JPH03153692A - 新規な免疫抑制剤化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な免疫抑制剤“ツクバマイシンＡ″ＦＫ−
５０６のＣ−９ジヒドロ類似体及び微生物ストレブトミ
セスツクハエンシス（５ｔｒｅｐｔｏｓｙｃｅｓｔｓｕ
ｋｕｂａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ、９９９３（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−９２７）を利用してＦＫ−５０６を生産する発酵方法
の副生成物として得られるＦＫ−５０６のＣ−２１プロ
ピル類似体である免疫抑制剤“ツクバマイシンＢ″の新
規な製造方法に関する。この方法は、ＦＫ−５Ｏ５を製
造する条件下で微生物を培養することを包含する。また
自己免疫疾患、感染症を治療し及び／又は器官移植片拒
否反応を防止するためのヒト宿主に於ける使用方法が開
示される。

１９８３年に米国ＦＤＡは非常に有効な抗拒否反応薬剤
、シクロスポリンを認可し、これは器官移植片手術の分
野に革命をもたらした。この薬剤は、移植片の異種タン
パク質を拒絶する莫大な量の天然保護物質を移動させる
ことによって体内の免疫系を阻害することによって作用
する。

この薬剤は、移植拒否反応を抑えるのに有効であるほど
、腎不全、肝障害及び潰瘍を引き起こすという欠点かあ
り、多くの場合、かなり重篤であり得る。

本明細書に引用されるフジサワによる欧州特許庁公開番
号ｉ　０１８４１６２号は、シクロスポリンより　１０
０倍有効であるとみなされる新規なマクロライド免疫抑
制剤ＦＫ−５０６を記載している。このマクロライドは
ストレブトミセスツクバエンシスＮｏ、９９９３（ＦＥ
ＲＮ　ＢＰ−９２７）と特定菌株の発酵によって生産さ
れる。また極めて関連のあるマクロライド免疫抑制剤で
ある同じ微生物によって生産されたＰＫ−５２５及びＳ
、ヒゲロスコピカス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
）亜種ヤクシマエンシス（ｙａｋｕｓｈｉｍａｅｎｓｉ
ｓ）によって生産されたＦＫ−５２０及びＦＫ−５２３
も記載されている。

Ｔ、アライによる米国特許第３，２４４，５９２号はス
トレプトミセスヒゲロスコピカス変異種アスコミセチカ
ス（ａｓｃｏ叶ｃｅｔｉＣｕｓ）を培養して抗真菌剤“
アスコマイシン”を製造することを記載している。

しかしながら文献中には、シクロスポリンの副作用が実
質的にない免疫抑制剤を製造することについて記載され
ていない。

この分野では副作用の少ない新しい安全な薬剤か絶えず
探索されている。

新規な免疫抑制剤、ＦＫ−５０５のＣ−９ジヒドロ類似
体である“ツクバマイシンＡ”及びＦＫ−５０６のＣ−
２１プロピル類似体である“ツクバマイシンＢ“か窒素
栄養源を含む炭化水素水性培地中ＦＫ−５０５を生産す
る浸漬好気性条件下で微生物ストレブトミセスツクバエ
ンシスＮｏ、９９９３（ＦＥＲＩＩＢＰ−９２７）の発
酵の副生物として得ることができ、該条件かｐＨ約７で
行われることを見い出した。

結果として生じた″ツクバマイシンＡ及びＢ”は免疫抑
制作用即ち本明細書で“Ｔ−細胞増殖検定”と呼ばれる
カルシウムイオノフオア（イオノマイシン）＋ホルボー
ルミリステートアセテート（ＰＭＡ）誘発Ｔ−細胞刺激
検定によって示された場合Ｔ−細胞活性化の阻害か陽性
を示す。

この検定の原理はイノマイシンとＰＭＡの組合わせで刺
激したマウスＴリンパ球の増殖を測定することである。

この検定の陽性試料は還元トリチウム標識チミジンの取
り込みによって示される通り、Ｔ−細胞増殖を阻害する
。

本発明によれば、Ｔ−細胞増殖検定によりＴ−細胞活性
化の阻害か陽性を示し、テトラ（トリメチルシリル）誘
導体として高分解能質量スペクトル分子イオン（層／ｚ
）　１０９３．６５５６と厘／ｚ６７３及び４８１に於
て特徴的フラグメントイオンを示す新規な免疫抑制剤“
ツクバマイシンＡ”か提供される。

また医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は賦形
剤と共に“ツクバマイシンＡ“の治療上有効な量を含有
する医薬組成物が提供される。

更に“ツクバマイシンＡ″の治療上有効な量をヒト宿主
に投与することを特徴とする移植拒否反応を防止するた
めに該宿主を治療するか又は自己免疫疾患又は感染症を
治療する使用方法か提供される。

更にその上、窒素栄養源を含有する炭化水素水性培地中
浸漬好気性条件下で微生物ストレプトミセスツクバエン
シスＮｏ、９９９３（ＦＥＲＭ　ＨＰ−９２７）を発酵
させる工程を包含し、かかる条件かｐＨ約７て行なわれ
、“ツクバマイシンＢ″を回収するＴ−細胞増殖検定に
よりＴ−細胞活性化の阻害か陽性を示しトリ−（トリメ
チルシリル）誘導体として高分解能質量スペクトル分子
イオン（＠／Ｚ）　１０２１．６１６９とｍ／ｚ６７５
及び４８３に於て特徴的フラクメントイオンを示す免疫
抑制剤“ツクバマイシンＢ”の新規な製造方法か提供さ
れる。

本発明は“ツクバマイシンＡ及びＢ″を生産するストレ
ブトミセスックハエンシスＮｏ、９９９３（ＦＥＲＭ　
ＢＰ−９２７）の発酵を包含する。物理的特徴及び分類
を含む即ち形態、培養、生物及び生理的特徴を含む微生
物はフジサワによる欧州特許庁公開番時第０１８４１６
２号に記載されている。

一般に゛ツクバマイシンＡ及びＢ”は同化可能な炭素及
び窒素源を含有する水性栄養培地中好ましくは浸漬好気
性条件下（例えば振盪培養、浸浸培養等ンでストレブト
ミセスツクバエンシスＮｏ、９９９：ｌ（ＦＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−９２７）を培養（発酵）することによって産生され
る。水性培地は発酵工程の開始及び終結（集菌）に於て
ｐｏ約７に維持されることか好ましい、　ｐＨかこれよ
り高いと生産物の実質的及び／又は全体の損失となる。

望ましいＰＨは、緩衝液例えばモルフォリノエタンスル
ホン＃（ＭＥＳ）　、モＪレフオリノブロパンスルホン
酸（ＭＯＰＳ）等の使用によって又は本質的に緩衝特性
を有する栄養材料例えば以下に記載される産生培地の選
択によって維持することができる。

栄養培地中好ましい炭素源は炭水化物例えばグルコース
、キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、
デキストリン等である。包含される他の炭素源はマルト
ース、ラムノース、ラフィノース４アラビノース、マン
ノース、サリシン、コハク酸ナトリウム等である。

好ましい窒素源は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、グ
ルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び他の植物性
ミール（一部又は全部脱脂された）、カゼイン加水分解
物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーン浸漬液
、乾燥酵母、麦芽、フェザ−ミール、落花生末、醸造可
溶成分等並びに無機及び有機窒素化合物例えばアンモニ
ウム塩（例えば硝酸アンモニウム。

ｖＩｉ、酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿
素、アミノ酸等である。

炭素及び窒素源は、併用して使用されるのが有利である
が、生育因子のに踏量と無機栄養素のかなりの量を含む
純度の低い材料も使用に適当であるためそれらの純粋な
形で使用される必要はない、所望される場合培地に鉱酸
塩例えば炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナトリ
ウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ
化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コ
バルト塩等を添加することができる。必要な場合特に培
地かひどく発泡するときに、泡止め剤例えば流動パラフ
ィン、脂肪油、植物油、鉱油又はシリコーンを添加する
ことができる。

多酸に“ツクバマイシンＡ及びＢ”を生産する条件に関
して浸漬好気性培養条件が好ましい。少量の生産に対し
てはフラスコ又はビンで振盪又は表面培養が使用される
。更にその上大きなタンクで増殖を実施する場合“ツク
バマイシンＡ及びＢ”の生産過程で生育の遅滞を避ける
ために生産タンクの接種に増殖形の微生物を使用するこ
とか好ましい。従ってまず比較的少是の培地に“斜面（
ｓｌａｎｔ）”で産生された微生物の胞子又は菌糸を接
種し、“種子培地”とも呼ばれる該接種培地を培養する
ことによって増殖形接種物の微生物を産生じ、次に培養
される増殖形接種物を無菌的に大きなタンクに移すこと
か望ましい。接種物か産生される発酵培地はＵツクバマ
イシンＡ及びＢ″の生産に利用される培地と実質的に同
じか又は異なり、一般に接！！前に培地を減菌するため
にオートクレーブにかけられる。培地のｐＨは一般にオ
ートクレープ工程の前に酸又は塩基、好ましくは緩衝液
の形て適当に添加することによって約７．０に調整され
る。

培養混合物の攪拌及び通気は様々な方法で行なうことか
できる。攪拌は、プロペラ又は類似の機械的攪拌装置に
よって、発酵槽を回転又は振盪することによって種々の
ポンプ装置によって又は、培地に無菌空気を通過させる
ことによフて行なうことができる０通気は、発酵混合物
に無菌空気を通過させることによって行なうことができ
る。

発酵を実施するために好ましい培養／増殖培地は次の培
地を包含する。

１　　ＦＫ−５１ セレロース グリセロール コーンスターチ ファーマメジア コーン浸漬液 ポリグリコールｐ−ｚｏ。

培　　ＦＫ−ＰＩ 可溶性デンプン コーン浸漬液 一次乾燥酵母 炭酸カルシウム ポリグリコールＰ−２００ ５゜ １０゜ １０゜ Ｉ　Ｏ。

５゜ ５９／文 ５９／旦 （１／文 ０９／文 ０９／１ １．０ｍｌ／文 ４５゜ 　０６ １　Ｏ。

工　。

２゜ ０９／１ ０２／交 ０９／交 ０２／２ ０ｍ１／Ｊ２ 産生された“ツクバマイシンＡ及びＢ”は−般に他の公
知の生物学的に活性な物質の回収に用いられる常法によ
って培地から回収することかてきる。産生された“ツク
バマイシンＡ及びＢ″物質培養された菌糸及び枦液中に
見られ、従って培養ブイヨンな濾過又は遠心することに
よって得られる菌糸及び枦液から、常法例えば減圧下で
濃縮、凍結乾燥、メタノール等の通常の溶媒で抽出、　
ｐＨ調整、通常の樹脂（例えばアニオン又はカチオン交
換樹脂、非イオン吸着樹脂等）、通常の吸着剤（例えば
活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等
）、結晶化、再結晶等によって分離及び精製することが
できる。好ましい方法は特にメタノールを用いる溶媒抽
出である。

発酵による生産物“ツクバマイシンＡ及びＢ”は、“Ｔ
−細胞増殖検定”で免疫抑制作用が陽性を示しこれに基
づき有用性を有する。

生産物“ツクバマイシンＡ”は次の物理的特性を示す。

１、白色無定形粉末 ２、メタノール溶解性 ３、質量分析で定量した分子量８０５、テトラ−（トリ
メチルシリル）誘導体に対する （麿／ｚ）１０９：１．６５５６に於ける分子イオンと
（■／ｚ）６７３及び４８１に於ける特徴的フラグメン
トイオンと一致する。

生産物“ツクバマイシンＢ”は次の物理的特性を示す。

１、白色無定形粉末 ２、メタノール溶解性 ３、質量分析で定量した分子量８０５、トリ−（トリメ
チルシリル）誘導体に対する （ｍ／ｚ）１０２１．６１６９に於ける分子イオンと（
ｉ／ｚ）６７５及び４８３に於ける特徴的フラグメント
イオンと一致する。

上記で説明した発酵工程で得られた“ツクバマイシンＡ
及びＢ”は常法例えば抽出、沈殿、分別結品、再結晶、
クロマトクラフィー等で分離精製することかできる。

この物質の適当な塩は医薬的に使用し得る塩例えば塩基
性塩即ちアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩等）アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マ
クネシウム塩等）アンモニウム塩、アミン塩（例えばト
リエチルアミン塩、Ｎ−ペンシル−Ｎ−メチルアミン塩
等）及び他の通常の有機塩を包含することができる。

本発明の“ツクバマイシンＡ及びＢ″は薬理作用例えば
免疫抑制作用、抗菌作用を有し、従って心臓、腎臓、肝
臓、骨髄、皮膚等のような器官又は組織の移植拒否反応
２骨髄移植による対宿主移植片疾患、リウマチ様関節炎
、全身性エリテマトーデス、＃１本甲状腺炎、多発性硬
化症、重症筋無力症、タイプＩ糖尿病、葡萄膜長のよう
な自己免疫疾患等の治療及び予防に有用である。

本発明の医薬組成物は有効成分として本発明の“ツクバ
マイシンＡ及びＢ”を外用、腸内又は非経口用に適した
有機又は無機担体又は賦形剤と混和して含有する医薬製
剤の形態で例えば固体、半固体又は液体形態で使用する
ことかできる、有効成分は、例えば通常無毒性の医薬的
に使用し得る担体と錠剤、ベレット、カプセル剤、生薬
、液剤、乳剤、懸濁液剤及び使用に適した他のいかなる
形態にも配合することかできる。使用することができる
担体は水、タルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼ
ラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシ
ウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイダル
シリカ、ジャガイモデンプン、尿素及び固体、半固体又
は液体形態の製剤を製造するための使用に適した他の担
体であり、更に助剤、安定剤、粘度付与剤、着色剤及び
香料を使用することができる。有効な目的化合物は、疾
患の過程又は症状により望ましい効果か十分生じる量て
医薬組成物中に包含される。

この組成物をヒトに適用するには、非経口又は経腸投与
て適用することか好ましい。“ツクバマイシンＡ及びＢ
′の治療上有効な量の投与量は治療される個々の患者の
年令及び症状によって変化するか、１日当り（体重７０
ｋｇの男性を基準として）有効成分的０．０１〜１００
０ｍｇ好ましくは０．１〜５００■ｇ更に好ましくは０
．５〜１００−ｇか一般に疾患治療に投与され１回の平
均服用量的０．５ｍｇ、１１ｇ、５ｍｇ、１０■ｇ、５
０■ｇ、１００■ｇ１２５０ｍｇ及び５００ｍｇが一般
に投与される。

次の実施例は、を発明を具体的に説明するために示され
本発明の範囲及び精神を限定するものとして解釈される
べきではない。

夾息Ａ」 超 ３−バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中のＦＫ−５
ｌ培地４０１に斜面培養液Ｍ−６４９２（Ｓ　、ツタハ
エンシスＮｏ、９９９：ｌ）を接種して種子培養液を生
産した。接種した培地を振盪機２２０ｒｐ■で２９．０
°Ｃに於て７２蒔間温ａした。

ＰＫ−５ｌ培地２５０ｍ１を含有するいくつかの３−バ
ッフル付２文エルレンマイヤーフラスコに得られた培養
液２．５１を接種した。接種した培地を２２０　ｒｐｍ
振盪機で２９．０℃に於て２４時間温鐙した。

次いで得られた培養液７５ｏ１を３００１のステンレス
鋼の攪拌発酵槽中に含まれるＦＫ−３ｌ培Ｊ１！１８０
１に接種した。接種した培地を攪拌。

１２０ｒｐｍエアフロー１６０ｊｌｐｍ及び背圧０．７
ｋｇ／ｃｍ２を用い２９，５°Ｃで２４時間温装した。

４つのヒドロホイルインペラーで攪拌されるＰＫ−ＰＩ
　ｉ？ｉ地１３，０００文を含む１９，０００ｆＬのス
テンレス鋼発酵槽に得られた培養液１３０文を接種した
。発酵は攪拌を１００ｒｐ−エアフロー１０．５ＫＬ／
分及び背圧０．７ｋｇ／ｃｙａ”で２９．５℃に於て１
０４時間行なった。溶存酸素濃度は空気飼料５０％以上
に維持した。

メタノール（６０００文）を全ブイヨン（１２，０００
文）に激しく攪拌しながら添加した。得られた浮遊液を
ディスク遠心機によって固形分を除去した。次いで遠心
分離した水性メタノール抽出液を平行して行なったＤＩ
ＡＩＯＮ　ＩＩＰ−２０（三菱ケミカルス）の２本のカ
ラム（４５ｘ　１８０ｃｍ、各々約ｚｓｓｌに通過させ
た。各カラムをメタノール（１６００交）で溶離し目的
化合物を含む両分をプールして混合リッチカット（１４
００４１）を生成した。リッチカットを真空中で最終容
量８０見に濃縮した。

水（３２０ｆＬ＞を濃縮物に加え次に酢酸エチルで２回
（各２００！；Ｌ）抽出した０次いでプールした酢酸エ
チル抽出液を真空中で濃縮して重油状物質（８文）を生
成した。

濃縮した酢酸エチル抽出物をヘキサン（４１で希釈しヘ
キサン中シリカゲル（６０〜２００メツシユ、Ｗ、Ｒ，
ブレース社）のカラム（３０Ｘ９０ＣＩ、約３５文）で
クロマトグラフィー処理した。

カラムをまずヘキサン（２００Ｍ　）で洗浄し次にヘキ
サン：アセトン（３：１．４００１　）で溶離した。

目的化合物を含む両分をプールし真空中で濃縮して粘稠
な油状Ｔｈ質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＩＩＰ
ＬＣ）により精製を行なった。リッチカットをタイナマ
ックスーＢＯＡ　Ｃ１８カラム（２１，４ｘ　２５０璽
旙、ライニンイシス１ンルメンツ）により５５℃で操作
してクロマトグラフィー処理した。カラムをアセトニト
リル：水（３：２）を用いて９．９ｍｌ／分で溶離した
。溶離は２０５ナノメーターに於けるＵｖ吸光度をモニ
ターした。上述した抽出物の柱入を繰り返している間に
化合物を集めた。目的化合物を含有する両分をプールし
真空中て濃縮し次に同一条件下でクロマトグラフィー処
理を繰り返した。

目的化合物を含有する画分をバーチシ ル−５０ＤＳ３カラム（４，５Ｘ　２５０ｍｍホワット
マン）を用い５６℃で操作して逆相ＨＰＬＣにより分析
し２０５ナノメーターに於ける紫外吸光度をモニターし
た。カラムはアセトニトリル：水（］、　３　：　７　
）を用い１．５ｍｌ／分でイソクラチカルに溶離した。

これらの条件下で“ツクバマイシンＡ′と呼ばれる目的
化合物（１，２７ｇ）は欧州特許庁公開番号第０１８４
１６２号に記載されるフジサワのＦＲ−９００５０６、
ＰＲ−９００５２０及びＦＲ−９００５２３と異なる保
持時間７．３６分を有した。

赫ツクバマイシンＡ″はそのテトラ−（トリメチルシリ
ル）誘導体の高分解能質量分析によって確認した。■／
ｚ　１０９３．６５５６に於て分子イオン（テトラ−（
トリメチルシリル）誘導体Ｃ４４１１ｙＪＯ＋ｔの計算
値１０９３．６５５７）とｇ／ｚ６７３及びｍ／ｚ４８
１に於て特徴的フラグメントイオンか見られた。

全ブイヨン（１２，００［Ｈｌ　）をディスク遠心機で
遠心分離して、培養固形分のｅ縮浮遊液（２０００又）
を生成した。この浮遊液にメタノール（２００１）を激
しく攪拌しながら添加した。この抽出液をディスク遠心
機により固形分を除去し、得られた固形分をメタノール
：水（Ｉ：１．２００１　）で再抽出した。ディスク遠
心機を用いて固形分を除去した後、２つの水性メタノー
ル抽出液をプールし、真空中で溶媒を除去して水性濃縮
液２０００文を生成した。水性濃縮液を酢酸エチルで２
回（各１０００１　）抽出した。プールした＃酸エチル
抽出液を真空中で溶媒を除去して重油状物質（８見）を
生成した。

濃縮酢酸エチル抽出物をヘキサン（４文）で希釈しヘキ
サン中シリカゲル（５０〜２００メツシユ、Ｗ、Ｒ，ブ
レース社）のカラム（３０ｘ　９０Ｃ閣、約３５文）に
よりクロマトグラフィー処理した。カラムをまずヘキサ
ン（２００１で洗浄し、次にヘキサン：アセトン（３：
１．４ｏｏｉ）で溶離した。目的化合物を含む両分をプ
ールし濃縮して粘稠な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製を行なフた。リッチカットをダイナマッ
クス−６０Ａ　Ｃ１８カラム（２１，４Ｘ　２５０■璽
、ライニンイシスッルメンツ）により５５℃で操作して
クロマトグラフィー処理した。カラムをアセトニトリル
：水（３：２）を用い９．９ｖｌ／分て溶離した。溶離
は２０５ナノメーターに於けるｕｖ吸光度をモニターし
た。上述した抽出物を繰り返し注入している間に化合物
を集めた。目的化合物を含有する両分をプールし真空中
で′ｃｉ縮して同一条件下でクロマトクラフィー処理を
繰り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシ ル−５０ＤＳ３カラム（４，６Ｘ　２５０膳■、ホワッ
トマン）を用い５６℃で操作して逆相ＨＰＬＣにより分
析し、２０５ナノメーターに於ける紫外吸光度をモニタ
ーした。カラムをアセトニトリルニ水（１３ニア）を用
い１．５ｓ＋Ｉ／分でインクラチカルに溶離した。これ
らの条件下゛で“ツタバマイシンＡ”と呼ばれる目的化
合物（１，２７ｇ）は欧州特許庁公開番号第０１８４１
６２号に記載されるフシサワのＦＲ−９００５０６、Ｆ
Ｒ−９００５２０及びＰＲ−９００５２３と異なる保持
時間７．３６分を有した。

°°ツクバマイシンＡ″はそのテトラ−（トリメチルシ
リル）誘導体のプロトン及び１３Ｃ核磁気共鳴分光分析
及び高分解能質量分析によって確認した。ｓ／ｚ１０９
３．６５５６に於て分子イオン（テトラ（トリメチルシ
リル）誘導体Ｃ４４Ｈ？１ＮＯ１２の計算値＋０９１６
５５７　）及びｍ／ｚ６７３及びＩＩ／Ｚ４８１に於て
特徴的フラグメントイオンか見られた。

実」１１４ １．越ｌｊＬ斗製 上記ＨＰＬＣによって調製された“ツクバマイシンＡ”
を無水エタノールに溶解した。

２・榎亙 Ｃ５７８１／６マウスの膵臓を無菌条件下で採取し、ｌ
Ｏ％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）で補足した水
冷却ＲＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ、グランドア
イランド、ニューヨーク）で緩やかに解離させた。細胞
を１５０Ｏｒｐｍで８分間遠心分離によって沈降させた
。この沈降物を塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＧ
Ｏ）と　４℃で２分間処理して混入赤血球を除去した。

冷却培地を加え細胞を１５００ｒｐ曹で８分間再び遠心
分離した０次いで細胞浮遊液をナイロンウールカラムで
次の通り分離してＴリンパ球を単離した。洗浄乾燥ナイ
ロンウール約４９を２０１のプラスチック注射器に充填
してナイロンウールカラムを調製した。カラムを２５０
Ｔて３０分間オートクレーブにかけて滅菌した。ナイロ
ンウールカラムを加温（３７’Ｃ）培地で湿らせ、同じ
培地ですすいた。加温培地に再浮遊させた洗？ｆ１１Ｉ
！Ｐ細胞をナイロンクールに徐々に注いた。次いでカラ
ムを３７℃で１時間立てたまま温置した。非付着エリン
バ球を加温培地を含むカラムから溶離し、細胞浮遊液を
上記の通り繰り返した。

精製したＴリンパ球を１０％熱不活化ウシ胎仔血清、　
１００ｄグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、　
　２Ｘ　１０−５Ｍ−メルカプトエタノール及び５０μ
９／１ゲンタマイシンを含むＲＰＭ［１６４０培地から
なる完全培地に２．５　ｘｌＯ’細胞／１で再浮遊させ
た。イオノマイシンを２５０ｒ＋ｇ／■１及びＰＭＡを
１０ｎｇ／ｍｌ加えた。細胞浮遊液を直ちに９６ウエル
平底ミクロ培養プレート（コスタ−）に２００μｆＬ／
ウエルで分配した９次いて試験薬剤を含まない培地であ
る対照及び試験される試料（上述の精製“ツクバマイシ
ンＡ“）の以下に示される種々の希釈液を３つ組のウェ
ルに２０μ交／ウエルで加えた。標準としてＬ−６７９
，９”Ｊ４を使用した０次に培養プレートを５％Ｇｏ、
−９５％空気の湿った雰囲気中で４４時間３７°Ｃで温
置した。■リンパ球の増殖をトリチウム標識チミジンの
取り込みを測定して算定した。４４時間培養した後、細
胞をトリチウム標識チミジン（ＮＥＮ、ケンブリッジ、
マサチューセッツ）　　ｚｐｃｉ／ウェルでパルス標識
した。更に４時間温置した後、多回式試料へ−ベスター
を用いガラスｍｌｎフィルターにより集菌した。ｆ］々
のウェルに対応するフィルターディスクの放射能を標準
液体シンチレーション計数法（βカウンター）によって
測定した。２つ組ウェルの平均計数７分を計算し、結果
は次の通りトリチウム標識チミジン取り込みの阻害％と
して表わした。

種々の濃度に於ける“ツクバマイシンＡ”の阻害％の結
果はその免疫抑制特性を示した。

また“ツクバマイシンＡ″によるＴ−細胞増殖の阻害は
培養の始めにＩｔ−２（組換え体ヒトＩＬ〜２）５０単
位／１を加えることによって逆になフた。

実」１１旦 門 ３−バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中のＰＫ−３
ｔ培地４０１に斜面培養液ＭＡ−６４！１２　　（Ｓ。

ツクバエンシスＮｏ、９９９３）を接種して種子培養液
を生産した。接種した培地を捩研機２２Ｄｒｐｍで２９
．０℃に於て７２時間温温置た。

ＦＫ−３ｌ培地２５０１を含有するいくつかの３−バッ
フル付２文エルレンマイヤーフラスコに得られた培養液
２．５１を接種した。接種した培地をｖｔｍ機２２０ｒ
ｐ層で２ｇ、０℃に於て２４時間温殺した。

次いで得られた培養液７５０１を３００見のステンレス
鋼の攪拌発酵槽中に含まれるＦＫ−５ｌ培地１８０又に
接種した。接種した培地を攪拌１２０ｒｐｍエアフロー
１６０文ｐ會及び背圧０．７ｋｇ／ｃｔｉ２を用い２９
．５℃で２４詩間温置した。

４つのヒドロホイルインペラーて攪拌されるＰＫ−ＰＩ
培地１３，０００文を含む１９．ＯＯＯ！Ｌのステンレ
ス鋼発酵槽に得られた培養液１３０文を接種した０発酵
は攪拌１１００ｒｐエアフロー１０．５ＫＬ／分及び背
圧０．７ｋｇ／ｃｍ２を用い２９．５°Ｃで１０４時間
行なつた。溶存酵素濃度は空気飽和の５０％以上に維持
した。

メタノール（６０００文）を全ブイヨン（１２，Ｏｏ。

２）に激しく攪拌しながら添加した。得られた浮遊液を
ディスク遠心機によって固形分を除去した。次いで遠心
分離した水性メタノール抽出液を平行して行なったＤＩ
＾ＩＯＮ　ＨＰ−２０（三菱ケミカルス）の２木のカラ
ム（４５ｘ　１８０ｃ園、各々約２８５１）に通過させ
た。各カラムをメタノール（１６０（ＨＬ　）て溶離し
、目的化合物を含む両分をプールして混合リッチカット
（１４００Ｍ　）を生成した。リッチカットを真空中で
最終容量８０文に濃縮した。

水（３２０立）を濃縮物に加え次に酢酸エチルて２回（
各２００文）抽出した。次いでプールした酢酸エチル抽
出液を真空中で濃縮して重油状物質（８又）を生成した
。

濃縮した酢酸エチル抽出物をヘキサン （４文）で希訳し、ヘキサン中シリカゲル（６０〜２０
ロメツシユ、Ｗ、Ｒ，ブレース社）のカラムでクロマト
グラフィー処理した。カラムをまずヘキサン（２０１）
で洗浄し、次にヘキサン：アセトン（３：１．４００Ｍ
　）で溶離した。目的化合物を含む両分をプールし、真
空中で濃縮して粘稠な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性躯液体クロマトグラフィー（ＨＰＩ
ＩＩ：）により精製を行なった。リッチカットをダイナ
マックス−６０Ａ　Ｃ１８カラム（２１，４Ｘ　２５０
Ｂ、ライニンイシスツルメンツ）により５５°Ｃで操作
してクロマトグラフィー処理した。カラムをアセトニト
リル：水（３：Ｚ）を用い９．！１ｍｌ／分で溶離した
。溶離は２０５ナノメータに於けるＵＶ吸光度をモニタ
ーした。上述した抽出物の注入を繰り返している間に化
合物を集めた。目的化合物を含有する両分をプールし、
真空中で濃縮し、次に同一条件下でクロマトグラフィー
処理を繰り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシル−５０ＤＳ３カ
ラム（４，６ｘ　２５０冒膳、ホワットマン）を用い、
５６℃で操作して逆相１１ＰＬＣにより分析し、２０５
ナノメーターに於ける紫外吸光度をモニターした。カラ
ムはアセトニトリル：水（１３ニア）を用い１．５ｍｌ
／分でインクラチカルに溶離した。これらの条件下で“
ツクバマイシンＡ”と呼ばれる目的化合物は欧州特許庁
公開番号第０１８４１６２号に記載されるフジサワのト
ド９００５０６、ＦＲ−９００５２０及びＰＲ−９００
５２３と異なる保持時間１０．２４分を有した。

“ツクバマイシンＢ　ＩＴはプロトン及び１３ｃ核磁気
共鳴分光分析及びそのトリ−（トリメチルシリル）誘導
体の高分解能質量分析によって確認した。ｍ／ｚ１０２
１．６１６９に於て分子イオン（トリ−（トリメチルシ
リル）誘導体Ｃ４４８？ＩＮＯ＋２の計算値１０２１．
６１６２）とｍ／ｚ６７５及び＠／１４８３に於て特徴
的フラグメントイオンか見られた。

全ブイヨン（１２，０００ｆＬ）をディスク遠心機て遠
心分離して培養固形分の濃縮浮遊液（２０００文）を生
成した。この浮遊液にメタノール（２０００５Ｌ）を激
しく攪拌しながら添加した。この抽出液をディスク遠心
機により固形分を除去し得られた固形分をメタノール：
水（ｌ：１．２０００文）で再抽出した。ディスク遠心
機を用いて固形分を除去した後、　２つの水性メタノー
ル抽出液をプールし、真空中で溶媒を除去して、水性濃
縮液２０００文を生成した。水性濃縮液を酢酸エチルで
２回（各１０００４１　）抽出した。プールした酢酸エ
チル抽出液を真空中で溶媒を除去して重油状物質（８文
）を生成した。

濃縮酢酸エチル抽出物をヘキサン（４文）で希釈し、ヘ
キサン中シリカゲル（６０〜２００メツシユ、Ｗ、Ｒ，
ブレース社）のカラム（３０ｘ　９０Ｃ■、約３５文）
によりクロマトグラフィー処理した。カラムをまずヘキ
サン（２０１）で洗浄し、次にヘキサン：アセトン（３
：１．４００１）で溶離した。目的化合物を含む両分を
プールし濃縮して粘稠な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製を行なった。リッチカットをダイナマッ
クス−６０Ａ　Ｃ１８カラム（２１，４Ｘ　２５０■璽
、ライニンイシス１ンルメンツ）により５５℃で操作し
てクロマトグラフィー処理した。カラムをアセトニトリ
ル：水（：ｌ：２）を用い９．９＊Ｉ／分で溶離した。

溶離は２０５ナノメーターに於けるＵ■吸光度をモニタ
ーした。上述した抽出物を繰り返し注入している間に化
合物を集めた。目的化合物を含有する両分をプールし真
空中で濃縮して同一条件下でクロマトグラフィー処理を
繰り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシ ル−５０ＤＳ３カラム（４，６Ｘ　２５０厘箇１ホワッ
トマン）を用い５６℃で操作して逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃによ
り分析し、　２０５ナノメーターに於ける紫外吸光度を
モニターした。カラムをアセトニトリル：水（１３ニア
）を用い１．５履１／分でイソクラチカルに溶離した。

これらの条件で“ツクバマイシンＢ”と呼ばれる目的化
合物は、欧州特許庁公開番号０１８４１６２号に記載さ
れ！７ジサワノＦＲ−９００５０６、ＦＲ−９００５２
０及びＦＲ−９００５２：ｌと異なる保持時間１０．２
４分を有した。

−ツクバマイシンＢ”はそのトリ−（トリメチルシリル
）誘導体の高分解能質量分析によって確認した。ｍ／ｚ
ｉ０２１．６１６９に於て分子イオン（トリ−（トリメ
チルシリル）誘導体Ｃ４４１１？ｌＮ０１２の計算値１
０２１．６１６２）及びｍ／ｚ６７ｓ及びｍ／ｚ４８３
に於て特徴的フラグメントイオンか見られた。

１、ス刀ヱＬ４１ 上記ＨＰ１．Ｃによって調製された“ツクバマイシンＢ
″を無水エタノールに溶解した。

２・雄亙 Ｃ５７Ｂ１／６マウスの膵臓を無菌条件下で採取し、１
０％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＧＯ）で補足した水
冷却ＲＰＭ１１６４０培地（ＧＩＢＧＯ、グランドアイ
ランド、ニューヨーク）で緩やかに解離させた。細胞を
１５００ｒｐｍで８分間遠心分離によって沈降させた。

この沈降物を塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＧＯ
）と　４℃で２分間処理して混入赤血球を除去した。冷
却培地を加え、細胞を１５００ｒｐ■で８分間遠心分離
した９次いで細胞浮遊液をナイロンウールカラムで次の
通り分離して丁リンパ球を単離した。洗浄乾燥ナイロン
ウール約４９を２０１１のプラスチック注射器に充填し
てナイロンウールカラムを調製した６カラムを２５０”
Ｆで３０分間オートクレーブにかけて滅菌した。ナイロ
ンウールカラムを加温（３７°Ｃ）培地で湿らせ同じ培
地ですすいた。加温培地に再浮遊させた洗浄牌細胞をナ
イロンウールに徐々に注いだ０次いでカラムを３７℃で
１時間立てたまま温ｔした。非村若Ｔリンパ球を加温培
地を含むカラムから溶離し、細胞浮遊液を上記の通り繰
り返した。

精製したＴリンパ球をｌＯ％熱不活化ウシ胎仔血清、　
１００ｍＭグルタミン、　１ｍＭピルビン酸ナトリウム
、　　２Ｘ　１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール及び
ＳＯＰ！？／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ　１６
４０培地からなる完全培地に２．５ｘ　１０’細胞／１
で再浮遊させた。イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｍｌ及
びＰＭＡをｌＯ口ｇ／ｍｌ加えた。細胞浮遊液を直ちに
９６ウエル平底ミクロ培養プレート（コスタ−）にＺＯ
Ｏμ交／ウェルで分配した。次いで試験薬剤を含まない
培地である対照及び試験される試料（上述の“ツクバマ
イシンＢ″）の以下に示される種々の希釈液を３つ組の
ウェルに２０μ見／ウエルで加えた。標準としてＰＫ−
５０５を使用した。次に培養プレートを５％ＣＯ，−９
５％空気の湿った雰囲気中で４４時間３７°Ｃで温訝し
た。下りンバ球の増殖をトリチウム標識チミジンの取り
込みを測定して算定した。４４時間培養した後、細胞を
トリチウム標識チミジン（ＮＥＮ、ケンブリッジ、マサ
チューセッツ）２μＣｊ／ウエルでパルス標識した。更
に４時間装置した後、多回式試料ハーベスタ−を用い、
ガラスｍ維フィルターにより集菌した０個々のウェルに
対応するフィルターディスクの放射能を標準液体シンチ
レーション計数法（βカウンター）によって測定した。

２つ組ウェルの平均計数７分を計算し、結果は次の通り
トリチウム標識チミジン取り込みの阻害％として表わし
た。

種々の濃度に於ける“ツクバマイシンＢ”の阻害％の結
果は、その免疫抑制特性を示した。

また“ツクバマイシンＢ″によるＴ−細胞増殖の阻害は
培養の始めにＩＬ−２（組換え体ヒトＩＬ−２）　５０
単位／■１を加えることによって逆になった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＰＫ−５０６のＣ−９ジヒドロ類似体である
゛′ツクパマイシンＡ”に対応した分子構造を示も第２
図は、ＣＤＣえ、中３００ＭＨ！で測定した“ツクバマ
イシンＡ　”のプロトンＮＭＲスペクトルである。 第３図は、パツクバマイシンＢ”の対応する構造を示す
。 第４図は、ＣＤｆＪ、中３０ＯＭＨ，で測定した゛ツク
バマイシンＢ　”のプロトン核磁気共鳴スペクトルある
。 第５図は、ｃｏｃｑ、中７５１Ｈ，で測定した゛ツクバ
マイシンＢ’の１３Ｇ　　核磁気共鳴スペクトルである
。 ＦｆＧ、　１ ＦＩＧ、３ ０７０６７　　ニュージャーシイ。 ロングフェロ−、ドライヴ　７４ コロニア

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ−細胞増殖検定によりＴ−細胞活性化の阻害が陽
   性を示し、テトラ−（トリメチルシリル）誘導体として
   高分解能質量スペクトル分子イオン（ｍ／ｚ）１０９３
   ．６５５６とｍ／ｚ６７３及び４８１に於て特徴的フラ
   グメントイオンを示す免疫抑制剤“ツクバマイシンＡ”
   。 ２、医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は賦形
   剤と共に“ツクバマイシンＡ”の治療上有効な量を含有
   する医薬組成物。 ３、“ツクバマイシンＡ”の治療上有効な量をヒト宿主
   に投与することを特徴とする移植拒否反応を防止するた
   めに該宿主を治療するか又は自己免疫疾患又は感染症を
   治療する使用方法。 ４、窒素栄養源を含む炭水化物水性培地中で浸漬好気性
   条件下で微生物ストレプトミセスツクバエンシスＮｏ．
   ９９９３（ＦＥＲＭＢＰ−９２７）を発酵させる工程を
   包含し、該条件がｐＨ約７で行なわれ、“ツクバマイシ
   ンＢ”を回収するＴ−細胞増殖検定によりＴ−細胞活性
   化の阻害が陽性を示しトリ−（トリメチルシリル）誘導
   体と して高分解能質量スペクトル分子イオン （ｍ／ｚ）１０２１．６１６９とｍ／ｚ６７５及び４８
   ３に於て特徴的フラグメントイオンを示すＦＫ−５０６
   のＣ−２１プロピル類似体である免疫抑制剤“ツクバマ
   イシンＢ”の製造方法。