JPH0374388A - 新規なl―683,590の微生物変換生成物 - Google Patents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07D498/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なL−679,934免疫抑制剤拮抗物質
であるL−686,292、及びその生産に微生物アク
チノプラナセート・エスピー(Actinoplana
cete sp、)(M A 6559 )、ATCC
No、53771を使用する発酵方法に関する。この方
法は微生物と■、683.590とをL−683,59
0の015とC−31のビスデメチル化が起こる条件下
で培養することを含む。
であるL−686,292、及びその生産に微生物アク
チノプラナセート・エスピー(Actinoplana
cete sp、)(M A 6559 )、ATCC
No、53771を使用する発酵方法に関する。この方
法は微生物と■、683.590とをL−683,59
0の015とC−31のビスデメチル化が起こる条件下
で培養することを含む。
1983年、米国FDAは臓器移植外科領域に革命を起
こした極めて有効な抗拒絶反応薬であるサイクロスポリ
ンを認可した。この薬品は体の免疫系において、移植臓
器の外来蛋白質を拒絶する天然の保護物質の巨大な武器
庫が作動するのを阻害することにより作用する。
こした極めて有効な抗拒絶反応薬であるサイクロスポリ
ンを認可した。この薬品は体の免疫系において、移植臓
器の外来蛋白質を拒絶する天然の保護物質の巨大な武器
庫が作動するのを阻害することにより作用する。
この薬品は臓器移植拒絶反応との戦いに有効である一方
、腎不全、肝臓損害及び潰瘍を起こし、それらは多くの
場合極めて重篤になり得る欠点を持つ。
、腎不全、肝臓損害及び潰瘍を起こし、それらは多くの
場合極めて重篤になり得る欠点を持つ。
フジサワ(Fujisatia)に対する欧州特許出願
公開第0184162号は、サイクロスポリンより10
0倍有効と言われる新規なマクロライド免疫抑制剤FK
−506を記述しており、前記文献は参考例としてこ
こに組み入れる。このマイクロライドはス1〜レブトマ
イセス・ツクバエンシス(Strept;omyces
tsukubaensj、s)の特別な株の発酵により
生産される。又ニス・バイグロスコピカス・サブスプ°
ヤクシマエンシス(S、 hygroscopjcus
subsp、 yakushimaensis)により
生産される極めて近縁のマクロライド免疫抑制剤FK5
20も記述されている。
公開第0184162号は、サイクロスポリンより10
0倍有効と言われる新規なマクロライド免疫抑制剤FK
−506を記述しており、前記文献は参考例としてこ
こに組み入れる。このマイクロライドはス1〜レブトマ
イセス・ツクバエンシス(Strept;omyces
tsukubaensj、s)の特別な株の発酵により
生産される。又ニス・バイグロスコピカス・サブスプ°
ヤクシマエンシス(S、 hygroscopjcus
subsp、 yakushimaensis)により
生産される極めて近縁のマクロライド免疫抑制剤FK5
20も記述されている。
ティー・アライ(T、Arai)に対する米国特許第3
,244,592号は、抗カビ性物質「アスコマイシン
(ascomycin)J を生産するストリプ1−マ
イセス・ハイクロスコピカス・バール・アスコマイセテ
ィカス(Streptomyceshygroscop
icus var、 ascomyceticus)の
培養を記述している。
,244,592号は、抗カビ性物質「アスコマイシン
(ascomycin)J を生産するストリプ1−マ
イセス・ハイクロスコピカス・バール・アスコマイセテ
ィカス(Streptomyceshygroscop
icus var、 ascomyceticus)の
培養を記述している。
しかしながら、これらの文献には実質的にL−679,
934の免疫抑制剤効果を逆転し、そのままでサイクロ
スポリンのような他の化学物質群と対抗するFK−50
6マクロライ3 トキシ基から2つのメチル基を除くための充分な時間行
うことにより得ることができることを見出した。L−6
86,292は、L683.590のC−工3、C−1
5及びC31のトリステメチル化類似体であるL687
.795 に伴って発酵液中に形成される少量発酵生
産物であり、このことは同一譲受人を有する1989年
5月5日に出願し出願継続中の米国特許第34.8 、
24.3号(Case 17911)に開示されており
、前記文献は参考例としてここに組み入れる。発酵液中
の主要成分は、同一の発明者と譲受人を有する1989
年1月13日に出願した米国特許願第297,630号
(Case 17832)に記述されているL−683
,590のC−13とC−31がビスデメチル化された
環再編戊誘導体であるL−683,756、及び同一の
譲受人を有する1988年6月29日に出願した米国特
許願第213,025号(Casel、 7767 )
に記述されているL− ド型活性の決定に要する有用性を持つ如何なるL−67
9,934拮抗物質の生産についても記述されていない
。
934の免疫抑制剤効果を逆転し、そのままでサイクロ
スポリンのような他の化学物質群と対抗するFK−50
6マクロライ3 トキシ基から2つのメチル基を除くための充分な時間行
うことにより得ることができることを見出した。L−6
86,292は、L683.590のC−工3、C−1
5及びC31のトリステメチル化類似体であるL687
.795 に伴って発酵液中に形成される少量発酵生
産物であり、このことは同一譲受人を有する1989年
5月5日に出願し出願継続中の米国特許第34.8 、
24.3号(Case 17911)に開示されており
、前記文献は参考例としてここに組み入れる。発酵液中
の主要成分は、同一の発明者と譲受人を有する1989
年1月13日に出願した米国特許願第297,630号
(Case 17832)に記述されているL−683
,590のC−13とC−31がビスデメチル化された
環再編戊誘導体であるL−683,756、及び同一の
譲受人を有する1988年6月29日に出願した米国特
許願第213,025号(Casel、 7767 )
に記述されているL− ド型活性の決定に要する有用性を持つ如何なるL−67
9,934拮抗物質の生産についても記述されていない
。
第上図は400MHzで測定したCDCQ3中T−68
9,292の″H核磁気共鳴(NMR)スペクトルであ
り、またL−686,292の分子構造を示している。
9,292の″H核磁気共鳴(NMR)スペクトルであ
り、またL−686,292の分子構造を示している。
第2図は400MHzで測定したCDCQ3中L−68
3,590(イムノマイシン(jmmunomycin
) )の1H核磁気共鳴スペクトルである。
3,590(イムノマイシン(jmmunomycin
) )の1H核磁気共鳴スペクトルである。
新規なL−679,934拮抗物質であるL686.2
92 は、微生物アクチノプラナセート・エスピー(M
A 6559)、ATCCNo、53771を、窒素
栄養原を含む水性炭水化物培地中で深部好気的条件下で
、マクロライド免疫抑制剤L−683,590の存在下
で発酵させ、前記発酵は約7のpHでL683.590
のC−15とC−3]−を選択的にビスデメチル化、す
なわち2つの異なるメ4 683.590 のモノデメチル化類似体であるL−6
83,742を含み、両文献はこの特別の目的のため参
考例としてここに組み入れる。
92 は、微生物アクチノプラナセート・エスピー(M
A 6559)、ATCCNo、53771を、窒素
栄養原を含む水性炭水化物培地中で深部好気的条件下で
、マクロライド免疫抑制剤L−683,590の存在下
で発酵させ、前記発酵は約7のpHでL683.590
のC−15とC−3]−を選択的にビスデメチル化、す
なわち2つの異なるメ4 683.590 のモノデメチル化類似体であるL−6
83,742を含み、両文献はこの特別の目的のため参
考例としてここに組み入れる。
生成するL−686,292はL −679、934拮
抗物質活性、すなわちカルシウムイオノホア(イオノマ
イシン(ionomycin))とホルボールミリステ
ー1−アセテート(PMA)で誘導されるT細胞増殖試
験により証明される、L−679,934により引き起
こされるT細胞活性化の阻害の逆転を示し、前記試験は
ここでは「T細胞増殖試験」と呼称する。この試験法の
原理は、イオノマイシンとPMAの組み合わせにより刺
激されるマウス下リンパ球の増殖を測定することである
。L679.934 はこの試験でT細胞増殖を明害
し、これはトリチウム化チミジン取り込みの減少によっ
て示される。このT細胞増殖の阻害は、L−679,9
34による阻害を仲介する細胞質ゾル結合タンパク質又
は分子と結6− 合する化合物、例えばL−686,292により逆転さ
せることができる。この場合桔抗物質T、、−686,
292による標的分子への競合的結合は、T細胞増殖の
阻害を仲介しない。この新しく発見されたタンパク質は
、1989年1月上り日に出願した米国特許願第300
,659号(Case 17866)に開示されており
、この特別な目的のため参考例としてここに組み入れる
。
抗物質活性、すなわちカルシウムイオノホア(イオノマ
イシン(ionomycin))とホルボールミリステ
ー1−アセテート(PMA)で誘導されるT細胞増殖試
験により証明される、L−679,934により引き起
こされるT細胞活性化の阻害の逆転を示し、前記試験は
ここでは「T細胞増殖試験」と呼称する。この試験法の
原理は、イオノマイシンとPMAの組み合わせにより刺
激されるマウス下リンパ球の増殖を測定することである
。L679.934 はこの試験でT細胞増殖を明害
し、これはトリチウム化チミジン取り込みの減少によっ
て示される。このT細胞増殖の阻害は、L−679,9
34による阻害を仲介する細胞質ゾル結合タンパク質又
は分子と結6− 合する化合物、例えばL−686,292により逆転さ
せることができる。この場合桔抗物質T、、−686,
292による標的分子への競合的結合は、T細胞増殖の
阻害を仲介しない。この新しく発見されたタンパク質は
、1989年1月上り日に出願した米国特許願第300
,659号(Case 17866)に開示されており
、この特別な目的のため参考例としてここに組み入れる
。
本発明により、アクチノブラナセート・エスピーの株を
、窒素栄養原を含む水性炭水化物培地中で深部好気的条
件下で、L683.590と共に培養することにより生
産されるI、−686,292と称するL679.93
/4拮抗物質が提供される。
、窒素栄養原を含む水性炭水化物培地中で深部好気的条
件下で、L683.590と共に培養することにより生
産されるI、−686,292と称するL679.93
/4拮抗物質が提供される。
新規な拮抗物質L−686,292はT細胞増殖試験に
より測定されるL−679,934が仲介するT細胞活
性化の阻害の逆転を示し、第1図に示すプロ1−ン核磁
気共鳴スペク1ヘルを示し、また電子衝撃質量スペクト
ル分析にス(A ctj、nomycetal、es)
目とアクチノフ0ラナセア(Actjnoplanac
ea)科に組み入れられた。
より測定されるL−679,934が仲介するT細胞活
性化の阻害の逆転を示し、第1図に示すプロ1−ン核磁
気共鳴スペク1ヘルを示し、また電子衝撃質量スペクト
ル分析にス(A ctj、nomycetal、es)
目とアクチノフ0ラナセア(Actjnoplanac
ea)科に組み入れられた。
更にこの微生物の属と種を最終的に決定するため分類学
的特徴が試験されている。
的特徴が試験されている。
この培養はトリプチケース・ソイ(trypticas
e 5oy)寒天(28°及び37℃)、酵母麦芽エキ
ス寒天、グリセリンアスパラギン寒天、無機塩スターチ
寒天、オー1〜ミール寒天、ツアペック・ドックス(C
zapek Dox) 、ツァペツク溶液寒天及びパブ
1寒天様天、並びにベネッI〜(Bennett)寒天
を含む通常培地で、すべて28℃でよく発育する。
e 5oy)寒天(28°及び37℃)、酵母麦芽エキ
ス寒天、グリセリンアスパラギン寒天、無機塩スターチ
寒天、オー1〜ミール寒天、ツアペック・ドックス(C
zapek Dox) 、ツァペツク溶液寒天及びパブ
1寒天様天、並びにベネッI〜(Bennett)寒天
を含む通常培地で、すべて28℃でよく発育する。
土星生
この培養は直径0.2〜0.4ミクロンの分岐した糸状
菌糸として発育する。コロニーは不透明で盛り上がり、
縁番工浸食されている。
菌糸として発育する。コロニーは不透明で盛り上がり、
縁番工浸食されている。
コロニーの組織は酵母麦芽エキス寒天ではゴム状である
が、他の培地ではバター状となる傾向があり、この場合
著しい菌糸の分断が認められる。コロニーの表面は粉状
の外観とな9 より求められる763の分子量を持つ。
が、他の培地ではバター状となる傾向があり、この場合
著しい菌糸の分断が認められる。コロニーの表面は粉状
の外観とな9 より求められる763の分子量を持つ。
本発明はL−683,590と共にアクチノプラナセー
ト・エスピーMA 6559を発酵させてL−686
,292を生産することを含む。この微生物は現在メリ
ーラント(阿aryland) 、ロックビル(Roc
kville)、バークローン・ドライブ(Parkl
atin Drj、ve)12301に存在するアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(A m e
rican TypeCulture Co11ect
ion)にATCCNo。
ト・エスピーMA 6559を発酵させてL−686
,292を生産することを含む。この微生物は現在メリ
ーラント(阿aryland) 、ロックビル(Roc
kville)、バークローン・ドライブ(Parkl
atin Drj、ve)12301に存在するアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション(A m e
rican TypeCulture Co11ect
ion)にATCCNo。
53771として、及びニュー・シャーシー (New
Jersey)、ローウェイ (Rahway)に存
在するメルク・カルチャー・コレクション(Merck
Cu1ture Co11ection)にMA−6
559として制限した寄託がなされている。物理的性質
並びに生態学的、培養、生物学的及び生理学的性質を含
む分類学を以下に簡単に記述する。
Jersey)、ローウェイ (Rahway)に存
在するメルク・カルチャー・コレクション(Merck
Cu1ture Co11ection)にMA−6
559として制限した寄託がなされている。物理的性質
並びに生態学的、培養、生物学的及び生理学的性質を含
む分類学を以下に簡単に記述する。
これまでなされた分類学的分析に基づいて、この培養は
暫定的にアクチノミセターレる傾向がある。浸透性色素
は観察されなかった。
暫定的にアクチノミセターレる傾向がある。浸透性色素
は観察されなかった。
胞子嚢
大部分は球状であり、大きさは直径4〜25ミクロンの
範囲にある。胞子嚢は一般に21日目上認められ、グリ
セリンアスパラギン寒天上では合体する傾向がある。胞
子は鈍端で棒状(0,76X 1.90ミクロン)、非
運動性であり、長さが150ミクロンに及ぶ長く分岐し
ない鎖として存在する。
範囲にある。胞子嚢は一般に21日目上認められ、グリ
セリンアスパラギン寒天上では合体する傾向がある。胞
子は鈍端で棒状(0,76X 1.90ミクロン)、非
運動性であり、長さが150ミクロンに及ぶ長く分岐し
ない鎖として存在する。
MA 6559の培養的特徴
酵母エキス−麦芽エキス寒天(IS P Medium
2 )栄養菌糸はガラス状ないし黄色であり、気菌糸は
24〜72時間に形成され、淡黄色ないし淡紅色で粉状
の外観を呈する。裏面は黄褐色ないし赤褐色である。
2 )栄養菌糸はガラス状ないし黄色であり、気菌糸は
24〜72時間に形成され、淡黄色ないし淡紅色で粉状
の外観を呈する。裏面は黄褐色ないし赤褐色である。
オートミール寒天(I S P Medium 3)気
菌糸はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状ない
し黄褐色である。気中発育は白色ないし淡紅ベージュ色
で粉状の外観を呈0 する。
菌糸はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状ない
し黄褐色である。気中発育は白色ないし淡紅ベージュ色
で粉状の外観を呈0 する。
無機塩−スターチ寒天(I SP Medium 4)
軽度の発育で気菌糸は乏しい。栄養発育はガラス状で高
度に分断している。コロニーの周囲に澱粉の液化が7日
日に認められる。
軽度の発育で気菌糸は乏しい。栄養発育はガラス状で高
度に分断している。コロニーの周囲に澱粉の液化が7日
日に認められる。
グリセリンアスパラギン寒天(IS P Medium
5) 栄養発育はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状
ないし肉桂色である。気菌糸は粉状で白色ないし淡紅色
である。
5) 栄養発育はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状
ないし肉桂色である。気菌糸は粉状で白色ないし淡紅色
である。
ペプチド−鉄−酵母エキス寒天(IS P Mediu
m6) 栄養発育は黄褐色である。気中発育は認められず、メラ
ニン様色素は生産されない。
m6) 栄養発育は黄褐色である。気中発育は認められず、メラ
ニン様色素は生産されない。
チロシン寒天(I SP Medium 7)栄養発育
は黄褐色で培養日数と共に濃紫色となる。気菌糸はビロ
ード状ないし灰色がかった紅ベージュ色である。
は黄褐色で培養日数と共に濃紫色となる。気菌糸はビロ
ード状ないし灰色がかった紅ベージュ色である。
ツアペック・ドノクス寒天
栄養発育は黄褐色で培養日数と共にピンク11
択することにより維持することができる。
栄養培地中の好ましい炭素原は、グルコース、キシロー
ス、ガラクトース、グリセリン、スターチ、デキストリ
ンなどのような炭水化物である。マルI・−ス、ラムノ
ース、ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリ
シン、コハク酸ナトリウムなどのような他の材料も含め
ることができる。
ス、ガラクトース、グリセリン、スターチ、デキストリ
ンなどのような炭水化物である。マルI・−ス、ラムノ
ース、ラフィノース、アラビノース、マンノース、サリ
シン、コハク酸ナトリウムなどのような他の材料も含め
ることができる。
好ましい窒素原は酵母エキス、肉エキス、ペプI−ン、
グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール、及び他の植
物性ミール(部分又は完全脱脂)、カゼイン加水分解物
、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーンステイー
プリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザ−ミール、落花
生粉、ディスティラースソリューブルスなど、並びにア
ンモニウム塩(例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムなど)、尿素、アミノ酸など
のような無機及び有機窒素化合物である。
グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール、及び他の植
物性ミール(部分又は完全脱脂)、カゼイン加水分解物
、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーンステイー
プリカー、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザ−ミール、落花
生粉、ディスティラースソリューブルスなど、並びにア
ンモニウム塩(例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、リン酸アンモニウムなど)、尿素、アミノ酸など
のような無機及び有機窒素化合物である。
炭素原と窒素原は組み合わせて好便に使用3−
色を帯びる。気菌糸は短くマット状で湿った外観を呈す
る。
る。
本発明の方法は任意のアクチノブラナセート・エスピー
のrL−686,292生産性j株を使用して実行する
ことができ、特にATCCNo、53771株が好まし
い。
のrL−686,292生産性j株を使用して実行する
ことができ、特にATCCNo、53771株が好まし
い。
一般に、L−686,292は、上述の「L−686,
292生産株」を同化性炭素原及び窒素原を含む水性培
地中でL−683,590の存在下で、好ましくは深部
好気的条件(例えば振盪培養、深部培養等)下で培養(
発酵)することにより生産することができる。水性培地
は発酵過程の開始期と終期(収穫)に約7のp Hに維
持するのが好ましい。より高いpHは実質的及び/又は
完全な生産物の喪失につながる。望ましいpHはモルホ
リノエタンスルホン酸(MES)、モルホリノプロパン
スルホン酸(MOP S )などのような緩衝剤を使用
するか、又は以下に記述する生産培地のような本来緩衝
能を持つ栄養原材料を選2− されるが、それらは純粋な形態で使用する必要はなく、
というのは痕跡量の成長因子及び相当量の鉱物質栄養原
を含むより純度の低い材料も使用に適しているからであ
る。所望の場合、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン
酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウ
ム、ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、
銅塩、コバルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加す
ることができる。必要により、特に培養培地が著しく泡
立つ場合、流動性パラフィン、動物油、植物油、鉱物油
又はシリコンのような消泡剤を添加することができる。
292生産株」を同化性炭素原及び窒素原を含む水性培
地中でL−683,590の存在下で、好ましくは深部
好気的条件(例えば振盪培養、深部培養等)下で培養(
発酵)することにより生産することができる。水性培地
は発酵過程の開始期と終期(収穫)に約7のp Hに維
持するのが好ましい。より高いpHは実質的及び/又は
完全な生産物の喪失につながる。望ましいpHはモルホ
リノエタンスルホン酸(MES)、モルホリノプロパン
スルホン酸(MOP S )などのような緩衝剤を使用
するか、又は以下に記述する生産培地のような本来緩衝
能を持つ栄養原材料を選2− されるが、それらは純粋な形態で使用する必要はなく、
というのは痕跡量の成長因子及び相当量の鉱物質栄養原
を含むより純度の低い材料も使用に適しているからであ
る。所望の場合、炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン
酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウ
ム、ヨウ化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、
銅塩、コバルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加す
ることができる。必要により、特に培養培地が著しく泡
立つ場合、流動性パラフィン、動物油、植物油、鉱物油
又はシリコンのような消泡剤を添加することができる。
L−683,590出発物質は、米国特許第3.244
,592号に記載されているようにニス・バイグロスコ
ピカス・バール・アスコマイセティカス、ATCCNo
、1.4891の発酵により、及びフジサワに対する欧
州特許出願公開第O工841.62号に記述されている
ように、ニス・バイグロスコピカス4 ・サブスブ・ヤクシマエンシスNo、 7278の発酵
(L−683,590と同一のFR−90052Q又は
rFK−520J生産のため)により得ることができ、
前記参考例はこの特別な目的のため参考例としてここに
組み入れる。
,592号に記載されているようにニス・バイグロスコ
ピカス・バール・アスコマイセティカス、ATCCNo
、1.4891の発酵により、及びフジサワに対する欧
州特許出願公開第O工841.62号に記述されている
ように、ニス・バイグロスコピカス4 ・サブスブ・ヤクシマエンシスNo、 7278の発酵
(L−683,590と同一のFR−90052Q又は
rFK−520J生産のため)により得ることができ、
前記参考例はこの特別な目的のため参考例としてここに
組み入れる。
T=−686,292の大量生産の条件としては深部好
気的培養条件が好ましい。少量の生産のためには、フラ
スコ又は瓶による振盪培養又は表面培養が使用される。
気的培養条件が好ましい。少量の生産のためには、フラ
スコ又は瓶による振盪培養又は表面培養が使用される。
更に大型槽で発育を実行する場合、L−686,292
の生産の過程におlづる発育の遅延を避けるため微生物
の栄養形態を生産槽への植苗に使用するのが好ましい。
の生産の過程におlづる発育の遅延を避けるため微生物
の栄養形態を生産槽への植苗に使用するのが好ましい。
従って、先ずr斜面Jに生産された微生物の胞子又は菌
糸を比較的少量の培養培地に植菌し、前記植苗済み培地
(これを「種菌培地」とも称する)を培養して微生物の
栄養種菌を作り、次いで培養済み栄養種菌を無菌的に大
型槽に移植するのが望ましい。種菌を作るための発酵培
地は、L12 この場合発酵培地のpHは収穫まで7.0に維持する。
糸を比較的少量の培養培地に植菌し、前記植苗済み培地
(これを「種菌培地」とも称する)を培養して微生物の
栄養種菌を作り、次いで培養済み栄養種菌を無菌的に大
型槽に移植するのが望ましい。種菌を作るための発酵培
地は、L12 この場合発酵培地のpHは収穫まで7.0に維持する。
好ましい発酵を実行するための培養/生産培地は次の培
地を含む。
地を含む。
種菌培地A g/L−デキストロ
ース エ、0デキストリン
10・0牛肉エキス
3.OArdamine pH5、O NZ Am1ncType E 5
、0MgSO4・7 H200,05 に2HPO40,37 pHを7.1に調節 CaCO30,5g/l添加 変換培地B g/lグルコース
10 t(ycase S F 2牛
肉エキス 1コーンスイープリ
カー 3p Hを7.0に調節 17 686.292 の生産に使用する培地と実質的に同一
か又は異なることができ、一般に植苗前培地は高圧加熱
して殺菌する。一般に培地のp Hは高圧加熱前、酸又
は塩基を、好ましくは緩衝溶液の形態で適当に添加する
ことにより約7.0 に調節する。
ース エ、0デキストリン
10・0牛肉エキス
3.OArdamine pH5、O NZ Am1ncType E 5
、0MgSO4・7 H200,05 に2HPO40,37 pHを7.1に調節 CaCO30,5g/l添加 変換培地B g/lグルコース
10 t(ycase S F 2牛
肉エキス 1コーンスイープリ
カー 3p Hを7.0に調節 17 686.292 の生産に使用する培地と実質的に同一
か又は異なることができ、一般に植苗前培地は高圧加熱
して殺菌する。一般に培地のp Hは高圧加熱前、酸又
は塩基を、好ましくは緩衝溶液の形態で適当に添加する
ことにより約7.0 に調節する。
培養混合物の撹拌と通気は種々な方法で実現することが
できる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌装置によ
り、発酵槽を回転又は振盪することにより、種々なポン
プ装置により、又は気菌空気を培地に通気することによ
りなされる。通気は力り菌空気を発酵混合物に通過させ
ることにより実行することができる。
できる。撹拌はプロペラ又は類似の機械的撹拌装置によ
り、発酵槽を回転又は振盪することにより、種々なポン
プ装置により、又は気菌空気を培地に通気することによ
りなされる。通気は力り菌空気を発酵混合物に通過させ
ることにより実行することができる。
発酵は通常約20℃と40’Cの間好ましくは25〜3
5°Cの温度で約10時間〜24時間行うが、これら条
件は発酵の条件と規模により変動させることができる。
5°Cの温度で約10時間〜24時間行うが、これら条
件は発酵の条件と規模により変動させることができる。
好ましくは、生産培養は22Orpmで作動する回転振
盪機上で27℃で約24時間インキュベートし、6− 生産されたL−686,292は、他の公知の生物学的
活性物質の回収に一般に使用される通常の方法により培
養培地から回収することができる。生成したL−686
,292物質は培養菌糸と炉液中に存在し、従って培養
液を濾過又は遠心分離して得られる菌糸とφ液から、減
圧下濃縮、凍結乾燥、メタノールなどのような通常の溶
液による抽出、p H調節、通常の樹脂(例えばアニオ
ン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など)に
よる処理、通常の吸着剤(例えば活性炭、ケイ酸、シリ
カゲル、セルロース、アルミナなど)による処理、結晶
化、再結晶化などの通常の方法により単離することがで
きる。好ましい方法は溶媒抽出、特にメタノールを使用
するそれである。
盪機上で27℃で約24時間インキュベートし、6− 生産されたL−686,292は、他の公知の生物学的
活性物質の回収に一般に使用される通常の方法により培
養培地から回収することができる。生成したL−686
,292物質は培養菌糸と炉液中に存在し、従って培養
液を濾過又は遠心分離して得られる菌糸とφ液から、減
圧下濃縮、凍結乾燥、メタノールなどのような通常の溶
液による抽出、p H調節、通常の樹脂(例えばアニオ
ン又はカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など)に
よる処理、通常の吸着剤(例えば活性炭、ケイ酸、シリ
カゲル、セルロース、アルミナなど)による処理、結晶
化、再結晶化などの通常の方法により単離することがで
きる。好ましい方法は溶媒抽出、特にメタノールを使用
するそれである。
発酵から得られる生産物L−686,292は「T細胞
増殖試験jでL−679,934拮抗物質活性を示し、
これに基づく用途を持ち、次の 18 ]−1白色無定形粉末、 2.メタノールに溶解、 3、電子衝撃質量スペクトル分析で求めると763の分
子量を持ち、第1図の選 定した分子構造と一致する 物理的性質を示す。
増殖試験jでL−679,934拮抗物質活性を示し、
これに基づく用途を持ち、次の 18 ]−1白色無定形粉末、 2.メタノールに溶解、 3、電子衝撃質量スペクトル分析で求めると763の分
子量を持ち、第1図の選 定した分子構造と一致する 物理的性質を示す。
上述の発酵方法により得られる工、−
686,292は、通常の方法、例えば抽出、沈殿、分
画結晶化、再結晶化、クロマ1〜グラフイーなどにより
単離し精製することができる。
画結晶化、再結晶化、クロマ1〜グラフイーなどにより
単離し精製することができる。
物質の適当な式は、酢酸エステルのような分子の水酸基
により形成されるL− 686,292の通常の医薬的に受容可能な生分解性エ
ステルも含むことができる。
により形成されるL− 686,292の通常の医薬的に受容可能な生分解性エ
ステルも含むことができる。
上述の発酵反応と生成する発酵混合物の後処理において
、L−686,292のへミケタール環系の再編成によ
るものを含むL686.292 の互変異性体及び配座
異性体(一つ又は複数)も本発明の範囲に含まれるこ=
19= 0.37、及びCaCO20,5(グラム/リッターの
単位で)からなる高圧加熱(殺菌)した種菌培地Aの5
0mQを含む250mQ邪魔板付き振盪フラスコに植菌
するのに用いた。種菌培地のp、 Hを高圧加熱前 7
.1−に調節した。種菌を種菌培地中で、220rpm
で作動する回転振盪機で27°C124時間インキュベ
ートした。得られる種菌培地の2.5mQを、下記の予
め高圧加熱(殺菌)した変換培地Bの50mQを含む2
50mQ、の邪魔板のない振盪フラスコに植菌するのに
使用した。L−683,590をジメチルスルホキシド
溶液として0.1mg/mΩの最終濃度となるように添
加した。次いで振盪フラスコの内容を220rpmで作
動する振盪培養機で27℃で24時間インキュベートし
た。
、L−686,292のへミケタール環系の再編成によ
るものを含むL686.292 の互変異性体及び配座
異性体(一つ又は複数)も本発明の範囲に含まれるこ=
19= 0.37、及びCaCO20,5(グラム/リッターの
単位で)からなる高圧加熱(殺菌)した種菌培地Aの5
0mQを含む250mQ邪魔板付き振盪フラスコに植菌
するのに用いた。種菌培地のp、 Hを高圧加熱前 7
.1−に調節した。種菌を種菌培地中で、220rpm
で作動する回転振盪機で27°C124時間インキュベ
ートした。得られる種菌培地の2.5mQを、下記の予
め高圧加熱(殺菌)した変換培地Bの50mQを含む2
50mQ、の邪魔板のない振盪フラスコに植菌するのに
使用した。L−683,590をジメチルスルホキシド
溶液として0.1mg/mΩの最終濃度となるように添
加した。次いで振盪フラスコの内容を220rpmで作
動する振盪培養機で27℃で24時間インキュベートし
た。
]−0変換培地Bはグルコース10.0、Hycase
S F 2 、 O1牛肉エキス1.0、コーンステ
イープリカー3.0(グラム/リッター)からなり、p
Hを高圧加熱前、7.01 とに注意すべきである。
S F 2 、 O1牛肉エキス1.0、コーンステ
イープリカー3.0(グラム/リッター)からなり、p
Hを高圧加熱前、7.01 とに注意すべきである。
本発明のL−686,292はL
679.934 拮抗物質活性を持ち、天然生成物発酵
液中のFK−506マクロライド型免疫抑制剤の存在を
サイクロスポリンのような他の化学物質群から区別して
決定するための手段として診断学的に有用である。この
原理に基づく診断用装置は当業者にとって明白なことで
ある。
液中のFK−506マクロライド型免疫抑制剤の存在を
サイクロスポリンのような他の化学物質群から区別して
決定するための手段として診断学的に有用である。この
原理に基づく診断用装置は当業者にとって明白なことで
ある。
次の実施例は本発明を例証する目的で示すものであり、
本発明の範囲又は思想を限定するものと解釈すべきでは
ない。
本発明の範囲又は思想を限定するものと解釈すべきでは
ない。
寒塵−例□】−
微生物及び培養条件
(MA 6559)ATCCNo、53771の凍結栄
養菌糸を融解し、デキストリン10.0、デキストロー
ス1.0、牛肉エキス3.0、ardamjne P
H(Yeast Products。
養菌糸を融解し、デキストリン10.0、デキストロー
ス1.0、牛肉エキス3.0、ardamjne P
H(Yeast Products。
Inc、) 5.Q、N −Z Am1ne type
E 5.0、Mg5O,・7H200,05、KH2
PO40 に調節した。
E 5.0、Mg5O,・7H200,05、KH2
PO40 に調節した。
培 液からの単 及び精製 法
変換培地Bの全発酵液(500mR)を塩化メチレン(
3X500mQ、)で抽出した。
3X500mQ、)で抽出した。
塩化メチレン抽出液を合わせて、硫酸ナトリウム」二で
乾燥し、真空下で濃縮して油状残留物を得た。残留物を
アセトニトリルに溶解し、高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)による精製を行った。
乾燥し、真空下で濃縮して油状残留物を得た。残留物を
アセトニトリルに溶解し、高速液体クロマトグラフィー
(HPLC)による精製を行った。
HPLCはWatman Partj、sil 1.
OOD S−3を使用する9、4mmX25cmのカ
ラムで実行し、60℃で205nmと225nmで監視
した。カラムは0.1%H,P O,水溶液CH3CN
(55: 45)から0.1%H,P O4水溶液−C
H3CN (20:80) に至るリニアグラジェント
で60分間、3m1l!/分の流速で展開した。化合物
を上述の抽出液の注入を反復する間に集めた。リテンシ
ョンタイム25分の画分を合わせ、PH6,5に調節し
、蒸発してアセトニトリルを除いた。化合物を2 CXll5 e p −P a k (Waters
As5ociates)及びアセトニトリル−水の溶
離溶媒を使用して更に精製し、L−686,292と称
する生成物の1− 、2 m gを得た。
OOD S−3を使用する9、4mmX25cmのカ
ラムで実行し、60℃で205nmと225nmで監視
した。カラムは0.1%H,P O,水溶液CH3CN
(55: 45)から0.1%H,P O4水溶液−C
H3CN (20:80) に至るリニアグラジェント
で60分間、3m1l!/分の流速で展開した。化合物
を上述の抽出液の注入を反復する間に集めた。リテンシ
ョンタイム25分の画分を合わせ、PH6,5に調節し
、蒸発してアセトニトリルを除いた。化合物を2 CXll5 e p −P a k (Waters
As5ociates)及びアセトニトリル−水の溶
離溶媒を使用して更に精製し、L−686,292と称
する生成物の1− 、2 m gを得た。
翌−塁
L−686,292はNMRスペクトル分析により、選
定した分子構造を確認する第上図のプロトンNMRスペ
クトルが得られたことにより確認された。
定した分子構造を確認する第上図のプロトンNMRスペ
クトルが得られたことにより確認された。
失遍虹巳え
T細胞増殖試験
1、 試料の笠髪
上述のHPLCで調製した精製したL−686,292
を無水エタノールに1mg/mΩの濃度に溶解した。
を無水エタノールに1mg/mΩの濃度に溶解した。
2、 基腹遣
C57B i / 6マウスの肺臓を無菌的に取り出し
、10%熱不活性化ウシつ児血清(GIBC○)を添加
した氷冷RPM11640培養培地(GIB CO、G
rand l5land、 N、 Y、)23− 精製したTリンパ球を、10%熱不活性化ウシつ児血清
、]000mMグルタミン1mMピルビン酸ナトリウム
、2X10−5M2−メルカプトエタノール及び50μ
g/mQゲンタマイシンを添加したRPMI 164
0培地からなる完全培養培地に2.5 X 105細胞
/mQとなるように再懸濁した。イオノマイシン250
ng/mQ及びP MA 10 ng/mffを添加し
た。この細胞@濁液を直ちに96槽平底ミクロ培養IM
(Costar)に200ILfl/槽分注した。イオ
ノマイシンとPMAを含む培養を1. n g / m
Q L−679、934(FK−506)を添加及
び無添加で、並びに試料(上述の生成したL−686,
292)の種々な下記稀釈液と共にインキュベー1−シ
た。L−686,292を2槽に20μQ/槽添加した
。次いで培養盤を5%C○2−95%空気の加湿した気
中で37℃、44時間インキュベー1〜した。Tリンパ
球の増殖を、1〜リチウム化チミジンの取り込みの測定
により評5 中で穏やかに分散させた。細胞を150Orpmで8分
間遠心分離してペレット化した。混入する赤血球細胞を
、ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝液(GIBC○
)で4℃、2分間処理して除いた。冷培地を添加し、細
胞を再び1.500 r p mで8分間遠心分離した
。次いで細胞懸濁液を次のようにナイロン毛カラム上で
分離することによりTリンパ球を分離した。すなわち、
洗浄し乾燥したナイロン毛の約4gを20 m Qのプ
ラスチック製注射筒に充填してナイロン毛カラムを調製
した。カラムを121”C(250’F )で30分間
高圧加熱して殺菌した。ナイロン毛カラムを温(37℃
)培養培地で湿らせ、同一培地で洗浄した。洗浄した肺
臓細胞を温培地に再懸濁し、これをゆっくりナイロン毛
にかけた。次いでカラムを直立の位置で37℃、工時間
インキュベートした。付着しないTリンパ球を温培養培
地と共にカラムから溶離し、細胞懸濁液を上のように遠
心分離した。
、10%熱不活性化ウシつ児血清(GIBC○)を添加
した氷冷RPM11640培養培地(GIB CO、G
rand l5land、 N、 Y、)23− 精製したTリンパ球を、10%熱不活性化ウシつ児血清
、]000mMグルタミン1mMピルビン酸ナトリウム
、2X10−5M2−メルカプトエタノール及び50μ
g/mQゲンタマイシンを添加したRPMI 164
0培地からなる完全培養培地に2.5 X 105細胞
/mQとなるように再懸濁した。イオノマイシン250
ng/mQ及びP MA 10 ng/mffを添加し
た。この細胞@濁液を直ちに96槽平底ミクロ培養IM
(Costar)に200ILfl/槽分注した。イオ
ノマイシンとPMAを含む培養を1. n g / m
Q L−679、934(FK−506)を添加及
び無添加で、並びに試料(上述の生成したL−686,
292)の種々な下記稀釈液と共にインキュベー1−シ
た。L−686,292を2槽に20μQ/槽添加した
。次いで培養盤を5%C○2−95%空気の加湿した気
中で37℃、44時間インキュベー1〜した。Tリンパ
球の増殖を、1〜リチウム化チミジンの取り込みの測定
により評5 中で穏やかに分散させた。細胞を150Orpmで8分
間遠心分離してペレット化した。混入する赤血球細胞を
、ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝液(GIBC○
)で4℃、2分間処理して除いた。冷培地を添加し、細
胞を再び1.500 r p mで8分間遠心分離した
。次いで細胞懸濁液を次のようにナイロン毛カラム上で
分離することによりTリンパ球を分離した。すなわち、
洗浄し乾燥したナイロン毛の約4gを20 m Qのプ
ラスチック製注射筒に充填してナイロン毛カラムを調製
した。カラムを121”C(250’F )で30分間
高圧加熱して殺菌した。ナイロン毛カラムを温(37℃
)培養培地で湿らせ、同一培地で洗浄した。洗浄した肺
臓細胞を温培地に再懸濁し、これをゆっくりナイロン毛
にかけた。次いでカラムを直立の位置で37℃、工時間
インキュベートした。付着しないTリンパ球を温培養培
地と共にカラムから溶離し、細胞懸濁液を上のように遠
心分離した。
4−
価した。44時間培養後、細胞を2μCi/槽のトリチ
ウム化チミジン(N E N 、Cambridge。
ウム化チミジン(N E N 、Cambridge。
MA)により放射能付標した。更に4時間インキュベー
ション後、培養を多重試料収穫器を用いてガラス繊維フ
ィルター上に収穫した。個々の槽に相当するフィルター
ディスクの放射能を、標準の液体シンチレーション計数
法(Betacounter)により測定した。繰り返
しの槽の上分間当たりの平均計数を算出し、結果を次の
ようにトリチウム化チミジン取り込み(増殖)の阻害%
として表した。
ション後、培養を多重試料収穫器を用いてガラス繊維フ
ィルター上に収穫した。個々の槽に相当するフィルター
ディスクの放射能を、標準の液体シンチレーション計数
法(Betacounter)により測定した。繰り返
しの槽の上分間当たりの平均計数を算出し、結果を次の
ようにトリチウム化チミジン取り込み(増殖)の阻害%
として表した。
lng/mfl L−679,934の存在及び不存
在下におけるL−686,292の種々な濃度における
阻害%の結果を次の表に示す。
在下におけるL−686,292の種々な濃度における
阻害%の結果を次の表に示す。
6
1」
0099
31、 0 9
963 0 9
9125 0
96250 0
65500 0
31000 0
0註1.マウスT細胞培養は収穫前48時間
に3H/チミジンで4時間付標した。
963 0 9
9125 0
96250 0
65500 0
31000 0
0註1.マウスT細胞培養は収穫前48時間
に3H/チミジンで4時間付標した。
2、標準L−679,934(log/mQ)は99%
阻害を示した。L−679,934の仲介する阻害のI
C,、oは0.32ng/m党(0,4HM)であった
。
阻害を示した。L−679,934の仲介する阻害のI
C,、oは0.32ng/m党(0,4HM)であった
。
3、L−686,292については逆転の7
註1.阻害剤とL−686,292は培養開始時添加し
た。培養は収穫前48時間に 3H−チミジンで4時間付標した。
た。培養は収穫前48時間に 3H−チミジンで4時間付標した。
上のデータよりL−686,292は、天然生成物培養
液中のFK−506マクロライト型免疫抑制剤の存在を
、サイクロスポリンのような他の化合物群から区別して
決定する手段として診断学的に使用することができる。
液中のFK−506マクロライト型免疫抑制剤の存在を
、サイクロスポリンのような他の化合物群から区別して
決定する手段として診断学的に使用することができる。
第1図は400MHzで測定したCDCα3中L−68
9,292の1H核磁気共鳴スペクトルであり、第2図
は400 M Hzで測定したCDCQ3中L−683
,590の1H核磁気共鳴スペクトルである。 9− IC,o=250ng/mQ=328nMであり、一般
に100〜400X10−9モルの範囲にあった。 4、L−679,934による増殖阻害は50単位/
m Qの組換えヒトIL−2の添加により逆転された。 里−星」 ま邊11綾朱 L−686,292(ng/mQ) 000 25 62.5 31.3 」む4通− L−679,934(Ing/mQ、)」W詑竺 97.1 4.7 65.7 93.4 000 95.6 28 手続補正書 (1)別紙の通り 明細書1通を提出致しまず。 平成2年8月17日 (2)別紙の通り、 正式図面1通を提1+4致しまず。
9,292の1H核磁気共鳴スペクトルであり、第2図
は400 M Hzで測定したCDCQ3中L−683
,590の1H核磁気共鳴スペクトルである。 9− IC,o=250ng/mQ=328nMであり、一般
に100〜400X10−9モルの範囲にあった。 4、L−679,934による増殖阻害は50単位/
m Qの組換えヒトIL−2の添加により逆転された。 里−星」 ま邊11綾朱 L−686,292(ng/mQ) 000 25 62.5 31.3 」む4通− L−679,934(Ing/mQ、)」W詑竺 97.1 4.7 65.7 93.4 000 95.6 28 手続補正書 (1)別紙の通り 明細書1通を提出致しまず。 平成2年8月17日 (2)別紙の通り、 正式図面1通を提1+4致しまず。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、T細胞増殖試験でL−679、934が仲介するT
細胞活性化の阻害の逆転と、第1図に示すプロトン核磁
気共鳴スペクトルと、電子衝撃質量スペクトル分析で7
63の分子量を示すL−686、292と称するL−6
79、934拮抗物質。 2、第1図に示す分子構造を有するL−679、934
拮抗物質であるL−686、292。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US36609689A | 1989-06-13 | 1989-06-13 | |
US366,096 | 1989-06-13 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0374388A true JPH0374388A (ja) | 1991-03-28 |
Family
ID=23441654
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP15288290A Pending JPH0374388A (ja) | 1989-06-13 | 1990-06-13 | 新規なl―683,590の微生物変換生成物 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0403242A1 (ja) |
JP (1) | JPH0374388A (ja) |
CA (1) | CA2018710A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008518984A (ja) * | 2004-11-03 | 2008-06-05 | アンティビオーティコス エッセ.ピ.ア. | タクロリムスの精製方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7238340B1 (en) | 1991-11-27 | 2007-07-03 | Cis Bio International | Monoamine, diamide, thiol-containing metal chelating agents |
CA2071066A1 (en) * | 1991-06-19 | 1992-12-20 | Ali Shafiee | Fk-900520 enzymatic and/or microbial methylation products |
US5674732A (en) * | 1992-04-27 | 1997-10-07 | Pfizer Inc. | Rapamycin producer |
JP2711198B2 (ja) * | 1992-04-27 | 1998-02-10 | ファイザー製薬株式会社 | 新規ラパマイシン生産菌 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4894366A (en) * | 1984-12-03 | 1990-01-16 | Fujisawa Pharmaceutical Company, Ltd. | Tricyclo compounds, a process for their production and a pharmaceutical composition containing the same |
AU630866B2 (en) * | 1987-12-09 | 1992-11-12 | Fisons Plc | Macrocyclic compounds |
-
1990
- 1990-06-11 CA CA 2018710 patent/CA2018710A1/en not_active Abandoned
- 1990-06-13 JP JP15288290A patent/JPH0374388A/ja active Pending
- 1990-06-13 EP EP90306427A patent/EP0403242A1/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008518984A (ja) * | 2004-11-03 | 2008-06-05 | アンティビオーティコス エッセ.ピ.ア. | タクロリムスの精製方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2018710A1 (en) | 1990-12-13 |
EP0403242A1 (en) | 1990-12-19 |
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