JPH03209384A - 新規な微生物変換生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は新規な免疫抑制剤Ｌ−６８３゜７５６及び微
生物アクチノブラナセート・エスピー（Ａｃｔｉｎｏｐ
ｌａｎａｃｅｔｅ　ｓｐ、　ｌ　　（Ｍ　Ａ　　６５５
９　）、ＡＴＣＣＮｏ、５３７７１を使用するその生産
のための発酵法に関する。この方法はＬ−６８３゜５９
０をビスデメチル化し、テトラヒドロビラン環のテトラ
ヒドロフラン構造への１再編成を起こす条件下で微生物
とＬ−６８３，５９０を培養することを含む、また、自
己免疫疾患、感染性疾患の治療および／または臓器移植
拒絶反応の予防のため人間に対する使用方法が開示され
ている。

１９８３年、米国ＦＤＡは臓器移植外科領域に革命を起
こした極めて有効な抗拒絶反応薬であるサイクロスポリ
ン（ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｌを認可した。この薬品は
体の免疫系がその移植の異タンパク質を拒絶する天然保
護剤の膨大な蓄積を動員するのを阻害することにより作
用する。

この薬品は移植拒絶反応との戦いに有効である一方、腎
不全、肝臓損害および潰瘍を起こす欠点があり、それら
は多くの場合極めて重篤になる可能性がある。

Ｆｕｊｉｓａｗａに対する欧州特許出願公開第（１１８
４１６２号は、参考例としてここに組み入れるものであ
るが、新規なマクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５０６を記
述しており、それはサイクロスポリンより１００倍有効
といわれている。このマクロライドはストレプトマイセ
ス・ツクバエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｔｓ
ｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）の特別な株の発酵により生産さ
れる。また、ニス・ハイグロスコピクス・サブスブ・ヤ
クシマエンシス （Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　５ｕｂｓｐ、ｙａ
ｋｕｓｉ＊ａｅｎｓｉｓｌにより生産される近縁のマク
ロライド免疫抑制剤ＦＫ５２０についでも記述している
。

Ｔ、Ａｒａｉに対する米国特許筒３．２４４．５９２号
は抗カビ剤［アスコマイシンｆａｓｃｏｍｙｃｉｎ）　
Ｊを生産するストレプトマイセス・ハイグロスコピクス
・バール・アス］？イセチクスｆｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　ｖａｒ、ａｓｃｏｍ
ｙｃｅｔｉｃｕｓｌの培養について記述している。

しかしながら、サイクロスポリンの副作用が実質的に無
いいかなる免疫抑制剤の生産についても文献の記述がな
い。

副作用の少ないより新しくより安全な薬品がこの分野に
おいてつねに探し求められている。

微生物アクチノブラナセート・エスピー（ＭＡ６５５９
）、ＡＴＣＣＮｏ、５３７７１をマクロライド免疫抑制
剤Ｌ−６８３，５９０の存在下。

窒素栄養源を含む水性炭水化物培地中液中好気的条件下
であって、前記条件はｐＨ約７でＬ　−６８３゜５９０
を選択的にビスデメチル化（すなわち２つの異なるメト
キシ基から２つのメチル基を除く）し、テトラヒドロビ
ラン環のテトラヒドロフラン構造への１再編成を遂行す
る（ここでヒドロキシル基はＣ−１４にある）のに十分
な時間培養することにより新規な免疫抑制剤Ｌ−６８３
，７５６を得ることができることを発見した０反応を実
行するために選ばれる反応時間は、１９８８年６月２９
日に出願し同一の譲渡人を持つ米国特許出願筒２１３．
０２５号（Ｃａｓｅ　ｌ　７７６７）に記述されている
Ｌ−６８３，５９０（イムノマイシン（ｉｒｘｍｕｎａ
ｍｙｃｉｎ）　）のモノー〇−３１デメチル体であるＬ
−６８３，７４２の場合より長い、この特別な目的のた
め前記文献は参考例としてここに組み入れる。

生成するＬ−６８３，７５６は免疫抑制活性すなわち力
Ｊレシウムイオノフォア（イオノマイシン（ｉｏｎｏ■
ｙｃｉｎｌ　）とフォルボールミリステートアセテート 験によって示されるようなＴ細胞活性化の陽性阻害ｆｐ
ｏｓｉｔｉｖｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｌ　を示し、前
記試験をここでは「Ｔ細胞増殖試験」と称する．この試
験法の原理はイオノマイシンとＰＭＡの組合せにより刺
激されるマウス下リンパ球の増殖を測定することである
．この試験で陽性の試料はＴ細胞の増殖を阻害し、これ
は減少したトリチウム化チミジンの取込みによって示さ
れる。

この発明により、アクチノブラナセート・エスピーの一
株をＬ−６８３，５９０と共に窒素栄養源を含む水性炭
水化物培地中で生成物Ｌ　−　６８３。

７５６を生産するに十分な時間液中好気的醗酵条件下で
培養することにより生産されるＬ　−　６８３。

７５６と称する免疫抑制剤が提供される。

新規な免疫抑制剤Ｌ−６８３，７５６はＴ細胞増殖試験
でＴ細胞活性化の陽性阻害と第１図に示すようなプロト
ン核磁気共鳴スペクトルとを示し、ＦＡＢ質量スペクト
ル分析により得られる７７０の擬分子イオンビーク（Ｍ
”＋Ｌｉ）’から求められる７６３の分子量を持つ６ また，医薬的に受容可能な実質的に無毒な担体または賦
形剤を配合したＬ−６８３，７５６の治療的有効量を含
む医薬組成物が提供される。

さらに、Ｌ−６８３，７５６の治療的有効量を人間に投
与することからなる移植拒絶反応を予防し、もしくは自
己免疫疾患または感染性疾患を治療するために人間を治
療するための使用方法が提供される。

本発明はＬ−６８３，５９０と共にアクチノブラナセー
ト・エスピーＭＡ　　６５５９を醗酵させてＬ−６８３
，７５６を生産することを含む．微生物は現在メリーラ
ンド（Ｍａｒｙｌａｎｄｌ、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅｌ　、バークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗ
ｎ　Ｄｒｉｖｅｌ　ｌ　２３０１に所在するアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションｆＡｎ＋ｅｒｉｃ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ
ｎ）にＡＴＣＣＮｏ。５３７７１として、およびニュー
・シャーシー（Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙｌ、ローウェー　
（Ｒａｈｗａｙｌに所在するメルク・カルチャー・コレ
クション（ＭｅｒｃｋＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ）にＭＡ６５５９として制限寄託されている。物
理学的性質および生態学的、培養的、生物学的および生
理学的性質を含む分類は以下に簡単に記述する。

これまでになされた分類学的分析に基づいて、この培養
は仮にアクチノミセターレス ［Ａｃｔｉｎｏｎ＋ｙｃｅｔａｌｅｓｌ　目とアクチノ
ブラナセアｆＡｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅａｌ科に分類
された。この微生物の属と種を最終的に決定するため、
さらに分類学的性質を研究した。

この培養はトリブチケース・ソイ・アガー（ｔｒｙｐｔ
ｉｃａｓｅ　ｓｏｙ　ａｇａｒ）　　（２８”と３７℃
）、酵母麦芽エキス寒天、グリセロールアスパラギン寒
天、無機塩澱粉寒天、オートミール寒天、ツアペック−
ドックス（Ｃｚａｐｅｋ　Ｄｏｘ）、ツアペック溶液寒
天およびペプトン寒天、ならびにベネットｆＢｅｎｎｅ
ｔｔｌ寒天を含む通常の培地上ですべて２８℃でよく発
育する。

この培養は分岐した糸状菌糸として発育し、菌糸の直径
は０．２〜０．４ミクロンである。コロニーは不透明で
もつあがり、侵食されている。コロニーの組織は酵母麦
芽エキス寒天ではゴム状であるが、他の培地ではバター
状になる傾向があり、この場合菌糸の著しい分断が認め
られる。コロニーの表面は外観が粉状になる傾向がある
。浸透性色素は認められなかった。

紅玉１ 大部分は球状で大きさは直径が４〜２５ミクロンの範囲
にある。胞子箱はグリセロールアスパラギン寒天上で一
般に２１日で観察され、合体する傾向がある。胞子は棒
状で鈍端を持ち（０，７６×１．９ミクロン）、非運動
性であり、長さ１５０ミクロンまでの長い分岐しない鎖
で存在する。

ＭＡ　　６５５９の　養 酵母エキス麦芽エキス寒天（ＩＳＰ　Ｍｅｄｉｕｍ　２
１栄養菌糸はガラス状ないし黄色であり、気菌糸は２４
〜７２時間に伸長し淡黄色ないし淡紅色で粉状の外観で
ある。裏面は黄褐色ないし赤褐色である。

オートミール東（ＩＳＰ　Ｍｅｄｉｕｓ　３１栄養菌糸
はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラス状ないし黄
褐色である。気菌糸は白色ないし淡い紅ベージュ色で粉
状の外観である。

”＃、ｆｌＡｋ！Ａ’　　　　１１．　　　（ＩＳＰ　
　Ｍｅｄｉｕ＋ｗ　　４）軽微な発育で気菌糸は乏しい
、栄養発育はガラス状で高度に分断している。コロニー
の周辺部に起こる澱粉の液化は７日目に認められる。

クリセロールアスパラギン寒　（ＩＳＰ　Ｍｅｄｉａ膳
５）栄養発育はガラス状ないし黄色であり、裏面はガラ
ス状ないし肉桂がかった褐色である。気菌糸は粉状で白
色ないし淡紅色である。

ペプチド　　ニエキス實　（ＩＳＰ　Ｍｅｄｉｕｍ　６
）栄養発育は黄褐色である。気中発育は認められず、メ
ラニン様色素は生産されない。

％Ｏ之之１仄（ｒｓＰ　Ｍｅｄｉｕａ＋　７）栄養発育
は黄褐色で培養日数と共に深紅色になる。気菌糸はビロ
ード状ないし灰色がかった紅ベージュ色である。

ツアペックドックス寒 栄養発育は黄褐色で培養日数と共にピンク色を帯びる。

気菌糸は短く、湿ったマット状の外観である。

本発明の方法は任意のアクチノブラナセート・エスピー
のｒＬ−６８３，７５６生産性」株を用いて実行するこ
とができるが、特にＡＴＣＣＮ。

５３７７１株が好ましい。

一般に、Ｌ−６８３，７５６は上述のｒＬ−６８３，７
５６生産性株」をＬ−６８３，５９０の存在下、同化性
炭素源および窒素源を含む水性栄養培地中で、好ましく
は液中好気的条件下（たとえば振盪培養、液中培養など
）で培養（Ｈ酵）することにより生産することができる
。水性培地は醗酵過程の始発間および終期においてｐＨ
を約７に維持するのが好ましい、より高いｐＨでは生成
物の実質的なおよび／または全部の喪失につながる。所
望のｐＨはモルフォリノエタンスルフォン酸（ＭＥＳ＞
、モル）オリノブロバンスルフオン酸（ＭＯＰＳ）など
のような緩衝剤の使用、または以下に記述する生産培地
のような本来緩衝能力を持つ栄養原材料の選択により維
持することができる。

栄養培地の好ましい炭素原はグルコース、キシロース、
ガラクトース、グリセリン、澱粉、デキストリンなどの
ような炭水化物である。マルトース、ラムノース、ラフ
ィノース、アラビノース、マンノース、サリシン、コハ
ク酸ナトリウムなどのような他の炭素原も含めることが
できる。

好ましい窒素源は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、グ
ルテンミール、綿実ミール、大豆ミールおよび他の植物
ミール（部分脱脂または全脱脂）、カゼイン加水分解物
、大豆加水分解物および酵母加水分解物、コーン　ステ
イープ・リカｆｃｏｒｎｓｔｅｅｐ　１ｉｑｕｏｒ）、
乾燥酵母、小麦胚芽、フェザ−・ミール（ｆｅａｔｈｅ
ｒ　ｍｅａｌ）、落花生粉末、デイスティラース・ソリ
ューブルスｆｄｉｓｔｉｌｌｅｒ　５ｓｏｌｕｂｌｅｓ
ｌ　など、並びにアンモニウム塩（例えば硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなど）、
尿素、アミノ酸などのような無機および有機窒素化合物
である。

炭素源と窒素源は、有利には組み合わせて使用されるが
それらの純粋な形態で使用する必要はない。これは、痕
跡量の成長因子および相当量の鉱物質栄養原を含むより
純粋でない材料も使用に適しているからである。所望な
ら炭酸ナトリウムまたはカルシウム、リン酸ナトリウム
またはカリウム、塩化ナトリウムまたはカリウム、ヨウ
化ナトリウムまたはカリウム、マグネシウム塩、銅塩。

コバルト塩などのような鉱物質塩を培地に添加すること
ができる。必要により、特に培養中培地が著しく泡立つ
場合、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱物油または
シリコンのような消泡剤を添加することができる。

Ｌ−６８３，５９０出発物質は米国特許筒３．２４４．
５９２号に記述されたようなニス・ハイグロスコピクス
・バール・アスコマイセテイクス、ＡＴＣＣＮｏ、１４
８９１の醗酵により、およびＦｕｊｉｓａｗａに対する
欧州特許出願公開第１８４１６２号に記述されたような
ニス・ハイグロスコピクス・ザブスブ・ヤクシマエンシ
スＮｏ、７２７８の醗酵（Ｌ−６８３，５９０と同一の
Ｆ　Ｒ−９００５２０または［ＦＫ−５２０１の生産の
ため）により入手することができ、前記文献はこの特別
な目的のため参考例としてここに組み入れる。

Ｌ−６８３，７５６を大量に生産する条件については液
中好気的培養条件が好ましい、少量の生産のためにはフ
ラスコまたは瓶による振盪または表面培養が使用される
。更に増殖を大型槽で実施する場合、Ｌ−６８３，７５
６の生産の過程における増殖のラグタイムを避けるため
微生物の栄養形態を生産槽への植菌に使用するのが好ま
しい。

従って、最初に［斜面１に作られた微生物の胞子または
菌糸を比較的少量の培地に植菌し、前記植菌した培地（
これを［種菌培地］と称することもある）を培養するこ
とにより微生物の栄養形態種菌を作り、次いで培養した
栄養形態種菌を無菌的に大型槽に移すのが望ましい１種
菌が作られる醗酵培地はＬ−６８３，７５６の生産に使
用される培地と実質的に同一かまたは相違し、一般に植
菌前培地を圧熱殺菌する。培地のｐＨは一般に圧熱殺菌
工程前、酸または塩基を好ましくは緩衝溶液の形態で適
当に添加することにより約７．０に調節する。培養混合
物の攪拌と通気は種々な方法で達成することができる。

撹拌はプロペラまたは類似の機械的撹拌設備により、醗
酵槽を回転または振盪することにより、種々なポンプ設
備により、または培地に無菌空気を通過させることによ
り実現することができる１通気は無菌空気を醗酵混合物
に通過させることにより実現することができる。

醗酵は通常的２０℃と４０℃の間の温度好ましくは２５
〜３５℃で約１０時間ないし２０時間の間行うが、醗酵
条件とスケールにより変更することができる。好ましく
は、生産培養は２２　Ｏｒｐｍで移動する回転振盪機上
２７℃で約２４時間定温保持し、この場合醗酵培地のｐ
Ｈは収穫期まで７．０に維持する。留意点二より短い期
間例えば１８時間の定温保持では大部分はＬ−６８３，
５９０のモノ−Ｃ−３１デメチル誘導体すなわちＬ−６
８３゜７４２が生産され、対照的により長い時間例えば
２４時間では主としてビスデメチル体Ｌ　−６８３７５
６が生産され、中間の時間の１８〜２４時間では２つの
混合物が生産され、この場合各々はかなりの量存在する
。

醗酵を実行するための好ましい培養／生産培地は次の培
地を含む。

１勝」１１旦 ｌＺユ 生成したＬ−６８３，７５６は他の公知の生物学的活性
物質の回収に一般に使用される通常の方法により培養液
から回収することができる。生成したＬ−６８３，７５
６物質は培養した菌体と濾液に見出され、したがって培
養液の濾過または遠心分離により得る菌体と濾液から減
圧下の濃縮。

凍結乾燥、メタノールなどのような通常の溶媒による抽
出、ｐｉ調節、通常の樹脂（たとえばアニオンまたはカ
チオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など）による処理
、通常の吸着剤（たとえば活性炭、ケイ酸、シリカゲル
、セルロース、アルミナなど）による処理、結晶化、再
結晶化などのような通常の方法により単離し精製するこ
とができる。好ましい方法は溶媒抽出特にメタノールを
使用するそれである。

醗酵からの生成物Ｌ−６８３，７５６は［Ｔ細胞増殖試
験」により陽性の免疫抑制活性を示し、これに基づく用
途を持ち、次の物理的特性を示す。

１、白色無定形粉末 ２、メタノールに可溶 ３、　Ｆ　Ａ　Ｂ質量スペクトル分析により求められる
７６３の分子量を持ち、第１図により与えられる分子構
造と一致 上述の醗酵法により得られるＬ−６８３，７５６は通常
の方法たとえば抽出、沈殿、分画結晶化、再結晶化、ク
ロマトグラフなどにより単離し精製することができる。

この物質の適当な公式化はアセテートのような分子のヒ
ドロキシ基を介して形成されるＬ　−６８３゜７５６の
通常の医薬的に受容可能な生年安定性（ｂｉｏｌａｂｉ
ｌｅ）エステルも含むことができる。

上述の醗酵反応とその醸酵混合物の後処理にはＬ−６８
３，７５６へミケタール環の再編成によるＬ−６８３，
７５６の互変異性体も本発明の範囲に含まれることに注
意すべきである。

本発明のＬ−６８３，７５６は免疫抑制活性、抗菌活性
などのような薬理活性を持ち、したがって心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚などのような臓器または組織の移植拒
絶反応、骨髄移植による組織移植対宿主病、変形関節炎
、全身性狼瘉紅斑、橋本氏甲状腺炎、多発性硬化症、重
症性筋無力症、Ｉ型糖尿病、葡萄膜炎などの自己免疫疾
患の予防と治療に有用である。

本発明の医薬組成物は医薬製剤たとえば固体、半固体ま
たは液体の形であって、外部、腸内または全身使用に適
当な無機または有機の担体または賦形剤と混合して活性
成分として本発明のＬ−６８３，７５６を含む形で使用
することができる。活性成分は、たとえば錠剤、ベレッ
ト、カプセル、生薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、お
よび任意の他の使用に適当な形体のための通常の無毒の
医薬的に受容可能な担体と配合することができる。使用
することができる担体は水、ブドウ糖、乳糖、アカシア
ゴム、ゼラチン、マンニトール、澱粉糊、三ケイ酸マグ
ネシウム、タルク、コ−ンスターチ、ケラチン、コロイ
ド性シリカ、ポテトスターチ、尿素オよび固体、宇固体
または液体形体の製剤の製造に適当な他の担体であり、
さらに補添剤、安定剤、増粘剤、着色剤および香料も使
用することができる。活性の目的化合物は病気の治療ま
たは調整に望ましい効果を与えるに十分な量が医薬組成
物中に含まれている。

この組成物を人間に用いる場合、非経口または腸内投与
で用いるのが好ましい、Ｌ−６８３゜７５６の治療的有
効量は変動し、治療を受ける個々の患者の年齢と条件に
基づくものであるが、一般に毎日の用量（７０Ｋｇの男
子を基準として計算）としては活性成分の約０．０１−
１０００層ｇ、好ましくはｏ、ｉ〜５００　ｍｇ！３よ
びより好ましくは０．５〜１００Ｂを病気を治療するた
めに与え、また一般に平均単一用量としては約０．５ｍ
ｇ、　　１ｍｇ、　　５ａ＋ｇ、　　ｌ　Ｏｍｇ、５０
＋ｗｇ、　　１．００１１ｇ、２５０＋ｓｇおよび５０
０ｍｇが投与される。

次の実施例は本発明を例証する目的で示すものであり、
本発明の範囲または思想を限定するものと解釈すべきで
はない。

（ＭＡ　　　６５５９）ＡＴＣＣＮｏ、　　５３７７１
の凍結溶媒をデキストリン（１０，０）、デキストロー
ス（１，０）、牛肉エキス（３，０）。

ａｒｄａｍｉｎｅ　ＰＨ（Ｙｅａｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ、Ｉｎｃ、ｌ　（５、０）、Ｎ−Ｚ　　　Ａｍ１ｎｅ
　　ｔｙｐｅ　　Ｅ　　（５，０）　　、　　ＭｇＳＯ
４７Ｈ，０（０，０５）　、　ＫＨ２ＰＯ，（０，３７
）　、およびＣａＣ０，（０，５）　　（単位ニゲラム
／リッター）からなる圧熱殺菌した種菌培地の５０＋ｗ
ｌを含む２５０ｍ１邪魔板付き振盪フラスコに植菌する
のに使用した０種菌培地のｐＨを圧熱殺菌前７．１に調
節した。種菌を種菌培地中で２２０　ｒｐｍで稼働する
回転振盪機上で２７℃４８時間定温保持した。

もしくは凍結栄養菌糸または斜面原を使用する場合、培
養は種菌培地中で２２０ｒｐ■で２７℃２４時間定温保
持する。得られる種菌培地の２．５ｍ１分を次のあらか
じめ圧熱殺菌した変換培地Ｂの５０ｍ１を含む２５０＋
ｗｌの邪魔板のない振盪フラスコに植菌するのに使用し
た。Ｌ−６８３，５９０をジメチルスルホキシド溶液と
して０．１Ｂ／ｍｌの最終濃度となるように添加した０
次いで振盪フラスコの内容を２２０　ｒｐｍで稼働する
回転振盪機上で２７℃２４時間定温保持した。留意点：
よりより短い期間例えば１８時間の定温保持では大部分
はＬ−６８３，５９０のモノ−Ｃ−３１デメチル誘導体
すなわちＬ−６８３，７４２が生産され、より長い時間
例えば２４時間では主としてビスデメチル体Ｌ−６８３
，７５６が生産され、中間の時間の１８〜２４時間では
２つの混合物が生産され、この場合各々はかなりの量存
在する。

１、変換培地Ｂはブドウ糖（１０，０）　、　Ｈｙｃａ
ｓｅＳＦ（２，０）、牛肉エキス（１，０）、コーンス
テイープリカー（３，０）（単位ニゲラム／リッター）
からなり、ｐＨを圧熱殺菌前７．０に調節した。

を立　　　　の　゛　　　と　　　　　　　性変換培地
Ｂの全培養液（ｌｏｃａｌ）を塩化メチレン（３Ｘ２０
０■ｌ）で抽出した。塩化メチレン抽出液を合併し、硫
酸ナトリウム上で乾燥し、真空下で濃縮して油状残留物
を得た。残留物をアセトニトリルに溶解し、高速液体ク
ロマトグラフ（ＨＰＬＣ）精製を行った。

ＨＰＬＣはＷｈａｔｍａｎ　Ｐａｒｔｉｓｉｌ　　１０
０ＤＳ−３を使用する９、４ｇｗＸ２５ｃｍのカラムで
実行し、６０℃で２０５ｎ■と２２５ｎｗで監視した。

カラムを０，１％）ＩＩＰＯ，水溶液−ＣＨ，ＣＮ、　
５５　：　４５からＯ，１％ＩｈＰＯ，水溶液−ＣＨ，
ＣＮ、２０　：　８０に至るリニアクラジエントで３■
ｌ／分で４０分間展開した。上記抽出液を繰り返し注入
する間に化合物を集めた　　リテンションタイム１２分
の画分を集めてｐｎｓ、５に調節し、蒸発してアセトニ
トリルを除いた。化合物はＣ＋　５Ｓｅｐ−Ｐａｋ　（
ＩｆａｔｅｒｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓｌ　とアセトニト
リル−水の溶離溶媒を使用してさらに精製して２．１ｗ
＋ｇのＬ−６８３゜７５６と称する生成物を得た。

Ｉ２ Ｌ−６８３，７５６はＮＭＲスペクトル分析により与え
られた分子構造を含む第１図のプロトンＮＭＲスペクト
ルを得ることにより確認された。

１．越１ヒｂ１製 上記ＨＰＬＣにより調製した精製Ｌ−６８３゜７５６を
無水エタノールにｌ　ａ＋ｇ／ｍｌの濃度に溶解した。

２・訪 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの牌臓を無菌条件下で取り出し、
水冷した１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯＩ添
加ＲＰＭＩ　　１６４０培地ｆＧＩＢｃＯ。

Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、Ｎ、Ｙ、）中でおだやかに
分離した。細胞を１５０ＯＲＰＭ８分間の遠心分離によ
りベレット化した。混在する赤血球をベレットを塩化ア
ンモニウム溶解用緩衝液ｆＧＩＢｃＯ）で４℃２分間処
理することにより除いた。冷培地を添加し、細胞を１５
００ＲＰＭで８分間再遠心分離した１次いで細胞懸濁液
を次のようにナイロン毛カラム上で分離することにより
Ｔリンパ球を分離した。すなわちナイロン毛カラムを２
０■ｌのプラスチック製注射器中に約４グラムの洗浄し
乾燥したナイロン毛を充填して作った。カラムを２５０
°Ｆで３０分間圧熱殺菌した。ナイロン毛カラムを温培
地（３７℃）で湿らせ、同一培地で洗浄した。温培地に
再懸濁した洗浄した牌臓細胞をナイロン毛にゆっくり加
えた０次いでカラムを直立位置で３７℃１時間定温保持
した。非付着性Ｔリンパ球を温培地でカラムから渚離し
、細胞懸濁液を上のように遠心分離した。

精製したＴリンパ球をｌＯ％熱不活化ウシ胎児血清、１
００＋Ｍグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２
ＸＩＯ−’Ｍ２−メルカプトエタノールおよび５０μｇ
／■ｌゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩ　　１６４培
地からなる完全培地に２．５×１０４細胞／＋＋＋１の
割合に再懸濁した。イオノマイシンを２５０　ｎｇ／　
ａｌｌおよびＰＭＡをｌ　Ｏｎｇ／ｍｌの濃度に添加し
た。細胞懸濁液をただちに９６槽平底ミクロ培養板（Ｃ
ｏｓｔａｒｌ中に２００μｌ／槽づつ分注した。被験薬
品を添加しない培地である対照と試験すべき試料（上記
精製Ｌ−６８３，７５６１の種々な下記希釈液を繰返し
３つの槽に２０μｌ／槽添加した。Ｌ−６８３，５９０
を標準として使用した０次いで培養板を５％ＣＯ□−９
５％空気からなる加湿した大気中で３７℃４４時間定温
保持した。Ｔ細胞の増殖はトリチウム化チミジンの取込
みを測定することにより評価した。４４時間定温保持後
、細胞を２μＣｉ／槽のトリチウム化チミジン（ＮＥＮ
　、　Ｃａｌｌｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡＩで放射能付標し
た。さらに４時間定温保持後、培養を多重試料収穫器を
用いてガラス繊維濾過器上に収穫した０個々の槽に対応
する濾過器ディスクの放射能を標準液体シンチレーショ
ン計数法（Ｂｅｔａｃｏｕｎｔｅｒ）で測定した。繰返
しの槽の１分当たり平均計数を計算し、結果を次のよう
にトリチウム化チミジン取込みＬ−６８３，７５６の種
々な濃度における阻害％の結果を次表に示す。

第１表 Ｌ−６８３７５６によるＴ細　　　の Ｌ　−６８３、７５６（ｎｇ／ａｌｌ　　　　　阻害％
２００　　　　　　　　　　　９８ １３３　　　　　　　　　　９５ ８８　　　　　　　　　　９３ ５９　　　　　　　　　８１ ３９　　　　　　　　　　７０ ２６　　　　　　　　　４４ １７　　　　　　　　　　　１Ｑ １１　　　　　　　　　　　　　Ｑ 注意： １、マウスＴ細胞培養は４８時間目に収穫する前４時間
にわたって１Ｈ−チミジンで放射能付標した。

２、標準Ｌ−６８３，５９０（Ｉ　Ｏｎｇ／ａｌｌは９
９％阻害を示した。

３、Ｌ−６８３，７５６についてはＩＣ８Ｏ＝２７．９
ｎｇ／ｍｌ　＝　３６　、　６　ｎＭであり、一般に３
０〜６０Ｘ１０−’モルである。

４、増殖阻害は５０単位／■ｌの組換えヒトＩＬ−２の
添加により逆転した。

【図面の簡単な説明】

第１図はｃｏｃ　ｒ、中Ｌ−６８３，７５６の４００Ｍ
Ｈ，における１Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトル、第
２図はＣＤＣＩｊ中Ｌ−６８３，５９０の４００ＭＨっ
におけるｌＨ核磁気共鳴スペクトル、第３図はＬ−６８
３，７５６のＣ：ｌ：ｌ核磁気共鳴スペクトルである。 図面の浄書（内容に変更なし） 手続補正書 平成２年４月２ 日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ細胞増殖試験によりＴ細胞活性化の陽性阻害と第
   １図に示すようなプロトン核磁気共鳴スペクトルとＦＡ
   Ｂ質量スペクトル分析により求められる７６３の分子量
   とを示すＬ−６８３、７５６と称する免疫抑制剤。 ２、第１図に示すような分子構造を持つ免疫抑制剤Ｌ−
   ６８３，７５６． ３、医薬的に受容可能な実質的に無毒の担体または賦形
   剤を配合したＬ−６８３，７５６の治療的有効量を含む
   医薬組成物。 ４、Ｌ−６８３，７５６の治療的有効量を人間に投与す
   ることからなる移植拒絶反応を予防するか、もしくは自
   己免疫疾患または感染性疾患を治療するために人間を治
   療するための使用方法。