JPH0219320A - 新規免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規免疫抑制剤「イムノマイシン」。

その新規ＩＪ造法のみならず免疫抑制剤としての「アス
コマインン」の新規使用法、及び、自己免疫病、感染疾
患の治療及び／又は、ｉｉ器移植拒否の予防のため患者
に使用する使用法に関する。

１９８３年、米国ＦＤＡは、臓器移植外科の分野で革命
的な変化をもたらした。非常に効力ある抗拒否剤である
シクロスポリンを認可した１本薬剤は移植されたクンバ
ク質を拒否するために、蓄えられた非常に多くの天然防
御因子が働らく場合その生体免疫系を阻害するように働
く。

本薬剤が移植拒否に効果的に働く程、腎疾患、肝損傷、
多くの場合非常にきびしい潰瘍を引き起こす欠点がある
。

より新しく、安全な副作用のない薬剤が、常に本分野で
求められている。

本願において引用として記載するフジサワのＥＰＯ公開
番号０１８４１６２にはシクロスポリンよりも１００倍
効力あると評価される新規マクロライド免疫抑制物質Ｆ
Ｋ−５０６について記述されている１本マクロライドは
特定菌株ストレプトマイセス　ツクバエンシス（Ｓｔｒ
ｅ　Ｌｏｗ　ｃｅｓＬｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓｌの醗酵
培養により製造される。

から製造される類縁マクロライド免疫抑制物質について
も記載されている。

Ｔ、アライのＵＳＰ３，２４４，５９２には。

抗菌剤「アスコマイシン」の製造にストレブトマ憇朋ｎ
！１組凹）の培養が記載されている。しかしここには、
免疫抑制活性のある多くの物質の製造に関しての記載が
ない。

含有の炭水化物培地中ｐＨｓ、Ｏ以下で好気的沈降発酵
条件下で、醗酵培養する事により新規免疫抑制剤［イム
ノマイシン」を得る事ができる事が判明した。

木「−イムノマイシン」は免疫抑制活性を有する。すな
わち、カルシウムイオノフオア（イオノマイシン）ホル
ボールミリステートアセテート（ｒ’ＭＡ）誘発Ｔ−細
胞刺激検定（本願においては「Ｔ−細胞増殖検定」と言
う）により示された如くＴ−細胞活性化阻害が陽性であ
る。

本検定の原理はイオノマイシン及びＰＭＡの併用で刺激
したマウスＴ−リンパ球の増殖を測定するものである０
本検定において、陽性の試料は。

］゛−細胞の増殖を阻害するが、この場合トリチウム標
識チミジンの取り込みが減少する事で阻害が示される。

本申請に、その目的のため引用するＵＳＰ３．２４４，
５９２に記載の抗菌剤アスコマイシンも又、免疫抑制活
性を有する。

本発明に従い、以下の事を提供する。すなわち：菌株ス
　レブトマイセスヒグロスコビクスバル、アスコマイセ
テ　クスを窒素栄養含有の炭水化物培地中、ｐ）１８．
０以下にて、好気的沈降発酵条件下、十分な時間培養す
る工程を特徴とする「イムノマイシン」として同定した
免疫抑制剤の製造法。

更に、Ｔ−細胞増殖検定の結果、Ｔ−細胞活性化阻害が
陽性であり、マススペクトル分析により得られた分子量
が７９１．４７８４である。上述の方法により製造され
た新規免疫抑制剤［イムノマイシン」を提供する。

更に又、医薬として望ましい、実質的に無毒性の担体又
は賦形薬と併用した、治療効果のある量の「イムノマイ
シン」含有薬剤組成物を提供する。

加つるに、治療効果のある量の［イムノマイシン」をヒ
ト思考に投与する事を特徴とする移植拒否予防、自己免
疫病又は感染疾患の治療のための使用法を提供する。

更に又、治療効果のある量の「アスコマイシン」をヒト
患者に投与する事を特徴とする移植拒否予防、自己免疫
病又は感染疾患の治療のための使用法を提供する。

本発明は、その特殊な目的のため、本願において引用し
たＩＪＳＰ３，２４４，５９２中に、その物理的特性と
分類に関して広範に記述されているストレブトマイセス
ヒグロスコとクスバル、アスコマイセテ　クスの醗酵培
養を包含する。

本発明はＳ、ヒ　ロスコビクスバル、　スコフ４ｅ’ｒ
９；ｌの多くの［イムノマイシン−生産」菌株により実
施できるが、特にＡ　Ｔ　Ｔ　Ｃ１４８９１菌株が望ま
しい。

一般に、「イムノマイシン」は、同化できる炭素及び窒
素源を含む栄養培地中でイムノマイシン物質−生産菌を
培養（醗酵）して製造できるが、この場合好気的沈降発
酵が好ましい（例えば振とう培養、深部培養等）、培地
は醗酵培養工程の初期及び終期（収穫時）でｐｉ−１８
，０以下に保たねばならない、ｐＨが高いと実質的な及
び／又は全体の生成物損失をまねく、所望されるｐＨは
モルホリノエタンスルホンｕ　（ＭＥＳ）　１モルホリ
ノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等の如き緩衝液を用
いるか、又は、例えば後述のＫＱ及びＦ　Ｋ　Ｓ　Ｈ生
産培地の如き緩衝性を固有に持つ栄養物質を選んで用い
、そのｐ　Ｈな保持する事ができる。

栄養培地中の、望ましい炭素源は、グルコース、キシロ
ース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキスト
リン等の如き炭水化物である。

含有できる他の炭素源はマルトース、ラムノース、ラッ
フィノース、アラビノース、マンノース、サリチン、ナ
トリウムスクシネート等である。

望ましい窒素源は、イースト抽出物、肉抽出物、ペプト
ン、グルテン粉、綿実粉、大豆粉及び他の植物粉（一部
又は全部が脱脂粉）、カゼイン加水分解物、大豆加水分
解物、イースト加水分解物、トウモロコシ浸潤液、乾燥
イースト、麦芽、羽毛粉、ビーナツツ粉、醸造可溶成分
等、のみならず、アンモニウム塩（例えば硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）尿素
、アミノ酸等の如き無機及び有ＩａＭ素化合物である。

炭素及び窒素源は両省併用する事が望ましいが、それぞ
れの純品を用いる必要はない、これは、やや不純な物質
が、微量の増殖因子、及び所要ＦＬｔの灰分を含んでお
り、使用するのに適切なためである。必要ならナトリウ
ム又はカルシウムカルボネート、ナトリウム又はカリウ
ムホスフェート、ナトリウム又はカリウムクロライド、
ナトリウム又はカリウムアイオダイド、マグネシウム塩
、！！４塩、コバルト塩等の如き無機塩を灰分として培
地に加える事ができる。もし必要なら、特に培地が、は
げしく泡立つ場合は、流動パラフィン、粗油、植物油、
鉱油又はシリコンの如き消泡剤を加える事ができる。

大量のイムノマイシンを５２造する条件としては、好気
的沈降発酵条件が望ましい、少量の製造には、フラスコ
又はビン中で振どう又は表面培養が用いられる。更に、
増殖を大きなタンク中で行う場合、イムノマイシン製造
工程で増殖遅延を防ぐため、製造用タンク中に接種する
のに、よく成育した微生物を用いるのが望ましい、従っ
て、初めに、スラント中で出来た、微生物の胞子又は菌
体を、比較的少量の培地中に接種して成育接種物を作り
この、いわゆる「種培地」を培養した後、培養成育接種
物を大きなタンクに無菌的に移す事が望ましい、成育接
種物を作る培養培地は実質的には同じか又は、イムノマ
イシン製造に利用する培地とは異なる。この培地は、接
種前にあらかじめ殺菌のためオートクレーブにかけるの
が一般的である。培地のｐ　Ｈは、一般に酸又は塩基を
適切な量加え（緩衝液の形が望ましい）オートクレーブ
の工程以前にあらかじめ８．０以下に調節する。

培養混合物の撹拌及び通気は種々の方法で行う事ができ
る。撹拌は、プロペラ又は類似の機械的撹拌装置、ファ
ーメンタ−の回転又は振とり、種々のポンプ装置、又は
培地中への殺菌空気の通気により行う事ができる０通気
は培Ｉ！１混合物中に。

無菌空気を通気して行う事ができる。

醗酵培養は一般に、約２０°〜４０℃（２５゜〜３５℃
）で、Ｗ１酵培養条件及び、培養社の程度に依存して変
化し、約５０〜１５０時間にて行う、生産培地は１回転
振とり機上、２２Ｏｒｐ−にて、２７℃で約９６時間イ
ンキュベートする事が望ましく、培地のｐ　Ｈを８．０
以下に保って、培養しハーベストするのが良い。

所望な醗酵培養を行うための培Ｉ！／生産培地は以下の
培地である。

猛：フィクス（ｆｉｇｓ）、デキストリン、原発性酵ｑ
　、　ＣｏＣ１ｍ’６１１ｍ０．及びＰ　２０００（Ｄ
ｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇｌの如き消泡剤を、培地に対する
所望な重量パーセントとして、それぞれ３．０％、１．
５％、１．０％、０．００５％及び０．２５％（容量／
容量）含有する６本培地の１１Ｈは一般に、オートクレ
ーブで殺菌及び種培養物による接種前に約７．４に調節
する。

１１Ｐ２１ニゲルコース、グリセロール、硫酸アンモニ
ウム、リン酸二水素カリウム、リシ酸水素二カリウム、
Ｌ−リジン、栄養大豆にュートリソイ）、及び１モルホ
リノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）の如きＭｉ術剤を、培
地に対する所望なｗｉｔパーセントとして、それぞれ２
．０％。

２．０％、０．５％、０．２５％、０．’２５％。

０．４％、３．０％及び２．１３％含有する０本培地の
ｐ　Ｈは一般にオートクレーブで殺菌及び種培養物によ
る接種の前に約６．３に調製する。

ＦＫＳ）ｌ　ニゲルコース、トウモロコシ浸潤液。

原発性酵母、トウモロコシグルテン粉、麦芽、及びＣａ
ＣＯ５を、培地に対する所望な重量パーセントとしてそ
れぞれ、４．５％、１．０％、１．０％。

１．０％、０．５％及びＯ，１％含有する。培地のｐ　
Ｈは一般にオートクレーブで殺菌及び種培養物による殺
菌前に約６．８に調製する。

上述の所望な生産培地はＲＰ２１及びＦＫＳＨであり％
ＦＫＳＩ（培地でやや高い収量が得られる。ＲＰ２１培
地は流動性が高いため、取り扱いが便利である。

生産されたイムノマイシンは、他の生物活性物質を得る
のに一般に用いられている従来の方法により培地中から
得る事ができる。生産されたイムノマイシン物質は、培
養菌体及び濾液中で検出される。従って、培地を濾過又
は遠心し、減圧濃縮、凍結乾燥、メタノール等の如き従
来の溶媒による抽出、ｐ！１調節、従来の＃Ｍｉｌｌ（
例えばアニオン又はカチオン交換樹脂非イオン性吸着樹
脂等）による処理、従来による吸着剤（例えば活性炭。

ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等）による
処理、結晶化、再結晶の如き従来の方法で菌体及び濾液
中より単離、精製する事ができる。

望ましい方法は溶媒、特にメタノールを用いる抽出であ
る。

培養した培養液中には「Ｔ−細胞増殖検定」による陽性
の免疫抑制活性が存在するため、利用価値がある。

生成物「イムノマイシン」は以下の物理的特性を有する
。

！、白色無定形粉末 ２、メタノールに可溶 ３、マススペクトル分析により分子量 ７９１．４７８４．実験式Ｃｎ１ｌｌｓＪＯ＋ｉ上述の
醗酵培養法により得られたイムノマイシンは１例＾ば、
抽出、沈殿１分別結晶化、再結晶、クロマトグラフィー
等、従来の方法で単離精製できる。

本物質の望ましい塩は１例えば、アルカリ金属塩（例え
ばナトリウム塩、カリウム塩等）、アルカリ土属金属塩
（例えばカルシウム塩、マグネシウム塩等）アンモニウ
ム塩、アミン塩（例えばトリエチルアミン塩、Ｎ−ベン
ジル−Ｎ−メチルアミン塩等）、及び従来の有ｉ塩の如
き、医薬として望ましい塩である。

上述の醗酵培養反応、混合物の後処理において、イムノ
マイシンに不整炭素又は二種結合が存在するため、イム
ノマイシンの構造異性体及び／又は立体異性体が、場合
により他の構造異性体及び／又は立体異性体に変換され
るが、このような場合も本発明の態様内にある事に注意
されたい。

本申請に引用として用いたＵ　Ｓ　Ｐ　３，２４４．５
９２に記載の抗菌剤「アスコマイシン」は免疫抑制活性
を有し、ここに「イムノマイシン」と記載の如く、免疫
抑制剤としても有益である。

本発明のイムノマイシンのみならずアスコマイシンは免
疫抑制活性、殺菌活性の如き薬理活性を（Ｔするので、
心臓、腎臓、肝臓、骨髄、皮）１等の臓器、又は組織の
移植拒否治療、及び予防、骨髄移植による移植一対一宿
主疾患、リウマチ関節炎、全身紅斑性狼廼、橋本病、多
発性硬化症、重症性筋無力症、ＩＩ！：！糖尿病、葡萄
膜炎等の自己免疫病、病原性微生物による感染病等の治
療、予防に有益である。

本発明の薬剤組成物は、医薬製剤の形１例えば、活性成
分として、本発明のイムノマイシン又はアスコマイシン
を、外用、内用又は注射用として用いるのに望ましい有
機又は無ＩＩＩＩＸ！体又は賦形薬と併用して含有する
固形、半固形又は液剤形として用いる事ができる。活性
成分は、一般の無毒性で医薬として望ましい担体を用い
、錠剤、ベレット、カプセル、十薬、液剤、乳剤、懸濁
剤及び使用に望ましい他の形にする事ができる。用いる
事のできる担体は、水、グルコース、乳糖、アラビアゴ
ム、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、マグ
ネシウムトリミリケート、タルク。

トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド状シリカ、
ポテトデンプン、尿素及び固形、半固形又は液体の形で
製薬界で用いるのに望ましい他の担体であり、加えて補
助剤、安定化剤、濃厚化剤、着色剤及び香料を用いる事
ができる。

本活性化合物は病気の過程又は症状に対して所望な効果
を得るのに十分な量を薬剤組成物中に含有せしめる。

本組成物をヒトに投与する場合、内用又は注射剤として
投与するのが望ましい、イムノマイシン又はアスコマイ
シンの治療に効果のある投与量は、治療する患者の年中
及び症状に依存して変化するが、一般には、１日の投与
量は病気の治療に活性成分は約０．Ｏｌ−１０００ｍｇ
、（０，１〜５００−ｇｈ’望ましく０．５〜１００■
ｇが最も望ましい）である（この場合ヒト７０Ｋｇ体重
にもとずいて計算した。一般に約０．５■ｇ、１−に、
５−ｇ。

１０■ｇ、５０■ｇ、　　１００ｍｇ、　　２５０ｍｇ
及び５００■起の単位投与形として投与する。

以下の実施例は１本発明を例示する目的で配達したもの
であり１本発明の態様又は意図を限定したものと考える
べきでない。

コマイセティクスはアメリカンタイプカルチャーコレク
ションより入手した（＾ＴＣＣＮｏ、Ｉ４８９１）　、
凍結菌を２−１２の食塩水中に懸濁させｌ５Ｐ４−ＮＺ
Ｅスラント＜ＩＳＰ培地４．デイフコラボラトリーズ（
Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、　に０．０
６，６％Ｎ−ＺアミンＥ、シェフイールドプログクツ（
ＳｈｅｆｆＬｅｌｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、を加えたも
の）に接種するため、その０．２　ｓεを用いた。スラ
ントを２７℃で２〜３日インキエベートした。スラント
の表面をこすり取り、デキストリン１．０％、グルコー
ス０．１％、牛肉エキス０．３％、アルダミンＰＨイー
ストブロタクツインク、　　（ＹｅａｓＬＰｒｏｄｕｑ
ｔｓ、　Ｉｎｃ、　）　０　、５％、Ｎ−２アミンＥ型
０．５％、　ＭｇＳＯ４・７Ｂ、００．００５％、にＩ
ＩｍＰＯ＊０．００９１％、　　ＮａｘｌｌＰＯ＊　　
０　、　　ＯＯ９５％。

ＣａＣＬ　０　、０５％をから成る、滅菌種培地５０■
βを含む２５０■βのバクフル振どうフラスコ中に接種
した。Ｍ培地のｐ　Ｈはオートクレーブ処理の前にあら
かじめ７．１に調節した６回転振とう機にて、２２Ｏｒ
ｐ−で２７℃、２４時間インキュベートした。出きた菌
成長種培地を１．５ｍＩ２ずつ取り、あらかじめ滅菌し
た。以下に示す３梯の生産培地を各々４５−βずつ含む
振とうフラスコ（バッフルなし）中に接種し続いて回転
振とう機にて、２２Ｏｒｐ霞で２７℃９６時間インキュ
ベートした。

１、　フィグス３．０％、デキストリン１．５％、原発
性酵母１．０％、　ＣｏＣ１ｍ・６Ｈ１０Ｇ、０旧％。

消泡剤Ｐ−２０００（ｎｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ）　０．
２５％。

（Ｖ／Ｖ）から成るＫＱ生産培地は、オートクレーブで
の滅菌前にあらかじめｐＨを７．４に調節した。イムノ
マイシン量２０マイクログラム／■ｅを含む培養液が得
られた。

２、　グルコース２．０％、グリセロール２．０％Ｉ　
　ＩＮＩ＋４１　ｘｓＯ４０、５％、に１１□Ｆ”０．
０．２５％。

°に、＋１１）０．０　、２５％、■、−リジン０．４
％栄養大豆（曲Ｌｒ１ｓｏｙ）　３．　０％０モルホリ
ノエタンスルボン＃　（ＭＥＳＩ緩衝剤２．１３％から
成るＲＰ２１生産培地はオートクレーブで滅菌する前に
、あらかじめｐ　１１を６．３に調節した。イムノマイ
シン量２０マイクログラム７ｍβを含む培養液が得られ
た。

３、　　グルコース４．５％、トウモロコシ浸潤液１．
０％、原発性酵母！、０％、トウモロコシグルテン扮１
．０％、麦芽０．５％、　ＣａＣ０，０，１％から成る
ＦＫＳ）Ｉ生産培地は、オートクレーブで滅菌する前に
あらかじめｐＨを６．８に調節した。イムノマイシンｆ
ｆ１４０マイクログラム／　ｒａ　１２を含む培養液が
得られた。

！、越Ｕ暫 上述培養液の各々Ｉｓβ試料に等容量のメタノールを加
え、ｌ：２全培養液当量（Ｉｌ［ｌＥ）とした。

試料を３０００ｒｐ−で５分間遠心し、１清をＴ−細胞
増殖検定の出発物質として用いた。

２．１亙 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの牌臓を無菌条件下で取り、ｌＯ
％熱不熱性活性化ウシ胎児血清［［１ＣＯｌ　を加＾た
氷冷ＲＰＭＩ１６４０培地キブコ、グランドアイランド
ニューヨーク（ＧＩ［ｌＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎ
ｄ。

Ｎ、　Ｙ、　）中でゆつ（つと、ばらばらに切り離した
。

１５００ｒｐ■で８分間遠心し、細胞をペレット状にし
た。ペレットを塩化アンモニウム溶血ＩＡｉ！Ｒ液（Ｇ
ＩＢＣＯＩにて、４℃で２分間処理し、混在する赤血球
を除去した。冷却した培地を加え、細胞を再び、１５０
０ｒｐ−で８分間遠心した０次に以下の如くナイロンウ
ールカラムにて細胞懸濁液を分離して゛ｒリンパ球を単
離した。ナイロンウールカラムは、２０■εのプラスチ
ック製シリンジ中に、洗浄して乾燥したナイロンウール
な約４グラムつめて作製した。カラムを２５０°Ｆ、３
０分間オートクレーブにて滅菌した。ナイロンウールカ
ラムを温培地（３７℃）で湿めらせ、同培地でリンスし
た。温培地に、再懸濁した洗浄牌臓細胞をナイロンウー
ルカラム−１−に乗せ、垂直にして、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。非吸着′ｒリンパ球が、温培地によ
りカラムから流出した。細胞懸濁液を１−のように作製
した。

ｈ１製した１゛リンパをｌＯ％熱不熱性活性化ウシ胎児
血清００μＭグルタミン、１ｓ＋Ｍピルビン酸ナトリウ
ム、　　２　Ｘ　ｌ　Ｏ−’Ｍ２−メルカプトエタノー
ル、５０μｇ／園βゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ　１
６４０培地から成る完全培地中に１０’細胞／−ｅ濃度
で懸濁させた。イオノマイシンを２５０μｇ／ｍ１．Ｐ
ＭＡをｌｏｎｇ／ｍｇ加えた。細胞懸濁液を、９６六乎
而底マイクロカルチヤープレート（Ｃｏｓｔ、ａｒ）中
に、１ｏＯｕｆｆ／穴ずつすばやく分配した。基準（シ
クロスポリン）培地、又は検定する試料（上述のメタノ
ール抽出物）の種々に希釈した以下に示す希釈物をｌＯ
μｅ／穴ずつトリブリケートで加えた。培養プレートを
５％ＣＯｘ−９５％空気の湿潤環境下、３７℃で４４時
間インキュベートした。１゛リンパの増殖をトリチウム
標識チミジンの取り込みを測定して検定した。

４４時間培養後、２μＣｉ／穴のトリチウム標識チミジ
ンＩＮＥＮ、ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）　Ｍ
ＡＩで細胞をパルス標識した。さらに４時間インキュベ
ートした後、複数試料採取装置を用いグラスファイバー
フィルター上に細胞を取った６個々の培養穴に対応する
フィルターディスクの放射活性を標準の液体シンチレー
ション測定法（ベータカウンター）により測定した。培
養穴の平均ｃｐ−を計算し、その値を以下の如（トリチ
ウム４識チミジン取り込み（増殖）のパーセント阻害と
して表わした。

人−ｍ−１ 注：１．４８時間に採取する４時間６ｆｉｉこ３Ｈ−チ
ミジンでマウスＴ細胞をパルス標識 した。

２、基準シクロスポリンＡ　（１００ｎｇ／ｍｆｆ　）
は９７％阻害を示した。

：１．ＫＱ希釈物はｌ（Ｐ　２１及びＦ　Ｋ　Ｓ　ＩＩ
より５倍高かった。

培地試料の種々の希釈物にあけるパーセント阻害を下の
表１に示す。

溶媒組成ニアセトニトリル：水（１３ニア）を用いフナ
ウェル（にｎａｕｅｒ）　６４ポンプにて１．０ｓＪ２
／分で流出させた。

カラム：リクロソルブ（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂｌ　ＲＰ
　−１８（１三Ｍ　５ｃｉｅｎｃｅ）、　４　、　ＯＸ
　２５０ａｋｍ、　５ミクロン不ぞろい粒子、ガードカ
ラムなし、４０℃にて稼動。

検出器：フナウェル８フ型波長可変ＵＶ検出器にて、２
０５ナノメーター　１０１ｍ１１通過中、！、０ボルト
／　ＡＵ、データはネルソンアナリテイ力ルモデル（Ｎ
ｅｌｓｏｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｍｏｄｅｌ）　３
０００データステーシヨンに記録、２５ミリボルト／全
目もつ。

ｎＰ２１ｊｉａｉ培地のメタノール抽出液２５マイクロ
リツトルを注入し７．６６分の保持時間でイムノマイシ
ンの巾広ピークを持つクロマトグラムが得られた。これ
に比べ、ＰＫ−５０６マクロライト免疫抑制剤を含む培
養液は、保持時間７．８２分を示した。９．６秒の保持
時間の違いは、二柚の免疫抑制剤が同一でない事を示し
た。イムノマイシン抽出物のクロマトグラムで観察され
たピークは巾広で対象であった。

７，６６分におけるＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃピークのｔｔ物活性
の確認のため、及びあらかじめ、いくつかのスペクトル
データな得るため、全培養液の２０ミリリツトルと当量
のＩｔ　ｌ）　２１及びＦ　Ｋ　Ｓ　Ｈ培養液抽出物の
組みあわせである第２メタノール抽出物を用いた。抽出
物を真空ド濃縮し、５ｍｇの水と３×５ａ＋ｇの酢酸エ
チルに分配した。酢酸エチル分画を留去し、残すな９５
％メタノール５ｍｌと３×５１１εｎ−ヘキサンに分配
した。得られた脱脂メタノール抽出物を留去し２５０マ
イクロリツトルのメタノールに溶かし以下の条件でプレ
バラティブＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃで精製した。

蓋ｊニー 溶媒組成ニアセトニトリル：水（１：ｌニア）を用いフ
ナウェル６４ポンプにて４．６−１２／分で流出させた
。

カラム：リクロソルブｒ（Ｐ　−Ｉｌｌ　（ＥＭ　５ｃ
ｉｅｎｃｅ）。

１０、ＯＸ２５０ｍｓ、７ミクＯ：／不（’ろ１Ａｌｕ
子。

ガードカラムなし、室温にて（約２０℃）稼動。

検出器：フナウェル８フ型波長可変Ｕｖ検出器にて、２
０５ナノメーター、０．４−一通過中、１．０ボルト／
　Ａ１１．データはネルソンアナリティカルモデル３０
００データステーションに記録、２００ミリボルト／全
目もつ。

ｕ：４．６ミリリツトルずつ３０分画。

−回の実験で試料全部を分画した０分画を検定のため３
ｒｎにわけた。試料Ａ−Ｊから得られた結果下の表１■
に示した。各分画の１部、ヘキサン抽出物及び上記分配
時の水抽出物（１ｍｆｆの全培養液と当ｆｆ１）をＴ−
細胞増殖検定、抗菌活性のために用いた。生物活性を以
下の表に示す、′ｌ°−ｌロー殖検定は、実施例２、メ
タノール培養液希釈物１　：　３０，０００の試料でそ
こに記載の方法を用いて行った。

人−一一旦 （非常にわずか） 表から明らかのように、免疫抑制及び抗菌活性は分画■
シが最高である。

上述のクロマトグラフィー分画Ｅの試料を１空下留去し
、残すに関しマススペクトル分析を行った。

フィンニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎｌ　ＭＡＴ２１２装置
により、内部標準としてＰＦＫ　（過フルオロケロセン
）を用い、ピーク適合法で電子衝撃モードにて、以下の
高分解のＭＳデータを得た。

ＬＪ！　　夫−鳳一ス　　１豆菫　　　友■埜Ｍ”　　
　　　Ｃ，、Ｈ，。ＮＯ，１７９１，４８２０７９１，
４７８４Ｍ”−Ｈ，ＯＣ，３１１ａＪＯ□　　？７３．
４７１４　　７７３．４６９７上に示すように帰属した
実験式は高分解能マス値と合致した。

醗酵培養培地及び１１　Ｐ　Ｌ　Ｃ分画の抗菌活性につ
いて２２種の糸状カビ、３種の細菌、２４種の酵母に対
する活性スペクトルを得るため、これらのパネルに対し
、ディスク−拡散感応法により決定した。得られたスペ
クトルをコンビ上−ターで対方式により以前に調らべた
試料のスペクトルと比較し、対の間での類似性を評価し
た。試料を９種の溶媒系を用いて、薄層クロマトグラフ
ィーでも調べた。抗菌物質の移動性はバイオオートグラ
フィーで検出した。得られた構成パターン又はスペクト
ルをコンピューターで対方式により、以前調べた抗菌剤
のパターンと比較した。

肚鹿止丘逓■韮ｌ Ｆ　Ｋ　Ｓ　ＩＩ培養液のメタノール抽出物（１：１貰
ＢＩＥ）の分類によれば、抽出物中に少くとも３種の抗
菌物質が存在する事が’ｒ　ｆ、、　Ｃ／バイオオート
グラフィーにより確認された。抗菌スペクトルのパター
ン適合によれば、以前調べられた試料との類似性が認め
られなかった。

止り旦亘分且韮Ｉ 上述の）（Ｐ　１．　Ｃ分画（Ｃ，ｌ）、Ｅ及びＦ）を
用いた検討の結果からそれぞれの中に単一の抗菌成分が
含有する事が’ｒ　１．　Ｃ／バイオオートグラフィー
により確認された。４種の試料の全ては、同様の移動性
を有し、上述のＦＫＳＨ培養液の主要な抗菌成分を含有
していた。活性は糸状カビに限定され、３種の酵母に対
しては、ごく低い活性を認めた。

級蕩 これらの実験結果に基づきＩ（Ｐ　Ｌ　Ｃ分画Ｂ。

Ｃ，Ｄ及びＥの抗菌スペクトルは、アスコマイシンの記
載とも一致するものと考察された。

出 願 人：メルク エンド カムバニ インコーボレーテッド ｒ−続７市−正書 （方式） （１）別紙の通り 明細書１通を提出致します。

ヤ成１年５月１５日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、菌株ストレプトマイセスヒグロスコビクスバル、ア
   スコマイセティクスを、窒素栄養含有の炭水化物培地中
   、ｐＨ８．０以下にて、好気的沈降発酵条件下、十分な
   時間培養することによりなる「イムノマイシン」として
   同定した免疫抑制剤の製造方法。 ２、当該微生物がＡＴＣＣ１４８９１である請求項１の
   方法。 ３、当該培地が、グルコース、グリセロール、（ＮＨ＿
   ４）＿２ＳＯ＿４、ＫＨ＿２ＰＯ＿４、Ｋ＿２ＨＰＯ＿
   ４、Ｌ−リジン、栄養大豆（ニュートリソイ）及び、モ
   ルホリノ−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液を含有す
   る「ＲＰ２１」醗酵培地である請求項１の方法。 ４、当該培地が、フィグス（ｆｉｇｓ）、デキストリン
   、原発性酵母、ＣｏＣｌ＿２・６Ｈ＿２Ｏ、及び消泡剤
   を含有する「ＫＱ」醗酵培地である請求項１の方法。 ５、当該の培地がグルコース、トウモロコシ浸潤液、原
   発性酵母、コーングルテン粉、麦芽、及びＣａＣＯ＿２
   を含有する「ＦＫＳＨ」醗酵培地である請求項１の方法
   。 ６、Ｔ−細胞増殖検定の結果、Ｔ−細胞活性化の阻害が
   陽性である、「イムノマイシン」含有の、請求項１の方
   法により製造した培養液。 ７、請求項１の方法により製造した免疫抑制剤。 ８、Ｔ−細胞増殖検定の結果、Ｔ−細胞活性化の阻害が
   陽性であり、マススペクトル分析により得られた分子量
   が７９１．４７８４である、免疫抑制剤「イムノマイシ
   ン」。 ９、医薬として望ましく、実質的に無毒性の担体又は賦
   形薬と併用した、治療上有効量の「イムノマイシン」含
   有薬剤組成物。 １０、治療上有効量の「イムノマイシン」をヒト患者に
   投与する事を特徴とする、移植拒否の予防、自己免疫病
   又は感染疾患の治療のための使用法。 １１、治療上有効量の「アスコマイシン」をヒト患者に
   投与する事を特徴とする、移植拒否の予防、自己免疫病
   、又は感染疾患の治療のための使用法。