液か
ら、減圧濃縮、凍結乾燥、メタノールなどのような従来
の溶媒による抽出、pH調整、従来の樹脂（例えば、陰イ
オン又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、その
他）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、珪
酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ、その他）によ
る処理、結晶化、再結晶化、及び同類方法のような従来
の方法により分離、精製することができる。望ましい方
法は溶媒抽出、特にメタノールを使用する抽出である。
９００５２０は、他の既知である生物学的に活性のある
物質の回収に一般的に使用されている従来の手段により
培養培地から回収することができる。製造されたＣ−２
１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０物質は培養菌糸体
及び濾液中に認められ、そのために培養したブロスを濾
過し、遠心分離することにより得た菌糸体及び濾液か
ら、減圧濃縮、凍結乾燥、メタノールなどのような従来
の溶媒による抽出、pH調整、従来の樹脂（例えば、陰イ
オン又は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂、その
他）による処理、従来の吸着剤（例えば、活性炭、珪
酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ、その他）によ
る処理、結晶化、再結晶化、及び同類方法のような従来
の方法により分離、精製することができる。望ましい方
法は溶媒抽出、特にメタノールを使用する抽出である。
【００３８】発酵から得られたＣ−２１ヒドロキシル化
ＦＲ−９００５２０製造物は、“Ｔ−細胞増殖検定”に
よるＦＫ−５０６免疫抑制活性に対する拮抗剤活性を示
し、且つこれに基づく有用性を有し、下記の物理的特徴
を示す： １、白い不定形粉末 ２、メタノールに可溶 ３、ＦＡＢ質量分析により測定した（観察されたＭ＋Ｌ
ｉ＝８１４）分子量８０７は図１での指定された構造と
一致する。
ＦＲ−９００５２０製造物は、“Ｔ−細胞増殖検定”に
よるＦＫ−５０６免疫抑制活性に対する拮抗剤活性を示
し、且つこれに基づく有用性を有し、下記の物理的特徴
を示す： １、白い不定形粉末 ２、メタノールに可溶 ３、ＦＡＢ質量分析により測定した（観察されたＭ＋Ｌ
ｉ＝８１４）分子量８０７は図１での指定された構造と
一致する。
【００３９】上述の発酵工程によって得られたＣ−２１
ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０は従来の方法、例え
ば、抽出、沈殿、分画結晶化、再結晶化、クロマトグラ
フ処理、及び同類方法で分離、精製することができる。
ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０は従来の方法、例え
ば、抽出、沈殿、分画結晶化、再結晶化、クロマトグラ
フ処理、及び同類方法で分離、精製することができる。
【００４０】前述の発酵反応及びこの発酵混合物の後処
理において非対称炭素原子又は二重結合によるＣ−２１
ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０の相同物及び／又は
立体異性体が時折他の相同物及び／又は立体異性体に転
換する。そしてこのような事例も亦本発明の範囲に含ま
れる。
理において非対称炭素原子又は二重結合によるＣ−２１
ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０の相同物及び／又は
立体異性体が時折他の相同物及び／又は立体異性体に転
換する。そしてこのような事例も亦本発明の範囲に含ま
れる。
【００４１】本発明のＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９
００５２０は拮抗剤薬理学的活性を有し、心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚、その他の様な器官及び組織の移植拒
絶反応、骨髄移植による対宿主性移植片病、慢性関節リ
ウマチのような自己免疫疾患、全身性狼瘡、紅斑、ハシ
モト甲状腺炎、集合性硬化症、重症筋無力症、Ｉタイプ
糖尿病、ブドウ膜炎、及び同類病の処置及び防止のため
に設計されたＦＫ−５０６を含む治療計画におけるＦＫ
−５０６の不注意又は不測の過剰投与に対して有用であ
り、又はＦＫ−５０６に対する解毒剤となる。
００５２０は拮抗剤薬理学的活性を有し、心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚、その他の様な器官及び組織の移植拒
絶反応、骨髄移植による対宿主性移植片病、慢性関節リ
ウマチのような自己免疫疾患、全身性狼瘡、紅斑、ハシ
モト甲状腺炎、集合性硬化症、重症筋無力症、Ｉタイプ
糖尿病、ブドウ膜炎、及び同類病の処置及び防止のため
に設計されたＦＫ−５０６を含む治療計画におけるＦＫ
−５０６の不注意又は不測の過剰投与に対して有用であ
り、又はＦＫ−５０６に対する解毒剤となる。
【００４２】本発明の薬理学的構成物は薬理学的調製物
の形で、例えば活性原料として本発明のＣ−２１ヒドロ
キシル化ＦＲ−９００５２０を含む固体、半固体又は液
状で、外用、内服用又は非経口投与に適した有機又は無
機の担体又は賦形剤と混合して使用できる。例えば、本
活性原料はタブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶
液、エマルジョン、懸濁液、及びその他の全ての使用に
適した形態のための通常の非毒性で薬理学的に受容され
る担体と混成しても良い。使用できる担体は、水、グル
コース、乳糖、アカシア・ゴム、ゼラチン、マンニトー
ル、澱粉ペースト、マグネシウム・トリシリケート、タ
ルク、コーン・スターチ、ケラチン、コロイド状珪素、
馬鈴薯澱粉、尿素及びその他の担体で、固体、半固体、
又は液状で調製物の製造に適した物である。更に、補助
剤、安定剤、増粘剤及び着色料及び香料を使用しても良
い。本活性目的化合物は疾病の過程又は状態に望ましい
効果をもたらすのに十分な量で薬理学的構成物に含まれ
る。
の形で、例えば活性原料として本発明のＣ−２１ヒドロ
キシル化ＦＲ−９００５２０を含む固体、半固体又は液
状で、外用、内服用又は非経口投与に適した有機又は無
機の担体又は賦形剤と混合して使用できる。例えば、本
活性原料はタブレット、ペレット、カプセル、坐薬、溶
液、エマルジョン、懸濁液、及びその他の全ての使用に
適した形態のための通常の非毒性で薬理学的に受容され
る担体と混成しても良い。使用できる担体は、水、グル
コース、乳糖、アカシア・ゴム、ゼラチン、マンニトー
ル、澱粉ペースト、マグネシウム・トリシリケート、タ
ルク、コーン・スターチ、ケラチン、コロイド状珪素、
馬鈴薯澱粉、尿素及びその他の担体で、固体、半固体、
又は液状で調製物の製造に適した物である。更に、補助
剤、安定剤、増粘剤及び着色料及び香料を使用しても良
い。本活性目的化合物は疾病の過程又は状態に望ましい
効果をもたらすのに十分な量で薬理学的構成物に含まれ
る。
【００４３】この構成物を人に適用するためには、非経
口又は内服投与により適用することが望ましい。Ｃ−２
１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０の治療面の有効量
の投与は処置する各個々の患者の年齢及び状態、ＦＫ−
５０６の過剰投与量及びそれ以上の量と同一量であるべ
きＦＫ−５０６投与量により異なり、また依存するが、
本活性原料の約０．０１〜１０００mg、望ましくは０．
１〜５００mg、更に望ましくは０．５〜１００mgの一日
投与量（７０kgの男性を基準として計算した）が一般に
処置疾病に対して与えられ、約０．５mg、１mg、５mg、
１０mg、５０mg、１００mg、２５０mg及び５００mgの単
一投与量が一般的に投与される。
口又は内服投与により適用することが望ましい。Ｃ−２
１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０の治療面の有効量
の投与は処置する各個々の患者の年齢及び状態、ＦＫ−
５０６の過剰投与量及びそれ以上の量と同一量であるべ
きＦＫ−５０６投与量により異なり、また依存するが、
本活性原料の約０．０１〜１０００mg、望ましくは０．
１〜５００mg、更に望ましくは０．５〜１００mgの一日
投与量（７０kgの男性を基準として計算した）が一般に
処置疾病に対して与えられ、約０．５mg、１mg、５mg、
１０mg、５０mg、１００mg、２５０mg及び５００mgの単
一投与量が一般的に投与される。
【００４４】下記の実施例は本発明を説明する目的で示
したものであり、本発明の領域及び真意を限定するもの
ではない。
したものであり、本発明の領域及び真意を限定するもの
ではない。
【００４５】
【実施例】実施例１ 微生物及び培養菌の条件 凍結乾燥した菌株（ＭＡ６８３２）ＡＴＣＣ No.５５１
６６を、（ｇ／Ｌの単位で）デキストリン１０％，デキ
ストロース１．０％，ビーフ・エキス３．０％，アルダ
ミンＰＨ（イースト・プロダクツ社）５．０，Ｎ−Ｚア
ミンタイプＥ５．０，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０
５，ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３７，及びＣａＣＯ3 ０．５
から成る５０mlのオートクレーブ処理した（滅菌した）
種菌培地を含有する２５０mlの隔壁付き振盪フラスコへ
の接種用に使用した。種菌培地のpHはオートクレーブ処
理前に７．１に補正した。種菌を、２２０rpm で運転す
る回転式振盪器上で２７℃で４８時間種菌培地中で培養
した。代替法として、凍結した栄養菌糸又は斜面培養菌
源を使う場合には、培養菌体を種菌培地で２２０rpm
で、２７℃、４８時間培養する。製造された種菌培地の
２．５ml部分を、次のような予めオートクレーブ処理し
た（滅菌した）醗酵培地５０mlを含有する２５０mlの隔
壁付き振盪フラスコへの接種用に使用した。ＦＲ−９０
０５２０は、最終濃度が０．１mg／ml濃度となるように
ジメチルスルフォキシド溶液として加えた。続いて振盪
フラスコ内容物を、２２０rpm で運転する回転式振盪器
上で２７℃で１８時間培養した： １．醗酵培地は、（ｇ／Ｌの単位で）デキストロース
４．０；麦芽エキス１０．０；酵母エキス４．０；栄養
ブロス４．０；から成り、pHはオートクレーブ処理前に
７．０に補正した。
６６を、（ｇ／Ｌの単位で）デキストリン１０％，デキ
ストロース１．０％，ビーフ・エキス３．０％，アルダ
ミンＰＨ（イースト・プロダクツ社）５．０，Ｎ−Ｚア
ミンタイプＥ５．０，ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０
５，ＫＨ2 ＰＯ4 ０．３７，及びＣａＣＯ3 ０．５
から成る５０mlのオートクレーブ処理した（滅菌した）
種菌培地を含有する２５０mlの隔壁付き振盪フラスコへ
の接種用に使用した。種菌培地のpHはオートクレーブ処
理前に７．１に補正した。種菌を、２２０rpm で運転す
る回転式振盪器上で２７℃で４８時間種菌培地中で培養
した。代替法として、凍結した栄養菌糸又は斜面培養菌
源を使う場合には、培養菌体を種菌培地で２２０rpm
で、２７℃、４８時間培養する。製造された種菌培地の
２．５ml部分を、次のような予めオートクレーブ処理し
た（滅菌した）醗酵培地５０mlを含有する２５０mlの隔
壁付き振盪フラスコへの接種用に使用した。ＦＲ−９０
０５２０は、最終濃度が０．１mg／ml濃度となるように
ジメチルスルフォキシド溶液として加えた。続いて振盪
フラスコ内容物を、２２０rpm で運転する回転式振盪器
上で２７℃で１８時間培養した： １．醗酵培地は、（ｇ／Ｌの単位で）デキストロース
４．０；麦芽エキス１０．０；酵母エキス４．０；栄養
ブロス４．０；から成り、pHはオートクレーブ処理前に
７．０に補正した。
【００４６】検定方法 本反応は、ＨＰＬＣの時間毎採取試料により追跡され
た。全ブロスは等量のメタノールと混合された。本混合
物を１０分間振盪した。濾過した上清液をＨＰＬＣ検定
に用いた。生体内変換試料に加えて、ブランク用の培養
菌体を同様の方法により作製した。生体内変換試料のＨ
ＰＬＣチャートとブランク用培養菌体のそれとの比較に
より、代謝物ピークの同定を試みた。
た。全ブロスは等量のメタノールと混合された。本混合
物を１０分間振盪した。濾過した上清液をＨＰＬＣ検定
に用いた。生体内変換試料に加えて、ブランク用の培養
菌体を同様の方法により作製した。生体内変換試料のＨ
ＰＬＣチャートとブランク用培養菌体のそれとの比較に
より、代謝物ピークの同定を試みた。
【００４７】クロマトグラフ分割をレイニン社ミクロソ
ーブ(RAININ MICROSORB)Ｃ8 及びＣ18、及びデュポン社
ゾーバックＣＮ(ZORBAX ＣＮ）カラムにて試験した。ゾ
ーバックＣＮカラム（４．６mm×２５cm）による分離が
優れていた。溶出は０．９ml／分の流速で、Ａ：１０mM
Ｈ3 ＰＯ4 及びＢ：ＣＨ3 ＣＮ−水（１７：３ｖ／ｖ）
なる溶剤を用いて勾配方式で実施した。勾配表は次の如
くである。時間（分） Ｂ％ ０ ３０ ２ ３０ １８ ８０ ２０ １００ ２４ １００ ２５ ３０ ダイオード配列検出器の指標波長は２０５nmであった。
ーブ(RAININ MICROSORB)Ｃ8 及びＣ18、及びデュポン社
ゾーバックＣＮ(ZORBAX ＣＮ）カラムにて試験した。ゾ
ーバックＣＮカラム（４．６mm×２５cm）による分離が
優れていた。溶出は０．９ml／分の流速で、Ａ：１０mM
Ｈ3 ＰＯ4 及びＢ：ＣＨ3 ＣＮ−水（１７：３ｖ／ｖ）
なる溶剤を用いて勾配方式で実施した。勾配表は次の如
くである。時間（分） Ｂ％ ０ ３０ ２ ３０ １８ ８０ ２０ １００ ２４ １００ ２５ ３０ ダイオード配列検出器の指標波長は２０５nmであった。
【００４８】分離 採取した全ブロス試料を同量のメタノールと混合した。
上清液を分離した。真空下蒸溜により、本混合物からメ
タノールを除去した。水性残渣を二倍量のＣＨ2 Ｃｌ2
にて抽出した。有機相部を分離し蒸発乾固した。乾燥残
渣を少量のメタノール（全ブロス量の１／１００）に再
溶解して検定及び続いて分画ＨＰＬＣ分離に用いた。最
初の分画ＨＰＬＣ分離はベックマン・ウルトラスフェア
Ｃ18カラム（１０mm×２５cm）にて行った。本勾配表
は、流速３．０ml／分で４５分間で計った本検定方法に
記載のものと同じであった。画分は各２分毎に集められ
た。燐酸を数滴のＮＨ4 ＯＨで中和した後に蒸発乾固し
た。乾燥残渣をメタノール（１．００ml）に再溶解し、
そして分析用ＨＰＬＣで評価した。それらしい代謝物を
含有する画分をＩＬ−２検定にかけた。ＩＬ−２検定で
試験陽性の試料は、一段階目分画ＨＰＬＣと同じ溶出法
を用いて、ベックマン・シアノ・カラム（１０mm×２５
cm）の二段階目の分画ＨＰＬＣにて更に純化した。Ｃ−
２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０の保留時間は１
６．２７分であった。
上清液を分離した。真空下蒸溜により、本混合物からメ
タノールを除去した。水性残渣を二倍量のＣＨ2 Ｃｌ2
にて抽出した。有機相部を分離し蒸発乾固した。乾燥残
渣を少量のメタノール（全ブロス量の１／１００）に再
溶解して検定及び続いて分画ＨＰＬＣ分離に用いた。最
初の分画ＨＰＬＣ分離はベックマン・ウルトラスフェア
Ｃ18カラム（１０mm×２５cm）にて行った。本勾配表
は、流速３．０ml／分で４５分間で計った本検定方法に
記載のものと同じであった。画分は各２分毎に集められ
た。燐酸を数滴のＮＨ4 ＯＨで中和した後に蒸発乾固し
た。乾燥残渣をメタノール（１．００ml）に再溶解し、
そして分析用ＨＰＬＣで評価した。それらしい代謝物を
含有する画分をＩＬ−２検定にかけた。ＩＬ−２検定で
試験陽性の試料は、一段階目分画ＨＰＬＣと同じ溶出法
を用いて、ベックマン・シアノ・カラム（１０mm×２５
cm）の二段階目の分画ＨＰＬＣにて更に純化した。Ｃ−
２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０の保留時間は１
６．２７分であった。
【００４９】質量分析データ 培養菌株ＭＡ６８３２を用いたＦＲ−９００５２０の培
養により得られた上記の生体内転換製造物の質量分析ス
ペクトル検査は、ヒドロキシル化の発生を指摘してい
る。図１のスペクトルに見られるようにＮＭＲデータ
は、Ｃ−２１でのヒドロキシル化の発生と一致する。決
め手となる特徴は、現在１．４３ppm で出る１９−メチ
ルピークの上昇置換、典型的なＨ−２０ダブレットの欠
如、そして修正した環境下でＨ−２０として同定された
５．２０ppm で僅かに広くなったシングレットの存在で
ある。シングレットの特徴はＨ−２１が欠如しているこ
とを意味した。５．２０ppm の化学的変化は、ＦＲ−９
００５２０中のＨ−２０の位置からの０．２ppm 降下で
ある。この推測は、二重照射実験で３６−メチルの照射
が３５−メチレンを壊してシングレットにしたという結
果により補強された。
養により得られた上記の生体内転換製造物の質量分析ス
ペクトル検査は、ヒドロキシル化の発生を指摘してい
る。図１のスペクトルに見られるようにＮＭＲデータ
は、Ｃ−２１でのヒドロキシル化の発生と一致する。決
め手となる特徴は、現在１．４３ppm で出る１９−メチ
ルピークの上昇置換、典型的なＨ−２０ダブレットの欠
如、そして修正した環境下でＨ−２０として同定された
５．２０ppm で僅かに広くなったシングレットの存在で
ある。シングレットの特徴はＨ−２１が欠如しているこ
とを意味した。５．２０ppm の化学的変化は、ＦＲ−９
００５２０中のＨ−２０の位置からの０．２ppm 降下で
ある。この推測は、二重照射実験で３６−メチルの照射
が３５−メチレンを壊してシングレットにしたという結
果により補強された。
【化１】 指定した分子構造を上記及び図１に示す。
【００５０】実施例２ Ｔ−細胞増殖評価 １．試料の調製 上記のＨＰＬＣで調製された精製Ｃ−２１ヒドロキシル
化ＦＲ−９００５２０を無水エタノールに１mg／mlに溶
解した。
化ＦＲ−９００５２０を無水エタノールに１mg／mlに溶
解した。
【００５１】２．評価 Ｃ５７Ｂ１／６マウスからの脾臓を滅菌条件下で採取
し、１０％熱−不活性化牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ，グラ
ンド・アイランド，ニューヨーク）で補強した氷冷ＲＰ
ＭＩ １６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ）中で徐々に解離
した。細胞を１５００rpm で８分間遠心分離することに
よりペレット化した。ペレットを塩化アンモニウム溶解
緩衝液（ＧＩＢＣＯ）を使用して４℃で２分間処理する
ことにより含まれている赤血球を除去した。冷培地を加
えて細胞を再度１５００rpm で８分間遠心分離した。次
に、下記のようにナイロン布カラム上で細胞懸濁液を分
離することによりＴ−リンパ球を単離した。：約４ｇの
洗浄し乾燥したナイロン布を２０mlのプラスチック製注
射器に充填することによりナイロン布カラムを調製し
た。このカラムを２５０°Ｆで３０分間オートクレーブ
にかけて滅菌した。ナイロン布カラムを温（３７℃）培
養培地を用いて湿らせ、同じ培地で洗浄した。洗浄済脾
臓細胞を温培地に再懸濁させたものを徐々にナイロン布
に移した。次に、カラムを直立させて３７℃で１時間培
養した。非付着性Ｔ−リンパ球は温培養培地と共にカラ
ムから溶出され、細胞懸濁液は上記のように脱水器にか
けられた。
し、１０％熱−不活性化牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ，グラ
ンド・アイランド，ニューヨーク）で補強した氷冷ＲＰ
ＭＩ １６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ）中で徐々に解離
した。細胞を１５００rpm で８分間遠心分離することに
よりペレット化した。ペレットを塩化アンモニウム溶解
緩衝液（ＧＩＢＣＯ）を使用して４℃で２分間処理する
ことにより含まれている赤血球を除去した。冷培地を加
えて細胞を再度１５００rpm で８分間遠心分離した。次
に、下記のようにナイロン布カラム上で細胞懸濁液を分
離することによりＴ−リンパ球を単離した。：約４ｇの
洗浄し乾燥したナイロン布を２０mlのプラスチック製注
射器に充填することによりナイロン布カラムを調製し
た。このカラムを２５０°Ｆで３０分間オートクレーブ
にかけて滅菌した。ナイロン布カラムを温（３７℃）培
養培地を用いて湿らせ、同じ培地で洗浄した。洗浄済脾
臓細胞を温培地に再懸濁させたものを徐々にナイロン布
に移した。次に、カラムを直立させて３７℃で１時間培
養した。非付着性Ｔ−リンパ球は温培養培地と共にカラ
ムから溶出され、細胞懸濁液は上記のように脱水器にか
けられた。
【００５２】精製したＴ−リンパ球を、１０％熱−不活
性化牛胎児血清、１００mMグルタミン、１mMピルビン酸
ナトリウム、２×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール
及び５０μg ／mlゲンタマイシンと共にＲＰＭＩ １６
４０培地で構成する完全培養培地に２．５×１０5 細胞
／mlで再懸濁した。イオノマイシンは２５０ng／mlで加
え、ＰＭＡは１０ng／mlで加えた。細胞懸濁液を直ちに
２００μl ／孔ずつ９６孔平底菌体板（コースター）に
分注した。次に、供試薬を含まない培地である対照品及
び試験すべき下記に示す種々希釈試料液（上述の精製Ｃ
−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０）を２０μl
／孔ずつ３連の孔に加えた。ＦＲ−９００５０６を標準
として使用した。次に、培養板を、３７℃で５％ＣＯ2
−９５％空気の加湿環境の中で４４時間培養した。Ｔ−
リンパ球増殖は、トリチウム化チミジン結合を測定する
ことにより評価した。４４時間の培養後、細胞はトリチ
ウム化チミジン（ＭＥＮ、ケンブリッジ市、マサチュー
セッツ州）の２μ Ｃｉ／孔を使用して同位体識別を行
った。更に、４時間の培養後、培養菌株を多管式試料採
取器を用いてガラス繊維フィルター上に採取した。個々
の孔に対応するフィルター・ディスクの放射能を標準液
体シンチレーション計測法（ベーターカウンター）によ
り測定した。多くの孔の１分間当りの平均値を計算し、
次のように結果をトリチウム化チミジンの取り込み（増
殖）抑制％として表した：
性化牛胎児血清、１００mMグルタミン、１mMピルビン酸
ナトリウム、２×１０-5Ｍ ２−メルカプトエタノール
及び５０μg ／mlゲンタマイシンと共にＲＰＭＩ １６
４０培地で構成する完全培養培地に２．５×１０5 細胞
／mlで再懸濁した。イオノマイシンは２５０ng／mlで加
え、ＰＭＡは１０ng／mlで加えた。細胞懸濁液を直ちに
２００μl ／孔ずつ９６孔平底菌体板（コースター）に
分注した。次に、供試薬を含まない培地である対照品及
び試験すべき下記に示す種々希釈試料液（上述の精製Ｃ
−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０）を２０μl
／孔ずつ３連の孔に加えた。ＦＲ−９００５０６を標準
として使用した。次に、培養板を、３７℃で５％ＣＯ2
−９５％空気の加湿環境の中で４４時間培養した。Ｔ−
リンパ球増殖は、トリチウム化チミジン結合を測定する
ことにより評価した。４４時間の培養後、細胞はトリチ
ウム化チミジン（ＭＥＮ、ケンブリッジ市、マサチュー
セッツ州）の２μ Ｃｉ／孔を使用して同位体識別を行
った。更に、４時間の培養後、培養菌株を多管式試料採
取器を用いてガラス繊維フィルター上に採取した。個々
の孔に対応するフィルター・ディスクの放射能を標準液
体シンチレーション計測法（ベーターカウンター）によ
り測定した。多くの孔の１分間当りの平均値を計算し、
次のように結果をトリチウム化チミジンの取り込み（増
殖）抑制％として表した：
【数１】
【００５３】Ｃ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２
０（“２１−ＯＨ−５９０”）の種々の濃度での抑制％
の結果は次の表に示した： 表 イオノマイシン＋ＰＭＡにて活性化されたマウスＴ−細胞の増殖応答に於ける２ １−ＯＨ−５９０の影響 ──────────────────────────────────── 試料 濃度 抑制％ （ng／ml） ＮｏＦＫ−５０６ ＋ＦＫ−５０６ （１．２nM） ──────────────────────────────────── 培地（対照） ０ ９７ ２１−ＯＨ−５９０ １０００ ０ ０ ５００ ０ ０ ２５０ ０ ６３ １２５ ０ ９４ ──────────────────────────────────── イオノマイシン＋ＰＭＡ活性化Ｔ−細胞の増殖応答はト
リチウム化チミジンの結合により測定される。データに
見られる如く、２１−ＯＨ−５９０はＦＫ−５０６免疫
抑制剤の純粋な拮抗剤である。 注意事項：１．マウスＴ−細胞培養菌株は、４８時間目
採収の４時間前に3 Ｈ−チミジンで同位体識別処理をし
た。 ２．標準ＦＲ−９００５０６（１０ng／ml）は９９％抑
制をする。
０（“２１−ＯＨ−５９０”）の種々の濃度での抑制％
の結果は次の表に示した： 表 イオノマイシン＋ＰＭＡにて活性化されたマウスＴ−細胞の増殖応答に於ける２ １−ＯＨ−５９０の影響 ──────────────────────────────────── 試料 濃度 抑制％ （ng／ml） ＮｏＦＫ−５０６ ＋ＦＫ−５０６ （１．２nM） ──────────────────────────────────── 培地（対照） ０ ９７ ２１−ＯＨ−５９０ １０００ ０ ０ ５００ ０ ０ ２５０ ０ ６３ １２５ ０ ９４ ──────────────────────────────────── イオノマイシン＋ＰＭＡ活性化Ｔ−細胞の増殖応答はト
リチウム化チミジンの結合により測定される。データに
見られる如く、２１−ＯＨ−５９０はＦＫ−５０６免疫
抑制剤の純粋な拮抗剤である。 注意事項：１．マウスＴ−細胞培養菌株は、４８時間目
採収の４時間前に3 Ｈ−チミジンで同位体識別処理をし
た。 ２．標準ＦＲ−９００５０６（１０ng／ml）は９９％抑
制をする。
【図１】図１は、Ｃ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００
５２０の指定された分子構造も説明している、４００MH
z で撮ったＣＤＣｌ3 中のＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ
−９００５２０の1 Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル
である。
５２０の指定された分子構造も説明している、４００MH
z で撮ったＣＤＣｌ3 中のＣ−２１ヒドロキシル化ＦＲ
−９００５２０の1 Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:55） (72)発明者 マリア テー．ディエス−マタス スペイン，28010 マドリッド，シー／オ リド，４ (72)発明者 ジョルジェット デゼニィ アメリカ合衆国，07078 ニュージャーシ ィ，ショート ヒルズ，テニソン ドライ ヴ 149 (72)発明者 ローレンス エフ．コルウェル，ジュニア アメリカ合衆国，07724 ニュージャーシ ィ，イートンタウン，プリンセス レーン ５ (72)発明者 バイロン エッチ．アリソン アメリカ合衆国，07060 ニュージャーシ ィ，ウォッチュング，センチュリー レー ン 88 (72)発明者 フランシス デュモン アメリカ合衆国，07065 ニュージャーシ ィ，ローウェイ，ウエスト チェリー ス トリート 54
Claims (9)
- 【請求項１】 ストレプトミセス・ハイグロスコピクス
の菌株をＦＲ−９００５２０と共に、窒素栄養分を含む
液体炭水化物培地中液面下の好気的醗酵条件下で、Ｃ−
２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０を生産するのに
充分な時間培養する工程からなる、Ｃ−２１ヒドロキシ
ル化ＦＲ−９００５２０として同定されたＦＫ−５０６
拮抗剤の製造方法。 - 【請求項２】 そのストレプトミセス菌がＡＴＣＣ No.
５５１６６である請求項１の製法。 - 【請求項３】 請求項１の製法により製造された無濾過
ブロスであって、Ｃ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００
５２０及び本微生物を含有するもの。 - 【請求項４】 請求項１の上述の製法により製造された
ＦＫ−５０６拮抗生産物。 - 【請求項５】 図１の如きプロトン核磁気スペクトルを
示すＦＫ−５０６拮抗剤、Ｃ−２１ヒドロキシル化ＦＲ
−９００５２０。 - 【請求項６】 図１の如き分子構造を持つＦＫ−５０６
拮抗剤、Ｃ−２１ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０。 - 【請求項７】 薬理学的に許容され本質的に非毒性の担
体又は賦形剤と組み合わせた治療上有効な量のＣ−２１
ヒドロキシル化ＦＲ−９００５２０を含有する薬理学的
組成物。 - 【請求項８】 移植拒絶反応防止の療法、又は自己免疫
疾患又は感染症の処置中に起こるＦＫ−５０６の過剰投
与を防ぐ為に、治療上有効な量のＣ−２１ヒドロキシル
化ＦＲ−９００５２０をヒト宿主に対して投与する使用
法。 - 【請求項９】 ストレプトミセス・ハイグロスコピクス
（ＭＡ６８３２）、ＡＴＣＣ No.５５１６６の微生物学
的に純粋な培養菌体。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72032091A | 1991-06-25 | 1991-06-25 | |
| US07/720,550 US5225403A (en) | 1991-06-25 | 1991-06-25 | C-21 hydroxylated FK-506 antagonist |
| US720550 | 1991-06-25 | ||
| US720320 | 1991-06-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06153974A true JPH06153974A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=27110234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4167455A Pending JPH06153974A (ja) | 1991-06-25 | 1992-06-25 | 新規なｃ−２１ヒドロキシル化ｆｋ−５０６拮抗剤 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0520554A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06153974A (ja) |
| CA (1) | CA2071332A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019534302A (ja) * | 2016-11-10 | 2019-11-28 | ノバルティス アーゲー | Ｂｍｐ増強剤 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3853477T2 (de) * | 1987-12-09 | 1995-11-09 | Fisons Plc | Makrozyklische verbindungen. |
| DK0406791T3 (da) * | 1989-07-05 | 1995-03-27 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vandigt flydende præparat til ekstern anvendelse |
-
1992
- 1992-06-16 CA CA002071332A patent/CA2071332A1/en not_active Abandoned
- 1992-06-17 EP EP19920201769 patent/EP0520554A3/en not_active Withdrawn
- 1992-06-25 JP JP4167455A patent/JPH06153974A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2019534302A (ja) * | 2016-11-10 | 2019-11-28 | ノバルティス アーゲー | Ｂｍｐ増強剤 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0520554A2 (en) | 1992-12-30 |
| CA2071332A1 (en) | 1992-12-26 |
| EP0520554A3 (en) | 1993-12-01 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19950405 |