JPH0374388A - 新規なｌ―６８３，５９０の微生物変換生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なＬ−６７９，９３４免疫抑制剤拮抗物質
であるＬ−６８６，２９２、及びその生産に微生物アク
チノプラナセート・エスピー（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａ
ｃｅｔｅ　ｓｐ、）（Ｍ　Ａ　６５５９　）、ＡＴＣＣ
Ｎｏ、５３７７１を使用する発酵方法に関する。この方
法は微生物と■、６８３．５９０とをＬ−６８３，５９
０の０１５とＣ−３１のビスデメチル化が起こる条件下
で培養することを含む。

１９８３年、米国ＦＤＡは臓器移植外科領域に革命を起
こした極めて有効な抗拒絶反応薬であるサイクロスポリ
ンを認可した。この薬品は体の免疫系において、移植臓
器の外来蛋白質を拒絶する天然の保護物質の巨大な武器
庫が作動するのを阻害することにより作用する。

この薬品は臓器移植拒絶反応との戦いに有効である一方
、腎不全、肝臓損害及び潰瘍を起こし、それらは多くの
場合極めて重篤になり得る欠点を持つ。

フジサワ（Ｆｕｊｉｓａｔｉａ）に対する欧州特許出願
公開第０１８４１６２号は、サイクロスポリンより１０
０倍有効と言われる新規なマクロライド免疫抑制剤ＦＫ
　−５０６を記述しており、前記文献は参考例としてこ
こに組み入れる。このマイクロライドはス１〜レブトマ
イセス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔ；ｏｍｙｃｅｓ
ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓｊ、ｓ）の特別な株の発酵により
生産される。又ニス・バイグロスコピカス・サブスプ°
ヤクシマエンシス（Ｓ、　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｊｃｕｓ
ｓｕｂｓｐ、　ｙａｋｕｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ）により
生産される極めて近縁のマクロライド免疫抑制剤ＦＫ５
２０も記述されている。

ティー・アライ（Ｔ、Ａｒａｉ）に対する米国特許第３
，２４４，５９２号は、抗カビ性物質「アスコマイシン
（ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）Ｊ　を生産するストリプ１−マ
イセス・ハイクロスコピカス・バール・アスコマイセテ
ィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐ
ｉｃｕｓ　ｖａｒ、　ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）の
培養を記述している。

しかしながら、これらの文献には実質的にＬ−６７９，
９３４の免疫抑制剤効果を逆転し、そのままでサイクロ
スポリンのような他の化学物質群と対抗するＦＫ−５０
６マクロライ３ トキシ基から２つのメチル基を除くための充分な時間行
うことにより得ることができることを見出した。Ｌ−６
８６，２９２は、Ｌ６８３．５９０のＣ−工３、Ｃ−１
５及びＣ３１のトリステメチル化類似体であるＬ６８７
．７９５　　に伴って発酵液中に形成される少量発酵生
産物であり、このことは同一譲受人を有する１９８９年
５月５日に出願し出願継続中の米国特許第３４．８　、
２４．３号（Ｃａｓｅ　１７９１１）に開示されており
、前記文献は参考例としてここに組み入れる。発酵液中
の主要成分は、同一の発明者と譲受人を有する１９８９
年１月１３日に出願した米国特許願第２９７，６３０号
（Ｃａｓｅ　１７８３２）に記述されているＬ−６８３
，５９０のＣ−１３とＣ−３１がビスデメチル化された
環再編戊誘導体であるＬ−６８３，７５６、及び同一の
譲受人を有する１９８８年６月２９日に出願した米国特
許願第２１３，０２５号（Ｃａｓｅｌ、　７７６７　）
に記述されているＬ− ド型活性の決定に要する有用性を持つ如何なるＬ−６７
９，９３４拮抗物質の生産についても記述されていない
。

第上図は４００ＭＨｚで測定したＣＤＣＱ３中Ｔ−６８
９，２９２の″Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルであ
り、またＬ−６８６，２９２の分子構造を示している。

第２図は４００ＭＨｚで測定したＣＤＣＱ３中Ｌ−６８
３，５９０（イムノマイシン（ｊｍｍｕｎｏｍｙｃｉｎ
）　）の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。

新規なＬ−６７９，９３４拮抗物質であるＬ６８６．２
９２　は、微生物アクチノプラナセート・エスピー（Ｍ
Ａ　　６５５９）、ＡＴＣＣＮｏ、５３７７１を、窒素
栄養原を含む水性炭水化物培地中で深部好気的条件下で
、マクロライド免疫抑制剤Ｌ−６８３，５９０の存在下
で発酵させ、前記発酵は約７のｐＨでＬ６８３．５９０
のＣ−１５とＣ−３］−を選択的にビスデメチル化、す
なわち２つの異なるメ４ ６８３．５９０　のモノデメチル化類似体であるＬ−６
８３，７４２を含み、両文献はこの特別の目的のため参
考例としてここに組み入れる。

生成するＬ−６８６，２９２はＬ　−６７９、９３４拮
抗物質活性、すなわちカルシウムイオノホア（イオノマ
イシン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ））とホルボールミリステ
ー１−アセテート（ＰＭＡ）で誘導されるＴ細胞増殖試
験により証明される、Ｌ−６７９，９３４により引き起
こされるＴ細胞活性化の阻害の逆転を示し、前記試験は
ここでは「Ｔ細胞増殖試験」と呼称する。この試験法の
原理は、イオノマイシンとＰＭＡの組み合わせにより刺
激されるマウス下リンパ球の増殖を測定することである
。Ｌ６７９．９３４　　はこの試験でＴ細胞増殖を明害
し、これはトリチウム化チミジン取り込みの減少によっ
て示される。このＴ細胞増殖の阻害は、Ｌ−６７９，９
３４による阻害を仲介する細胞質ゾル結合タンパク質又
は分子と結６− 合する化合物、例えばＬ−６８６，２９２により逆転さ
せることができる。この場合桔抗物質Ｔ、、−６８６，
２９２による標的分子への競合的結合は、Ｔ細胞増殖の
阻害を仲介しない。この新しく発見されたタンパク質は
、１９８９年１月上り日に出願した米国特許願第３００
，６５９号（Ｃａｓｅ　１７８６６）に開示されており
、この特別な目的のため参考例としてここに組み入れる
。

本発明により、アクチノブラナセート・エスピーの株を
、窒素栄養原を含む水性炭水化物培地中で深部好気的条
件下で、Ｌ６８３．５９０と共に培養することにより生
産されるＩ、−６８６，２９２と称するＬ６７９．９３
／４拮抗物質が提供される。

新規な拮抗物質Ｌ−６８６，２９２はＴ細胞増殖試験に
より測定されるＬ−６７９，９３４が仲介するＴ細胞活
性化の阻害の逆転を示し、第１図に示すプロ１−ン核磁
気共鳴スペク１ヘルを示し、また電子衝撃質量スペクト
ル分析にス（Ａ　ｃｔｊ、ｎｏｍｙｃｅｔａｌ、ｅｓ）
目とアクチノフ０ラナセア（Ａｃｔｊｎｏｐｌａｎａｃ
ｅａ）科に組み入れられた。

更にこの微生物の属と種を最終的に決定するため分類学
的特徴が試験されている。

この培養はトリプチケース・ソイ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓ
ｅ　５ｏｙ）寒天（２８°及び３７℃）、酵母麦芽エキ
ス寒天、グリセリンアスパラギン寒天、無機塩スターチ
寒天、オー１〜ミール寒天、ツアペック・ドックス（Ｃ
ｚａｐｅｋ　Ｄｏｘ）　、ツァペツク溶液寒天及びパブ
１寒天様天、並びにベネッＩ〜（Ｂｅｎｎｅｔｔ）寒天
を含む通常培地で、すべて２８℃でよく発育する。

土星生 この培養は直径０．２〜０．４ミクロンの分岐した糸状
菌糸として発育する。コロニーは不透明で盛り上がり、
縁番工浸食されている。

コロニーの組織は酵母麦芽エキス寒天ではゴム状である
が、他の培地ではバター状となる傾向があり、この場合
著しい菌糸の分断が認められる。コロニーの表面は粉状
の外観とな９ より求められる７６３の分子量を持つ。

本発明はＬ−６８３，５９０と共にアクチノプラナセー
ト・エスピーＭＡ　　６５５９を発酵させてＬ−６８６
，２９２を生産することを含む。この微生物は現在メリ
ーラント（阿ａｒｙｌａｎｄ）　、ロックビル（Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ）、バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌ
ａｔｉｎ　Ｄｒｊ、ｖｅ）１２３０１に存在するアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ　ｍ　ｅ
ｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ）にＡＴＣＣＮｏ。

５３７７１として、及びニュー・シャーシー　（Ｎｅｗ
　Ｊｅｒｓｅｙ）、ローウェイ　（Ｒａｈｗａｙ）に存
在するメルク・カルチャー・コレクション（Ｍｅｒｃｋ
　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＭＡ−６
５５９として制限した寄託がなされている。物理的性質
並びに生態学的、培養、生物学的及び生理学的性質を含
む分類学を以下に簡単に記述する。

これまでなされた分類学的分析に基づいて、この培養は
暫定的にアクチノミセターレる傾向がある。浸透性色素
は観察されなかった。

胞子嚢 大部分は球状であり、大きさは直径４〜２５ミクロンの
範囲にある。胞子嚢は一般に２１日目上認められ、グリ
セリンアスパラギン寒天上では合体する傾向がある。胞
子は鈍端で棒状（０，７６Ｘ　１．９０ミクロン）、非
運動性であり、長さが１５０ミクロンに及ぶ長く分岐し
ない鎖として存在する。

ＭＡ　６５５９の培養的特徴 酵母エキス−麦芽エキス寒天（ＩＳ　Ｐ　Ｍｅｄｉｕｍ
２　）栄養菌糸はガラス状ないし黄色であり、気菌糸は
２４〜７２時間に形成され、淡黄色ないし淡紅色で粉状
の外観を呈する。裏面は黄褐色ないし赤褐色である。

オートミール寒天（Ｉ　Ｓ　Ｐ　Ｍｅｄｉｕｍ　３）気
菌糸はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状ない
し黄褐色である。気中発育は白色ないし淡紅ベージュ色
で粉状の外観を呈０ する。

無機塩−スターチ寒天（Ｉ　ＳＰ　Ｍｅｄｉｕｍ　４）
軽度の発育で気菌糸は乏しい。栄養発育はガラス状で高
度に分断している。コロニーの周囲に澱粉の液化が７日
日に認められる。

グリセリンアスパラギン寒天（ＩＳ　Ｐ　Ｍｅｄｉｕｍ
５） 栄養発育はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状
ないし肉桂色である。気菌糸は粉状で白色ないし淡紅色
である。

ペプチド−鉄−酵母エキス寒天（ＩＳ　Ｐ　Ｍｅｄｉｕ
ｍ６） 栄養発育は黄褐色である。気中発育は認められず、メラ
ニン様色素は生産されない。

チロシン寒天（Ｉ　ＳＰ　Ｍｅｄｉｕｍ　７）栄養発育
は黄褐色で培養日数と共に濃紫色となる。気菌糸はビロ
ード状ないし灰色がかった紅ベージュ色である。

ツアペック・ドノクス寒天 栄養発育は黄褐色で培養日数と共にピンク１１ 択することにより維持することができる。

栄養培地中の好ましい炭素原は、グルコース、キシロー
ス、ガラクトース、グリセリン、スターチ、デキストリ
ンなどのような炭水化物である。マルＩ・−ス、ラムノ
ース、ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリ
シン、コハク酸ナトリウムなどのような他の材料も含め
ることができる。

好ましい窒素原は酵母エキス、肉エキス、ペプＩ−ン、
グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール、及び他の植
物性ミール（部分又は完全脱脂）、カゼイン加水分解物
、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーンステイー
プリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザ−ミール、落花
生粉、ディスティラースソリューブルスなど、並びにア
ンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムなど）、尿素、アミノ酸など
のような無機及び有機窒素化合物である。

炭素原と窒素原は組み合わせて好便に使用３− 色を帯びる。気菌糸は短くマット状で湿った外観を呈す
る。

本発明の方法は任意のアクチノブラナセート・エスピー
のｒＬ−６８６，２９２生産性ｊ株を使用して実行する
ことができ、特にＡＴＣＣＮｏ、５３７７１株が好まし
い。

一般に、Ｌ−６８６，２９２は、上述の「Ｌ−６８６，
２９２生産株」を同化性炭素原及び窒素原を含む水性培
地中でＬ−６８３，５９０の存在下で、好ましくは深部
好気的条件（例えば振盪培養、深部培養等）下で培養（
発酵）することにより生産することができる。水性培地
は発酵過程の開始期と終期（収穫）に約７のｐ　Ｈに維
持するのが好ましい。より高いｐＨは実質的及び／又は
完全な生産物の喪失につながる。望ましいｐＨはモルホ
リノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリノプロパン
スルホン酸（ＭＯＰ　Ｓ　）などのような緩衝剤を使用
するか、又は以下に記述する生産培地のような本来緩衝
能を持つ栄養原材料を選２− されるが、それらは純粋な形態で使用する必要はなく、
というのは痕跡量の成長因子及び相当量の鉱物質栄養原
を含むより純度の低い材料も使用に適しているからであ
る。所望の場合、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン
酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウ
ム、ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、
銅塩、コバルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加す
ることができる。必要により、特に培養培地が著しく泡
立つ場合、流動性パラフィン、動物油、植物油、鉱物油
又はシリコンのような消泡剤を添加することができる。

Ｌ−６８３，５９０出発物質は、米国特許第３．２４４
，５９２号に記載されているようにニス・バイグロスコ
ピカス・バール・アスコマイセティカス、ＡＴＣＣＮｏ
、１．４８９１の発酵により、及びフジサワに対する欧
州特許出願公開第Ｏ工８４１．６２号に記述されている
ように、ニス・バイグロスコピカス４ ・サブスブ・ヤクシマエンシスＮｏ、　７２７８の発酵
（Ｌ−６８３，５９０と同一のＦＲ−９００５２Ｑ又は
ｒＦＫ−５２０Ｊ生産のため）により得ることができ、
前記参考例はこの特別な目的のため参考例としてここに
組み入れる。

Ｔ＝−６８６，２９２の大量生産の条件としては深部好
気的培養条件が好ましい。少量の生産のためには、フラ
スコ又は瓶による振盪培養又は表面培養が使用される。

更に大型槽で発育を実行する場合、Ｌ−６８６，２９２
の生産の過程におｌづる発育の遅延を避けるため微生物
の栄養形態を生産槽への植苗に使用するのが好ましい。

従って、先ずｒ斜面Ｊに生産された微生物の胞子又は菌
糸を比較的少量の培養培地に植菌し、前記植苗済み培地
（これを「種菌培地」とも称する）を培養して微生物の
栄養種菌を作り、次いで培養済み栄養種菌を無菌的に大
型槽に移植するのが望ましい。種菌を作るための発酵培
地は、Ｌ１２ この場合発酵培地のｐＨは収穫まで７．０に維持する。

好ましい発酵を実行するための培養／生産培地は次の培
地を含む。

種菌培地Ａ　　　　　　　　　　　ｇ／Ｌ−デキストロ
ース　　　　　　　　　　エ、０デキストリン　　　　
　　　　　　１０・０牛肉エキス　　　　　　　　　　
　　３．ＯＡｒｄａｍｉｎｅ　ｐＨ５、Ｏ ＮＺ　Ａｍ１ｎｃＴｙｐｅ　Ｅ　　　　　　　　　　５
　、０ＭｇＳＯ４・７　Ｈ２００，０５ に２ＨＰＯ４０，３７ ｐＨを７．１に調節 ＣａＣＯ３０，５ｇ／ｌ添加 変換培地Ｂ　　　　　　　　　　　ｇ／ｌグルコース　
　　　　　　　　　１０ ｔ（ｙｃａｓｅ　Ｓ　Ｆ　　　　　　　　　　　　２牛
肉エキス　　　　　　　　　　　　１コーンスイープリ
カー　　　　　　　３ｐ　Ｈを７．０に調節 １７ ６８６．２９２　の生産に使用する培地と実質的に同一
か又は異なることができ、一般に植苗前培地は高圧加熱
して殺菌する。一般に培地のｐ　Ｈは高圧加熱前、酸又
は塩基を、好ましくは緩衝溶液の形態で適当に添加する
ことにより約７．０　　に調節する。

培養混合物の撹拌と通気は種々な方法で実現することが
できる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌装置によ
り、発酵槽を回転又は振盪することにより、種々なポン
プ装置により、又は気菌空気を培地に通気することによ
りなされる。通気は力り菌空気を発酵混合物に通過させ
ることにより実行することができる。

発酵は通常約２０℃と４０’Ｃの間好ましくは２５〜３
５°Ｃの温度で約１０時間〜２４時間行うが、これら条
件は発酵の条件と規模により変動させることができる。

好ましくは、生産培養は２２Ｏｒｐｍで作動する回転振
盪機上で２７℃で約２４時間インキュベートし、６− 生産されたＬ−６８６，２９２は、他の公知の生物学的
活性物質の回収に一般に使用される通常の方法により培
養培地から回収することができる。生成したＬ−６８６
，２９２物質は培養菌糸と炉液中に存在し、従って培養
液を濾過又は遠心分離して得られる菌糸とφ液から、減
圧下濃縮、凍結乾燥、メタノールなどのような通常の溶
液による抽出、ｐ　Ｈ調節、通常の樹脂（例えばアニオ
ン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）に
よる処理、通常の吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸、シリ
カゲル、セルロース、アルミナなど）による処理、結晶
化、再結晶化などの通常の方法により単離することがで
きる。好ましい方法は溶媒抽出、特にメタノールを使用
するそれである。

発酵から得られる生産物Ｌ−６８６，２９２は「Ｔ細胞
増殖試験ｊでＬ−６７９，９３４拮抗物質活性を示し、
これに基づく用途を持ち、次の １８ ］−１白色無定形粉末、 ２．メタノールに溶解、 ３、電子衝撃質量スペクトル分析で求めると７６３の分
子量を持ち、第１図の選 定した分子構造と一致する 物理的性質を示す。

上述の発酵方法により得られる工、− ６８６，２９２は、通常の方法、例えば抽出、沈殿、分
画結晶化、再結晶化、クロマ１〜グラフイーなどにより
単離し精製することができる。

物質の適当な式は、酢酸エステルのような分子の水酸基
により形成されるＬ− ６８６，２９２の通常の医薬的に受容可能な生分解性エ
ステルも含むことができる。

上述の発酵反応と生成する発酵混合物の後処理において
、Ｌ−６８６，２９２のへミケタール環系の再編成によ
るものを含むＬ６８６．２９２　の互変異性体及び配座
異性体（一つ又は複数）も本発明の範囲に含まれるこ＝
１９＝ ０．３７、及びＣａＣＯ２０，５（グラム／リッターの
単位で）からなる高圧加熱（殺菌）した種菌培地Ａの５
０ｍＱを含む２５０ｍＱ邪魔板付き振盪フラスコに植菌
するのに用いた。種菌培地のｐ、　Ｈを高圧加熱前　７
．１−に調節した。種菌を種菌培地中で、２２０ｒｐｍ
で作動する回転振盪機で２７°Ｃ１２４時間インキュベ
ートした。得られる種菌培地の２．５ｍＱを、下記の予
め高圧加熱（殺菌）した変換培地Ｂの５０ｍＱを含む２
５０ｍＱ、の邪魔板のない振盪フラスコに植菌するのに
使用した。Ｌ−６８３，５９０をジメチルスルホキシド
溶液として０．１ｍｇ／ｍΩの最終濃度となるように添
加した。次いで振盪フラスコの内容を２２０ｒｐｍで作
動する振盪培養機で２７℃で２４時間インキュベートし
た。

］−０変換培地Ｂはグルコース１０．０、Ｈｙｃａｓｅ
　Ｓ　Ｆ　２　、　Ｏ１牛肉エキス１．０、コーンステ
イープリカー３．０（グラム／リッター）からなり、ｐ
Ｈを高圧加熱前、７．０１ とに注意すべきである。

本発明のＬ−６８６，２９２はＬ ６７９．９３４　拮抗物質活性を持ち、天然生成物発酵
液中のＦＫ−５０６マクロライド型免疫抑制剤の存在を
サイクロスポリンのような他の化学物質群から区別して
決定するための手段として診断学的に有用である。この
原理に基づく診断用装置は当業者にとって明白なことで
ある。

次の実施例は本発明を例証する目的で示すものであり、
本発明の範囲又は思想を限定するものと解釈すべきでは
ない。

寒塵−例□】− 微生物及び培養条件 （ＭＡ　６５５９）ＡＴＣＣＮｏ、５３７７１の凍結栄
養菌糸を融解し、デキストリン１０．０、デキストロー
ス１．０、牛肉エキス３．０、ａｒｄａｍｊｎｅ　Ｐ　
Ｈ（Ｙｅａｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。

Ｉｎｃ、）　５．Ｑ、Ｎ　−Ｚ　Ａｍ１ｎｅ　ｔｙｐｅ
　Ｅ　５．０、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，０５、ＫＨ２
ＰＯ４０ に調節した。

培　液からの単　及び精製　法 変換培地Ｂの全発酵液（５００ｍＲ）を塩化メチレン（
３Ｘ５００ｍＱ、）で抽出した。

塩化メチレン抽出液を合わせて、硫酸ナトリウム」二で
乾燥し、真空下で濃縮して油状残留物を得た。残留物を
アセトニトリルに溶解し、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）による精製を行った。

ＨＰＬＣはＷａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｊ、ｓｉｌ　　１．
　ＯＯＤ　Ｓ−３を使用する９、４ｍｍＸ２５ｃｍのカ
ラムで実行し、６０℃で２０５ｎｍと２２５ｎｍで監視
した。カラムは０．１％Ｈ，Ｐ　Ｏ，水溶液ＣＨ３ＣＮ
（５５：　４５）から０．１％Ｈ，Ｐ　Ｏ４水溶液−Ｃ
Ｈ３ＣＮ　（２０：８０）　に至るリニアグラジェント
で６０分間、３ｍ１ｌ！／分の流速で展開した。化合物
を上述の抽出液の注入を反復する間に集めた。リテンシ
ョンタイム２５分の画分を合わせ、ＰＨ６，５に調節し
、蒸発してアセトニトリルを除いた。化合物を２ ＣＸｌｌ５　ｅ　ｐ　−Ｐ　ａ　ｋ　　（Ｗａｔｅｒｓ
　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ）及びアセトニトリル−水の溶
離溶媒を使用して更に精製し、Ｌ−６８６，２９２と称
する生成物の１−　、２　ｍ　ｇを得た。

翌−塁 Ｌ−６８６，２９２はＮＭＲスペクトル分析により、選
定した分子構造を確認する第上図のプロトンＮＭＲスペ
クトルが得られたことにより確認された。

失遍虹巳え Ｔ細胞増殖試験 １、　試料の笠髪 上述のＨＰＬＣで調製した精製したＬ−６８６，２９２
を無水エタノールに１ｍｇ／ｍΩの濃度に溶解した。

２、　基腹遣 Ｃ５７Ｂ　ｉ　／　６マウスの肺臓を無菌的に取り出し
、１０％熱不活性化ウシつ児血清（ＧＩＢＣ○）を添加
した氷冷ＲＰＭ１１６４０培養培地（ＧＩＢ　ＣＯ、Ｇ
ｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、　Ｎ、　Ｙ、）２３− 精製したＴリンパ球を、１０％熱不活性化ウシつ児血清
、］０００ｍＭグルタミン１ｍＭピルビン酸ナトリウム
、２Ｘ１０−５Ｍ２−メルカプトエタノール及び５０μ
ｇ／ｍＱゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ　　１６４
０培地からなる完全培養培地に２．５　Ｘ　１０５細胞
／ｍＱとなるように再懸濁した。イオノマイシン２５０
ｎｇ／ｍＱ及びＰ　ＭＡ　１０　ｎｇ／ｍｆｆを添加し
た。この細胞＠濁液を直ちに９６槽平底ミクロ培養ＩＭ
（Ｃｏｓｔａｒ）に２００ＩＬｆｌ／槽分注した。イオ
ノマイシンとＰＭＡを含む培養を１．　ｎ　ｇ　／　ｍ
　Ｑ　　Ｌ−６７９、９３４（ＦＫ−５０６）を添加及
び無添加で、並びに試料（上述の生成したＬ−６８６，
２９２）の種々な下記稀釈液と共にインキュベー１−シ
た。Ｌ−６８６，２９２を２槽に２０μＱ／槽添加した
。次いで培養盤を５％Ｃ○２−９５％空気の加湿した気
中で３７℃、４４時間インキュベー１〜した。Ｔリンパ
球の増殖を、１〜リチウム化チミジンの取り込みの測定
により評５ 中で穏やかに分散させた。細胞を１５０Ｏｒｐｍで８分
間遠心分離してペレット化した。混入する赤血球細胞を
、ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＣ○
）で４℃、２分間処理して除いた。冷培地を添加し、細
胞を再び１．５００　ｒ　ｐ　ｍで８分間遠心分離した
。次いで細胞懸濁液を次のようにナイロン毛カラム上で
分離することによりＴリンパ球を分離した。すなわち、
洗浄し乾燥したナイロン毛の約４ｇを２０　ｍ　Ｑのプ
ラスチック製注射筒に充填してナイロン毛カラムを調製
した。カラムを１２１”Ｃ（２５０’Ｆ　）で３０分間
高圧加熱して殺菌した。ナイロン毛カラムを温（３７℃
）培養培地で湿らせ、同一培地で洗浄した。洗浄した肺
臓細胞を温培地に再懸濁し、これをゆっくりナイロン毛
にかけた。次いでカラムを直立の位置で３７℃、工時間
インキュベートした。付着しないＴリンパ球を温培養培
地と共にカラムから溶離し、細胞懸濁液を上のように遠
心分離した。

４− 価した。４４時間培養後、細胞を２μＣｉ／槽のトリチ
ウム化チミジン（Ｎ　Ｅ　Ｎ　、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

ＭＡ）により放射能付標した。更に４時間インキュベー
ション後、培養を多重試料収穫器を用いてガラス繊維フ
ィルター上に収穫した。個々の槽に相当するフィルター
ディスクの放射能を、標準の液体シンチレーション計数
法（Ｂｅｔａｃｏｕｎｔｅｒ）により測定した。繰り返
しの槽の上分間当たりの平均計数を算出し、結果を次の
ようにトリチウム化チミジン取り込み（増殖）の阻害％
として表した。

ｌｎｇ／ｍｆｌ　　Ｌ−６７９，９３４の存在及び不存
在下におけるＬ−６８６，２９２の種々な濃度における
阻害％の結果を次の表に示す。

６ １」 ００９９ ３１、　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　９
９６３　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　９
９１２５　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　
９６２５０　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　
　６５５００　　　　　　　　　　０　　　　　　　　
　　　３１０００　　　　　　　　　　０　　　　　　
　　　　　０註１．マウスＴ細胞培養は収穫前４８時間
に３Ｈ／チミジンで４時間付標した。

２、標準Ｌ−６７９，９３４（ｌｏｇ／ｍＱ）は９９％
阻害を示した。Ｌ−６７９，９３４の仲介する阻害のＩ
Ｃ，、ｏは０．３２ｎｇ／ｍ党（０，４ＨＭ）であった
。

３、Ｌ−６８６，２９２については逆転の７ 註１．阻害剤とＬ−６８６，２９２は培養開始時添加し
た。培養は収穫前４８時間に ３Ｈ−チミジンで４時間付標した。

上のデータよりＬ−６８６，２９２は、天然生成物培養
液中のＦＫ−５０６マクロライト型免疫抑制剤の存在を
、サイクロスポリンのような他の化合物群から区別して
決定する手段として診断学的に使用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は４００ＭＨｚで測定したＣＤＣα３中Ｌ−６８
９，２９２の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルであり、第２図
は４００　Ｍ　Ｈｚで測定したＣＤＣＱ３中Ｌ−６８３
，５９０の１Ｈ核磁気共鳴スペクトルである。 ９− ＩＣ，ｏ＝２５０ｎｇ／ｍＱ＝３２８ｎＭであり、一般
に１００〜４００Ｘ１０−９モルの範囲にあった。 ４、Ｌ−６７９，９３４による増殖阻害は５０単位／　
ｍ　Ｑの組換えヒトＩＬ−２の添加により逆転された。 里−星」 ま邊１１綾朱 Ｌ−６８６，２９２（ｎｇ／ｍＱ） ０００ ２５ ６２．５ ３１．３ 」む４通− Ｌ−６７９，９３４（Ｉｎｇ／ｍＱ、）」Ｗ詑竺 ９７．１ ４．７ ６５．７ ９３．４ ０００ ９５．６ ２８ 手続補正書 （１）別紙の通り 明細書１通を提出致しまず。 平成２年８月１７日 （２）別紙の通り、 正式図面１通を提１＋４致しまず。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ細胞増殖試験でＬ−６７９、９３４が仲介するＴ
   細胞活性化の阻害の逆転と、第１図に示すプロトン核磁
   気共鳴スペクトルと、電子衝撃質量スペクトル分析で７
   ６３の分子量を示すＬ−６８６、２９２と称するＬ−６
   ７９、９３４拮抗物質。 ２、第１図に示す分子構造を有するＬ−６７９、９３４
   拮抗物質であるＬ−６８６、２９２。