JPH06501026A - ストレプトミセス・ブレジェンシス由来の新規の免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ストレプトミセス・プレジエンシス由来の新規の免疫抑制剤発明の背景 本発明は、新規の大原状ラクトン免疫抑制剤、その製造方法およびヒト宿主にお ける自己免疫疾患の治療および／または臓器移植拒絶反応の防止に関するその使 用に関する。この用途は、１９９１年４月１１日最先出願の米国特許出願第６８ ３．６３９号明細書の継続出願である。優先権はこれによってその出願に対して 主張される。

１９８３年に、米国食品医薬８局は、臓器移植手術の分野に大変革をもたらす抗 拒絶反応薬であるシクロスポリンを認可した。該薬剤は、生体の免疫系が本来の 保護物質のその膨大な集積を動員して移植組織の異種タンパク質を拒絶するのを 阻害することによって作用する。シクロスポリンは移植拒絶反応と戦うのに有効 であるが、それは、多くの場合極めて苛酷でありうる腎不全、肝臓損傷および潰 瘍を引起こす欠点を有する。より新しい副作用の少ないより安全な薬剤が絶えず 探求されている。藤沢薬品株式会社（Ｆｕｊ　ｉ　ｓ　ａｗａＰｈａｒｍａｃｅ ｕｔｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｌｔｄ、）の欧州特許公開第０１８４１６２号明細書は 、マクロライド免疫抑制剤ＦＫ−５０６およびＦＫ−５２０を記載している。後 者はＳ、ハイグロスコピクス亜種ヤクシマエンシス（ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ ｓ　５ｕｂｓｐ、ｙａｋｕｓｈｉｍａｅｎｓｉｓ）７２３８号によって製造され る。他の免疫抑制剤は、フィスコンス（Ｆｉｓｃｏｎｓ）ｐｌｃ、メルク・アン ド・カンパニー・インコーポレーテソド（Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、Ｉｎｃ、）お よびサンドラ（Ｓ　ａ　ｎ　ｄ　ｏ　ｚ）それぞれの欧州特許出願公開第０３２ ３０４２号明細書、第０３２３８６５号明細書およびＮＯ３５６３９９号明細書 に記載されている。

発明の慶要 本発明は、式 示したようにあると予想される。

Ｈｕａｎｇ　５ｕｂｓｐ、ｎｏｖ、）を、同化しつる炭素源および同化しうる窒 素源を含む水性栄養培地中で発酵させ、該発酵は約４．　０〜約８．　０のｐ） （で行なうのが好ましく、そして式１の化合物を該培地から、好ましくは約４． 　０〜約８．０のｐＨで抽出することを含む上記の方法に関する。

更に、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒト）において自己免疫疾患（例えば、慢 性関節リウマチ）を治療しまたは臓器移植拒絶反応を防止するのに有効な量の式 Ｉの化合物を含む薬剤組成物に関する。

本発明は、更に、移植拒絶反応を防止するために哺乳動物（例えば、ヒト）を処 置しまたは哺乳動物（例えば、ヒト）における自己免疫疾患（例えば、慢性関節 リウマチ）を治療する方法であって、該哺乳動物に対して治療的有効量の式Ｉの 化合物を投与することを含む上記の方法に関する。

最後に、本発明は、ストレプトミセス・ブレジエンシス亜種ブルチェリムス・ワ ング亜種新覆であるＡＴＣＣ５５１５０の特徴を有する生物学的に純粋な培養物 およびＡＴＣＣ５５１５０自体並びに、凍結乾燥状態の何等かのこのような培養 物を含む、式Ｉの化合物を生産することができる前述のいずれかの突然変異体お よび形質転換体に関する。このような培養物は、同化しつる炭素源および窒素源 を含む水性栄養培地中での発酵によって回収しつる量の式Ｉの化合物を生産する ことができる。

ダ面の説明 図１は、式Ｉを有する化合物であるＣ９−デスオキソ−ＦＫ−５２０の発明の詳 細な説明 概して、弐■を有する化合物は、式■の化合物を生産する細菌の菌株を、同化し つる炭素および窒素源を含む水性栄養培地中において、好ましくは、液内好気性 条件下（例えば、振とう培養、液内培養等）で培養することによって生産するこ とができる。水性培地は、好ましくは、発酵工程の間中的４．　０〜約８．　０ のｐＨで保持される。更に高いｐＨは、生成物の損失をもたらすことがある。望 ましいｐＨは適当な緩衝剤の使用によって保持することができる。

式Ｉの化合物を生産するのに好ましい培養物を、ストレプトミセス・ブレジエン シス亜種ブルチェリムスーワング亜種新種と称し、アメリカン・タイプ・カルチ ャー−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ　１ ｅｃｔｉｏｎ）、ｏ−ｔクビル、メリーランド州に受託番号ＡＴＣＣ５５１５０ として寄託した。

この新規の培養物は、日本の山口県三隣町で採取された土壌試料由来であって、 ファイザー・インコーホレーテッド（Ｐｆｉｚｅｒ　Ｉｎｃ、）の培養コレクシ ョンにおいてＮ９２７−１０１と同定された。その単一コロニー単離物をＮ９２ ７−１０１−８Ｃ５０と同定する。その説明および分類はり、　Ｈ，ワンプ（Ｈ ｕａｎｇ）博士によって提供された。

培養物は、放線菌目（Ａｃｔｊｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）の細い菌糸、非フラグ メント化基質菌糸体、および胞子鎖を上に生じている気中菌糸を生じることが分 った。全細胞分析の結果は、それらがストレプトミセス属に属することを更に示 している。

培養物Ｎ９２７−１０１および培養物Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０をそれぞわ、斜 面からＡＴＣＣ＃１７２ブイヨン中に植え且つ振とう機上において２８℃で４日 間増殖させた。次に、それを２０分間遠心分離し、滅菌水で３回洗浄し、そして 放線菌目のメンバーの同定用に一般的に用いられる培地に植えた。

培養物を２８℃でインキュベートし、その結果を覆々の時間に読み取ったが、最 も一般的には１４日目に得られた。色は一般的な専門用語で記載されたが、正確 な色はＣｏ１ｏｒ　Ｈａｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｕａｌ、第４版からの色標との比較 によって決定された。全細胞アミノ酸および糖分析の方法は、Ｂ、ベラカー（Ｂ ｅａｋｅｒ）　ら、Ａｐ　１．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、１２．　４２１〜４２３ （１９６４）；およびＭ、Ｐ、レチェバリアー（Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ）、Ｊ 。

Ｌａｂ、ＣＩ　ｉｎ、Ｍｅｄ、、７１，９３４〜９４４　（１９６８）に記載さ れたものである。比較目的のために、ストレプトミセス・ツクバエンシス（ｔ　 ５ｕｋｕｂａｅｎｓ　ｉ　５）ＢＰ−９２７、Ｓ、ハイグロスコピクス亜種ヤク シマエンシスＢＰ−９２８、Ｓ、　ニグレセンス（Ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ）ＡＴ ＣＣ２３９４１、Ｓ、プレジエンシスＮＲＲＬ　１２５６７およびＳ、ブレジエ ンシス亜種ジャポニクス（ｊ　ａｐｏｎｊ　ｃｕｓ）Ｎ６１７−２９の菌種を用 いた。

培養物の特性表示に用いた確認培地およびそれらの組成基準は下記の通りである 。

１、トリプトン・酵母エキスブイヨン（Ｔｒｙｐｔｏｎ−Ｙｅａｓ　ｔＥｘｔｒ ａｃｔ　Ｂｒｏｔｈ）−（ＩＳＰ＃１培地、ディフコ（Ｄｆｆｃｏ））。

２、　酵母エキス・麦芽エキス寒天（Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ−ＭａｌｔＥ ｘｔｒａｃｔ　Ａｇａｒ）−（ＩＳＰ＃２培地、ディフコ）。

３、　オートミール寒天（Ｏａｔｍｅａｌ　Ａｇａｒ）−（ＩＳＰ＃３培地、デ ィフコ）。

４、　無機塩類・デンプン寒天（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　５ａｌｔｓ−３ｔａｒｃ ｈ　Ａｇａｒ）−（ＩＳＰ＃４培地、ディフコ）。

５、　グリセロール・アスパラギン寒天（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ−Ａｓｐａｒａｇｉ ｎｅ　Ａｇａｒ）−（ＩＳＰ＄５培地、ディフコ）。

６、　ペプトン・酵母エキス鉄寒天（Ｐｅｐｔｏｎｅ−ＹｅａｓｔＥｘｔｒａｃ ｔ　Ｉｒｏｎ　Ａｇａｒ）−（ＩＳＰ＃６培地、ディフコ）。

７、ツザベク・スクロース寒天（Ｃｚａｐｅｃ−Ｓｕｃｒｏｓｅ　Ａｇａｒ）− Ｓ、　Ａ、　’７クスマン（Ｗａｋｓｍａｎ）　、ＴｈｅＡｃｔｉｎｏｍ　ｃｅ ｔｅｓ、２巻、培地番号１，３２８頁（１９６１）。

８、　グルコース・アスパラギン寒天（Ｇｌｕｃｏｓｅ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ 　Ａｇａｒ）−同書中、培地番号２，３２８頁。

９、　ベネット寒天（Ｂｅｎｎｅｔｔ’　ｓ　Ａｇａｒ）−同書中、培地番号３ ０．３３１頁。

１０、エマージン寒天（Ｅｍｅｒｓｏｎ’　ｓ　Ａｇａｒ）−同書中、培地番号 ２８．３３１頁。

１１、栄養寒天（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ）−同書中、培地番号１４，３３ ０頁。

１２、ゴートンおよびスミスのチロシン寒天（Ｇｏｒｄｏｎ　ａｎｄＳｍ７ｔｈ ’　ｓ　Ｔｙｒｏｓｊｎｅ　Ａｇａｒ）−Ｒ，Ｅ、ゴートンおよびＭ。

Ｍ、スミス、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、旦９，１４７〜１５０　（１９５５） 。

１３、カゼイン寒天（Ｃａｓｅｉｎ　Ａｇａｒ）−同書中。

１４、リンゴ酸カルシウム寒天（Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｍａｌａｔｅ　Ａｇａｒ）１ ５、ゼラチン（Ｇｅｌａｔｉｎ）−Ｒ，Ｅ、ゴートンおよびＪ、Ｍ、ミーム（Ｍ ｉｈｍ）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ、、ヱ旦、１５〜２７　（１９５７）。

１６、デンプン（Ｓｔａｒｃｈ）−同書中。

１７、有機硝酸塩ブイヨン（Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｎｆｔｒａｔｅ　Ｂｒｏｔｈ）− 同書中。

１８、デキストロース硝酸塩ブイヨン（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ　Ｎ１ｔｒａｔｅＢｒ ｏｔｈ）−８，Ａ、ワクスマスエｈｅ　Ａｃｔｆｎｏｍ　ｃｅｔｅｓ、２巻、培 地番号１，３２８頁（１９６１）、スクロース３０ｇの代わりにデキストロース ３ｇを代用し且つ寒天を省略した。

１９、バレイショ・ニンジン寒天（Ｐｏｔａｔｏ　Ｃａｒｒｏｔ　ａｇａｒ）− Ｍ、Ｐ、レチェバリアー、Ｊ、Ｌａｂ、ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｅｄ、。

ヱ１．９３４〜９４４　（１９６８）であるが、バレイショ３０ｇ、ニンジン２ ゜５ｇおよび寒天２０ｇのみを使用。

２０．２％水道水寒天（Ｔａｐ　Ｗａｔｅｒ　Ａｇａｒ）Ｃ２１、スキムミルク （Ｓｋｉｍ　Ｍｉ　１ｋ）−ディフコ。

２２、セルロース利用− （ａ）　Ｈ，Ｌ、ジエンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、Ｐｒｏｃ、Ｉｊｎｎ。

Ｓｏｃ、Ｎ、Ｓ、Ｗ、、５５，２３１〜２４８　（１９３０）（ｂ）Ｍ、レビン （Ｌ　ｅ　ｖ　ｉ　ｎ）およびＩ（、Ｗ、ジエンライン（Ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎ ）、Ａ　Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣｕｌｔｕｒｅＭｅ　ｄ　ｉ　ａ、培 地番号２５１１　（１９３０）。

２３、炭水化物利用−（Ｉ　ＳＰ＃９培地、ディフコ）。

２４、温度範囲−ＡＴＣＣＭｅｄｉａ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第１１［’ｌＯ頁（ １９８４）のＡＴＣＣ１７２培地。

培養物Ｎ９２７−１０１よりも高力価の式Ｉの化合物を生産した培養物Ｎ９２７ −１０１ＳＣ５０の培養特性は以下の通りである。

酵母エキス・麦芽エキス寒天−増殖良好；白色、淡灰色、淡ピンクグレー〜ピン クグレーに無彩色系列３ｄｃ、５ｃｄ、５ｆｅ）；隆起；平滑、粒状〜しわ；気 中菌糸は表面と同じ；裏面帯黄色〜暗褐色（２ｉｃ、４ｎｉ、４１４）；可溶性 色素なし。

オートミール寒天−増殖中程度〜良好；白色、淡灰色〜灰色に無彩色系列３ｄＣ −３ｆｅ）；僅かに隆起、平滑〜粒状、気中菌糸は表面と同じ；裏面灰色〜ピン クグレー伍無彩色系列３ｆｅ、５ｆｅ、７ｉｈ）；可溶性色素ピンクグレー便無 彩色系列５ｄｃ）。

無機塩類・デンプン寒天−増殖中程度〜良好；白色、淡灰色、灰色〜ピンクグレ ー伍無彩色系列３ｄｃ、３ｆｅ、５ｆｅ）；隆起、平滑〜しわ、気中菌糸は表面 と同じ；裏面帯紫黒装置無彩色系列７ｍ１）；可溶性色素帯黄褐色〜ピンク（３ ｇｃ、６ｃａ）。

グリセロール・アスパラギン寒天−増殖不十分〜中程度；白色、クリーム色、淡 灰色〜灰色（２ｃ　ａ、近年彩色系列３　ｄ　ｃｓ　３　ｆ　ｅ）　ｒ孤立した コロニーとして見える、薄い〜僅かに隆起、平滑〜粒状；気中菌糸白色、淡灰色 〜灰色；裏面りリーム色〜帯黄色（２ｃａ、２ｎｃ、２ｐｅ）；可溶性色素なし 。

ツザペク・スクロース寒天−増殖不十分〜中程度；淡灰色〜灰色（近年彩色系列 ３ｄｃ、３ｆｅ、５ｉｈ）；薄い〜僅かに隆起、平滑〜粒状、気中菌糸は表面と 同じ；裏面無色、淡灰色〜灰色（近年彩色系列３ｄｃ、３ｆｅ）；可溶性色素な し。

グルコース・アスパラギン寒天−増殖中程度；黄色、灰色〜ピンクグレー（２ｉ ｃ１近無彩色系列３　ｆ　ｅｓ　７　ｉｂ）　；孤立したコロニーとして見える ；平滑、しわ〜粒状；気中菌糸灰色〜グレーピンク：裏面ピンクグレー（近年彩 色系列７１ｈ）：可溶性色素なし〜淡ピンク（４ｃ　ａ）。

ゴートンおよびスミスのチロシン寒天−増殖中程度、褐色（４１ｅ）；僅かに隆 起、平滑〜僅かに粒状；気中菌糸散在、白色〜淡灰色（近年彩色系列３ｄｃ）； 裏面褐色（３ｉｃ、４１ｃ）；可溶性色素帯黄褐色（３ｎ、ｃ）。

カゼイン寒天−増殖良好；白色、帯灰黄色〜ラベンダー（２ｇｃ、４ｇｅ）；隆 起、平滑〜しわ、気中菌糸白色；裏面帯黄色〜ラベンダー（２ｇ　ｍｓ　２　ｉ ｃｓ　４ｇｅ）；可溶性色素帯黄褐色（３１ｃ）。

フグレール暗ピンクグレーに無彩色系列７ｊｈ、７ｍ１）；可溶性色素帯黄色Ｉ 　０％　５　ｆ　ｅ）　＋孤立したコロニーとして見える、中程度の隆起、平滑 〜しわ；気中菌糸は表面と同じ；裏面帯黄色〜褐色（２ｇａ、２ｉｃ、４ｉｅ） ；可溶性色素なし。

気中菌糸は表面と同じ；裏面は表面と同じ；可溶性色素なし。

無彩色系列３ｄｃ、３ｆｅ）；可溶性色素なし。

褐色〜暗褐色（４ｉ　ｅ、４ｐｉｓ　４ｎｔ）；可溶性色素なし。

は表面と同じ；裏面褐色〜暗褐色（４１ｇ、４１　ｉ）；可溶性色素帯黄色（２ １Ｃ）。

形態学的性質一形態学的観察は、１５日間のインキュベーション後にオートミー ル上で行なった。胞子環は無彩色系列；小直径（３〜４μｍ）、胞子鎖当り３〜 ８ターンの、きつく巻かれているか若しくは僅かに開いているかまたは不ａすな 塊に巻かれている部分らせんの胞子鎖は、胞子鎖当り胞子１０〜５０個の吸湿性 塊に凝集することができる；単軸分岐の担胞子体；短ロッド状〜ロッド状の胞子 、時々球状、卵形〜長円形、直線であるが時々僅かに曲線、しばしば両末端が互 いに平行でない、直径０．　９〜１．　８ＸＯ，８〜１．　１μｍまたは０．９ 〜１．２μｍ；電子顕鏡法の走査によって示されるように、しわのある表面を有 する平滑〜小隆起。

生化学的性質−メラニン非生産：硫化水素生産；ゼラチン液化；デンプン加水分 解；硝酸塩を亜硝酸塩に還元しない：良好な増殖であるが双方のセルロースブイ ヨンで分解しない；透明であるが乳汁での凝固なし：カゼモレ消化陽性；チロシ ン消化陽性；リンゴ酸カルシウム消化陰性。炭水化物利用ニゲルコース、フルク トース、イノシトール、マンニトール、ラフィノース、スクロースおよびキシロ ースを利用；アラビノースおよびラムノースを利用しない。

中程度の増殖　優れた増殖　良好な増殖　増殖しない細胞壁分析−全細胞氷解物 はＬＬ−ジアミノピメリン酸およびガラクトースを含んだ。

培養物Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０は、塊の灰色胞子、陰性のメラニン反応、らせ ん胞子鎖および平滑〜小隆起の胞子を特徴とする。全細胞氷解物は、ＬＬ−ジア ミノピメリン酸およびガラクトースの存在を示す。グルコース、フルクトース、 イノシトール、マンニトール、ラフィノース、スクロースおよびキシロースを利 用したが：アラビノースおよびラムノースを利用しなかった。したがって、該培 養はストレプトミセス属に属する。

親培養Ｎ９２７−１０１は、培養特性の僅かな相違を除く生化学的性質および温 度範囲の全てにおいて培養物Ｎ−９２７−１０１５Ｃ５０に似ている。酵母エキ ス・麦芽エキス寒天上で、培養物Ｎ９２７−１０１は黄色〜暗褐色よりもむしろ 暗紫色のコロニー裏面と、可溶性色素なしよりもむしろ紫色の可溶性色素を生物 である培養物Ｎ９２７−４０１ＳＣ５０は培養物Ｎ９２７−１０１と同一であロ スコピクス亜種ヤクシマエンシスＢＰ−９２８（日本のファーメンテ−ジョンぞ れ褐色およびグレーピンクであったが、Ｓ、）−イグロスコピクス亜種ヤクシマ （１９８９））およびＳ、ニゲルセンス（スベシュニコワ（Ｓｖｅｓｈｎｉｋｏ ｖａ））ブライダム（Ｐｒｉｄｈａｍ）ら、ＡＴＣＣ２３９４１（シャーリング （Ｓｈｉｒｌｉｎｇ）、Ｅ、Ｂ、およびり、ゴツトリーブ（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ） 、Ｉｎｔ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１８゜２７９〜３ ９６　（１９６８））によく似ている。これらの３種類の培養物を比較のために 増殖させた。

培養物Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０とＳ、ニゲレセンスとは、前者が後者とは異な って硫化水素を生じ且つセルロースブイヨン上で更に十分な増殖を示したことを 除く大部分の生化学的性質において似ている。Ｓ、ニゲレセンスは、培養物Ｎ９ ２７−１０１ＳＣ５０とは異なり、明瞭な可溶性色素も、コロニー裏面の明瞭な 色素も示さなかった。コロニー裏面の色は黄色、黄灰色および灰色〜時々黒色で あった。

培養物Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０は、硫化水素を生じるその能力を除くほとんど 全ての生化学的性質においてＳ、ブレジエンシス亜種ジャポニクスと似ている。

概して、Ｓ、ブレジエンシス亜種ジャポニクスは明瞭な可溶性色素を生じなかっ た。そのコロニー裏面は黄色、灰褐色および灰黄褐色から暗褐色まで変化した。

培養物Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０は、硫化水素を生じるその能力およびセルロー スブイヨン中での更に十分な増殖を除いて、Ｓ、プレジエンシスと同様の生化学 的性質を有する。後者のコロニー裏面は、グルコース・アスパラギン寒天、ベネ ットの寒天およびデンプン寒天上でそれぞれ淡桃色、帯赤桃色および帯赤色であ ったが；これらの３種類の培地上の前者のコロニー裏面はピンフグレール褐色で あった。酵母エキス・麦芽エキス寒天、無機塩類・デンプン寒天およびカゼイン 寒天上の前者のコロニー裏面は紫色であったが；後者のコロニー裏面はそれぞれ 、黄褐色、淡灰色〜褐色および淡帯黄色であった。培養物Ｎ９２７−１０１３Ｃ ５０は、オートミール寒天上でピンクグレーであるが淡黄褐色ではない可溶性色 素を生じ、そして無機塩類・デンプン寒天上で黄褐色〜桃色であるがクリーム色 〜黄褐色ではない可溶性色素を生じた。

上記の結果に基づいて、培養物Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０はＳ、プレジエンシス の新規の亜種を表わし且つストレプトミセス・ブレジエンシス亜種プルチェリム ス・ワング亜種新種と称すると結論される。亜種の形容辞（ラテン語形容詞、プ ルチェリムス、最も美しい）は、ある種の固体培地上およびＡＴＣＣ１７２ブイ ヨン中で生じた紫色の色素の美しさを言及している。それはアメリカン・タイプ ・カルチャーやコレクションに受託番号５５１５０として寄託された。

星よ Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０と、Ｓ、ツクバエンシスおよび式Ｉの化合物を製造す るのに用いられたストレプトミセス属培養物（例えば、Ｎ９２７−１０１または Ｎ９２７−１０１ＳＣ５０）は、好ましくは、炭素源、窒素源、微量元素、例え ば鉄、コバルト、銅、亜鉛等を含む１種類またはそれ以上の無機塩および１種類 またはそれ以上の緩衝剤から成る培地中において液内条件下で撹拌および通気し ながら約り０℃〜約４０℃、更に好ましくは、約２４℃〜約３６℃の温度で増殖 させる。化合物は、有機溶媒（例えば、ｎ−ブタノール、メチルイソブチルケト ン、酢酸エチルまたはクロロホルム）を、好ましくは約４゜０〜約８．０のｐＨ で用いて全ブイヨンを抽出することによって回収することができる。或いは、増 殖が完了した後に、菌糸体を分離し且つ有機溶媒（例えば、アセトンまたはメタ ノール）で前記のように抽出することができ、そして濾液は捨てる。溶媒を濃縮 して薄いシロップにし、有機溶媒（例えば、ヘプタン）で摩砕した後、クロマト グラフィーによって分離して（例えば、シリカゲル上）純粋な化合物を得る。

栄養培地中の好ましい炭素源は、炭水化物、例えば、グルコース、キシロース、 ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキストリン、マルトース、ラムノース 、ラフィノース、アラビノース、マンノースおよびサリシンである。含まれるこ とができる他の源はトウモロコシ浸漬液、穀物可溶性物、魚粉および綿実ミール である。

好ましい窒素源は、酵母エキス、肉エキス、魚粉ペプトン、グルテンミール、綿 実ミール、大豆ミールおよび他の植物ミール（部分的または完全に脱脂の）、カ ゼイン氷解物、酵母氷解物、トウモロコシ浸漬液、乾燥酵母、小麦胚芽、フェザ −ミール、ビーナツツ粉末、蒸留可溶性物並びに無機および有機窒素化合物、例 えば、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸 アンモニウム等）、尿素およびアミノ酸（例えば、カザミノ釦である。

好ましい緩衝剤は、炭酸カルシウムまたはリン酸カルシウムである。他の適当な 緩衝剤としては、モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）およびモルホリノプロ パンスルホン酸（ＭＰＳ）がある。緩衝性を本質的に有する種々の栄養材料を用 いることができる。

炭素および窒素源は組合わせで用いるのが好都合であるが、それらの純粋な状態 で用いる必要はない。あまり純粋でない材料は、微量の成長因子および多量の無 機栄養素を含み、用いるのに更に適当である。望まれる場合、炭酸ナトリウムま たは炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウム、塩化ナトリウム または塩化カリウム、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウム、マグネシウム塩 、銅塩、鉄塩、亜鉛塩、コバルト塩等のような無機塩を培地に対して加えること ができる。必要ならば、特に培地が発泡する場合、脱泡剤、例えば、流動パラフ ィン、脂肪油、植物油、鉱油またはシリコーンを加えることができる。

液内好気培養条件は、式■の化合物を多量に製造するのに好ましい。少量の式■ の化合物を製造するには、フラスコまたは瓶での振とう培養または表面培養を用 いる。発酵を大型タンク中で行なう場合、式Ｉの化合物の生産過程における増殖 遅滞を避けるために、生産用タンクの接種用には増殖性状態の微生物を用いるの が好ましい。したがって、最初に、「斜面」で生じた微生物の菌糸体の胞子を含 む比較的少量の培地を接種し、そして「種培地」とも称する該接種培地を培養す ることによって微生物の増殖性接種材料を製造した後、その培養された増殖性接 種材料を無菌的に大型タンクに移すことが望ましい。増殖性接種材料を製造する 発酵培地は、式■の化合物の製造用に用いた培地と実質的に同じであってよいし または異なってよく、概して、接種前に培地をオートクレーブ滅菌する。培地の ｐＨは、概して、オートクレーブ処理工程の前に酸または塩基を、好ましくは緩 衝液の形で適当に加えることによって８．０未満に調整される。

培養混合物の撹拌および通気は様々な方法によって達成することができる。撹拌 は、プロペラ若しくは類似の機械的撹拌装置によって、各種ポンプ装置による発 酵槽の回転若しくは振とうによってまたは滅菌空気を培地に通過させることによ って提供することができる。通気は、滅菌空気を発酵混合物に通過させることに よって行なうことができる。

発酵は、通常、約り０℃〜約４０℃、好ましくは、約２４℃〜約３６℃で約５０ 時間〜約１５０時間行なうが、それは発酵の条件および規模によって変更するこ とができる。好ましくは、生産用培養は、２２Ｏｒｐｍで操作するロータリーシ ェーカー上において２７℃で約９６時間インキユベートシ、そこにおいて、発酵 培地のｐＨは、好ましくは約４，０〜約８．０、更に好ましくは約６．０〜約８ ．０のｐＨで採収するまで保持される発酵の実施に用いることができる培養／生 産用培地としては下記がある。

培地Ａ：グリセロール、コーンスターチ、セルロース、綿実ミール、トルラ酵母 、トウモロコシ浸漬液、炭酸カルシウムおよび塩化コバルトを、発酵培地の好ま しい重量百分率でそれぞれ１．０％、１．０％、０６５％、１．０％、０．５％ 、０．５％、０．２％および０．０００５％並びに０．２％（容量／容量）の消 泡剤、例えば、Ｐ−２０００（ダウ・コーニング（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ）（ 商標））。この培地のｐＨは、概して、オートクレーブ処理および接種の前に約 ６．３〜約６．５に調整される。

培地Ｂ：コーンスターチ、トウモロコシ浸漬液、トルラ酵母、硫酸マグネシウム 、第ニリン酸カリウム、塩化コバルトおよび炭酸カルシウムを、発酵培地の好ま しい重量百分率でそれぞれ４．５％、１．０％、１．０％、０．０１％、０゜０ １％および０．０００１％並びに０．２％（容［容量）の消泡剤、例えば、Ｐ− ２０００（ダウ・コーニング（商標））。この培地のｐＨは、概して、オートク レーブ処理および接種の前に約７．０〜約７，２に調整される。

培地Ｃ：セレローズ、大豆ミール、硫酸アンモニウム、第ニリン酸カリウム、炭 酸カルシウム、ＮＺアミンＹＴＴ　（シェフイールド（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）（ 商標））および塩化コバルトを、発酵培地の好ましい重量百分率でそれぞれ２゜ ０％、３．　０％、０．５％、０．５％、０．　３％、０．５％および０．００ ０５％並びに０．２％（容Ｖ容量）の消泡剤、例えば、Ｐ−２０００（ダウ・コ ーニング（開切）。この培地のｐＨは、概して、オートクレーブ処理および接種 の前に約７．０〜約７．２に調整される。

生産された式■の化合物は、他の既知の生物学的活性物質の回収に一般的に用い られる慣用的な手段によって培地から回収することができる。生じた式Ｉの化合 物は、培養された菌糸体および濾液中に見出さｊうしたがって、菌糸体および濾 液から単離し且つ精製することができる。菌糸体は、培養されたブイヨンを濾過 または遠心分離することによって分離することができる。次に、菌糸体を慣用的 な溶媒、例えば、メタノールまたはアセトンで抽出し、分離し、そして濃縮する ことができる。次に、慣用的な樹脂による濃縮物の処理（例えば、陰イオンまた は陽イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等）、慣用的な吸着剤による処理（例 えば、活性炭、珪酸（ｃｉｌｉｃ　ａｃｉｄ）、シリカゲル、セルロース、フロ リシル（ｆｌｏｒｉｓｉｌ）、アルミナ等）、結晶化および再結晶化を行なって 、所望の化合物を回収する。

式■の化合物を製造するための好ましい方法において、接種材料は、培養物Ｎ９ ２７−１０１を接種した斜面またはルー瓶から増殖性細胞を掻取ることによって 製造される。斜面およびルー瓶での最初の増殖に適当な固形培地は、以下に記載 したＡＴＣＣ培地１７２である。

可溶性デンプン　２０ 酵母エキス　５ ＮＺアミンＡ５ 炭酸カルシウム　１ 寒天　２０ 蒸留水１０１００Ｏまで； ＫＯＨでｐＨを７．０にする。

斜面からの増殖性細胞を用いて振とうフラスコかまたは接種材料タンクに接種し ：或いは、接種材料タンクに振とうフラスコから接種する。振とうフラスコ中に おいて、概して、増殖は４８〜９６時間で最大に達するが、接種材料タンク中で の増殖は、通常、７２〜１２０時間が最も好ましい時間である。発酵装置に完全 な無菌条件下で接種材料フラスコまたはタンクから増殖性ブイヨンを接種し且つ ７２〜１２０時間発酵させる。通気は、振とうフラスコ中において振とう機上の 撹拌によってまたはタンク中において滅菌空気をスパージャ−によって空気１／ ２〜２容１容量（ブイヨン）７分の速度で送ることによって保持される。撹拌（ かき回し）速度は用いた攪拌機の種類に依存し；振とうフラスコは、通常、１５ ０〜２００サイクル／分（ｃｐｍ）および発酵装置は３００〜１７００回転／分 （ｒｐｍ）で運転する。無菌状態は全時間中保持されなければならない。温度は ２４℃〜３６℃に調節される。発酵中の発泡は、精製大豆油などの滅菌消泡剤、 または組成若しくは発酵装置に対して接覆後に必要とされるように無菌的に加え られる他の適当な消泡剤で制御することができる。振とうフラスコは下記の培地 の１種類を用いて調製される。

ＡＴＣＣ１７２グラム／リットル 可溶性デンプン　２０ 酵母エキス　５ ＮＺアミンＡ（クエスト・イン　５ ターナシヨナル・ノルウィッチ （Ｑｕｅｓｔ　Ｉｎｔｅｒ− ｎａｔｉｏｎａｌ　ｎｏｒｗｉｃｈ）、ニューヨークの商標） 炭酸カルシウム　１ ｐＨ７，０〜７．１ 綿実ミール　１０ トルラ酵母　５ トウモロコシ浸漬液　５ 炭酸カルシウム　２ 塩化コバルト　０．００５ ｐＨ６，３〜６．５まで ＪＤＹＴＴ　ダラム／リットル セレローズ　１゜ コーンスターチ　５ ＮＺアミンＹＴＴ　（クエスト・　５ インターナシヨナルリルウイツチ、 ニューヨークの商標） トウモロコシ浸漬液　５ 炭酸カルシウム　３ 塩化コバルト　０．００５ ｐＨ６，５〜６．７まで 培地１００ｍ１ずつを３００ｍ１の振とぅフラスコに分配し且っ１２０’Ｃおよ び１．０６ｋｇ／ｃｍ　で３０分間滅菌した。冷却後、寒天中のＡＴＣＣ培地１ ７２で増殖したＮ９２７−１０１斜面培養からの増殖性細胞懸濁液を培地に接種 する。フラスコを、変位が２．５−３．５ｃｍ〜５．０−７．３ｃｍの振とぅ機 上において２８℃および１５０〜２０Ｏｒｐｍで２〜４日間振とぅする。その工 Ｏｍｌを用いて、培地１リツトルが入っている２、８リツトルのフエルンバッハ フラスコ１個に接種してよいしまたはフラスコ１個分を用いて、下記の培地の１ 種類が３リットル入っている５リツトルの発酵容器に接種してもよい。

ＦＫ−５０６−ＦＭ　グラム／リットルトウモロコシ浸漬液　１゜ トルラ酵母　１゜ 硫酸マグネシウム　０．　１ 第ニリン酸カリウム　０．　１ 塩化コバルト　０．００１ 炭酸カルシウム　２ ｐＨ７，Ｏ〜７．２まで ＡＴＣＣ１７２グラム／リットル 可溶性デンプン　２０ 酵母エキス　５ ＮＺアミンＡ５ 炭酸カルシウム　Ｉ Ｐ−２０００の１ｍｌを消泡剤としてジャー発酵装置に対してのみ加え、次に、 容器を密封し且つ１２０℃および１．０６ｋｇ／ｃｍ２で６０〜９０分間滅菌す る。ジャーにフラスコ１個（約３％接種材料）を接種し、２７℃で７２〜１２０ 時間発酵させ、そして空気１容量／容量（液体）７分の空気量を用いて１７００ ｒｐｍで撹拌する。振とうフラスコ（フェルンバッハ）を振とう機上１５０〜２ ００ｃｐｍにおいて２８℃で運転し且つ７２〜１２０時間醗酵させる。発酵装置 を停止し、そしてその内容物を３分の１〜２分の１容量の溶媒、例えば、メチル イソブチルケトンまたはｎ−ブタノールで２回抽出する。溶媒層を吸引または遠 心分離によって分離し、スパークルし、そして真空中で濃縮して粘稠な油にする 。

ブイヨンおよび引続きの回収流の生物活性は、高速液体クロマトグラフィーによ ってまたは糸状菌の菌株、例えば、ビソクラミス・タルク７（Ｂｙｓｓｏｃｈｌ ａｍｙｓ　ｆｕｌｖａ）を用いることによって追跡することができる。ブイヨン および回収流中の成分は、更に、溶離剤として純酢酸エチルまたはクロロホルム −メタノール１０：１を用いるアナルテク（Ａｎａｌｔｅｃｈ）シリカゲルＦＧ （商東プレート上のクロマトグラフィーによって視覚化することができる。展開 されたプレートを２５４ｎｍの紫外線下で目視検査するかまたはバニリン試薬（ 例えば、エタノール７５ｍ１および８５％リン酸中バニリン３ｇ）を噴霧し且つ ８０℃まで加熱する。化合物は灰青色スポットとして見える。ブイヨンの抽出物 は、ゾルバクス（Ｚｏｒｂａｘ）ＣＮイーで実施することができる。

更に大規模な発酵は、式Ｉの化合物の接種材料培地１リットルが入っている振と うフラスコを調製することによって実施することができる。振とうフラスコ接種 材料を２８℃で２〜４日間発酵させた後、生産用培地２５ガロンが入っている５ ０ガロンの発酵装置に接種するのに用いる。３〜５日間運転後のブイヨンを採収 する。全ブイヨンを、１／３容量のメチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）を用い て自然のｐＨで抽出し、アルファΦデψラヴアル（Ａｌｐｈａ　ＤｅＬａｖａＩ ）（商Ｉ分離器で分離し、そして溶媒相を真空中で濃縮して油にする。自然のｐ Ｈという用語は、停止された場合の発酵のｐＨ，またはｐＨが調節されている場 合、発酵が実施された若しくは保持されたｐＨを意味する。このようにして得ら れた油は、実施例１において以下に記載したように処理することができる。

更に大型の発酵装置を計画することができる。装填量１００ガロンの式Ｉの化合 物の種培地を、サイドアームフラスコによって接種し、約４８時間運転した後、 生産用培地１０００ガロン中に無菌的にポンプ輸送する。

式■の化合物はヒトＦＫ結合性タンパク質のロタマーゼ（ｒ　ｏ　ｔ　ａｍａ　 ｓ　ｅ）活性を阻害する。ヒト混合リンパ球反応（ＭＬＲ）における機能的な生 物学的活性は、当業者に周知の標準的な方法によって実証することができる。

更に、式■の化合物の免疫抑制効果は、イオノマイシンにＰＭＡ　（ホルボール ミリステートアセテート）を加えた組合わせで刺激されたマウスＴリンパ球の増 殖を測定する下記の検定によって実証することができる。この検定で陽性の試料 は、トリチウムを入れたチミジンの減少した取込みによって示されるように、Ｔ Ｃ５７ＢＩ／６マウスから膵臓を無菌条件下で取り、そして１０％熱失活ウシつ 児血清（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）（商標））を補足した氷冷ＲＰＭＩ　１６４０（ 商標）培地（ギブコ（商標））中で静に分離させる。細胞を１５０Ｏｒｐｍで８ 分間の遠心分離によってペレットにする。混入している赤血球は、塩化アンモニ ウム溶解用緩衝液（ギブコ（商標））を用いてペレットを４℃で２分間処理する ことによって除去される。冷培地を加え、細胞を再度１５００ｒｐｍで８分間遠 心分離する。次に、その細胞懸濁液をナイロンウールカラム上で以下のように分 離することによってＴリンパ球を単離する。即ち、ナイロンウールカラムは、洗 浄し且つ乾燥したナイロンウール約４グラムを２０ｍ１のプラスチックシリンジ 中に充填することによって製造される。カラムを１２０℃で３０分間オートクレ ーブ処理することによって滅菌する。六イロンウールカラムを暖かい（３７℃） 培地で湿潤させ且つ同培地ですすぎ洗いする。洗浄されて暖かい培地中に再懸濁 された膵臓細胞をナイロンウールに対して徐々に加える。次に、カラムを垂直位 置において３７℃で１時間インキュベートする。非付着Ｔリンパ球は暖かい培地 と一緒にカラムから溶離し、そして細胞懸濁液を上記のように回転させる。

精製ＴＩＪンパ球を、１０％熱失活ウシつ児血清、１００ｍＭグルタミン、１ｍ Ｍピルビン酸ナトリウム、２０μｍ　２−メルカプトエタノールおよびゲンタマ イシン５０μｇ／ｍＩを含むＲＰＭＩ　１６４０　（商標）培地から成る完全な 培地中に細胞１０６個／ｍｌで再懸濁させる。イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｍ ｌおよびＰＭＡを１０ｎｇ／ｍｌで加える。細胞懸濁液を９６ウエル平底ミクロ 培養プレート（コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）（商標））中に１００μｌ／ウエルで 速やかに分配する。次に、対照（シクロスポリン）培地または試験される試料を 三重反復試験用ウェルに１０μｌ／ウエルで加える。次に、培養プレートを、５ ％る。４４時間の培養後、細胞は、トリチウムを入れたチミジン（二ニー・イン グランド・ヌクレア（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ｎｕｃｌｅａｒ）（商［ｊ）） ２Ｃｉ／ウエルでパルス標識される。更に４時間のインキュベーション後、多数 の試料ハーベスタ−を用いて培養物をガラス繊維フィルター上に採収する。個々 のウェルに対応するフィルターディスクの放射能を標準的な液体シンチレーショ ン計数法（ベータプレート計数計）によって測定する。反復試験ウェルの平均計 数／分を計算し、その結果を下記のようにトリチウムを入れたチミジン取込み（ 増殖）の阻害百分率として表わす。

式Ｉの化合物は免疫抑制活性を有し、したがって、心臓、腎臓、計重骨髄、皮膚 等のような臓器または組織の移植拒絶反応、骨髄移植による対宿主性移植片病、 慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎 、多発性硬化症、重症筋無力症およびＩ型糖尿病の治療および防止に有用である 。更に、化合物は抗微生物活性を有し、病原性糸状菌類微生物によって引起こさ れた感染症を治療するのに有用である。

本発明の薬剤組成物は、活性成分としての式１の化合物と、外用、腸内用または 非経口用に適当な有機または無機担体または賦形剤とを一緒に含む製剤の形で、 例えば固体、半固体または液体で用いることができる。活性成分は、例えば、錠 剤、ペレット剤、カプセル剤、座剤、水剤、乳剤、懸濁剤および使用に適した何 等かの他の射影用の通常の無毒性で薬学的に許容しうる担体と配合することがで きる。用いることができる担体は、水、グルコース、ラクトース、アラビアゴム 、ゼラチン、マンニトール、デンプンペースト、三珪酸マグネシウム、タルク、 コーンスターチ、ケラチン、コロイドシリカ、バレイショデンプン、尿素および 、固体、半固体または液体で製剤を製造する場合に用いるのに適当な他の担体で あり、更に、添加剤、安定化剤、粘稠化剤、着色剤および香料を用いることがで きる。このような薬剤組成物を七トに対して適用するには、非経口または経口投 与によって組成物を適用するのが好ましい。

式Ｉの化合物の治療的有効量の用量は治療される個々の患者それぞれの年齢およ び症状に依るので、概して、活性成分的０．０１〜約１０００ｍｇ、好ましくは 、約０．１〜約５００ｍｇ、更に好ましくは、約０．５〜約１００ｍｇの日用量 （７０ｋｇの人を基準に計算した）を、上記に論及した移植拒絶反応または疾患 を治療するのに与え、概して、約０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇまたは５００ｍｇの平均１回用量を投与する。

下記の実施例は本発明を例示する目的で与えられており、本発明を制限すると解 釈されるべきではない。

実施例１ Ｎ９２７−１０１の発酵 微生物Ｎ９２７−１０１を、日本の山口県三隅町で採収された土壌試料から単離 した。

Ａ、微量滴定発酵 寒天プレート上のＮ９２７−１０１コロニーの試料を、２４ウ工ル微量滴定プレ ート中のグルコース（１ｇ）、デキストリン、ポリペプトン（５ｇ／ＩＬ酵母エ キス（５ｇ／ｌ）、牛肉エキス（３ｇ／Ｉ）およびＣａ　ＣＯａ　（４ｇ　／　 ’　）を含む種培地Ｗ（２，５ｍ１）中に接種し、そして２０Ｏｒｐｍで７ｃｍ 行程のロータリーシェーカー上において２８℃で３日間培養し九二のようにして 得られた種培養（０，１５〜０．３ｍ１）を、２４ウ工ル微量滴定プレート中の グルコース（Ｌｏｇ／ｌ）、コーンスターチ（２０ｇ／ｌ）　、ＮＺアミンＡ型 （５ｇ／ｌ）、酵母エキス（５ｇ／ＩＬ小麦胚芽（５ｇ／■）、ＣＯＣｌ２・Ｈ ２Ｏ（０，００１ｇ／Ｉ）およびＣａ　ＣＯａ　（４ｇ　／　’　）を含む生産 月培地（３ｍｌ）に接覆し、そして発酵が４日間であったこと以外は上記の種培 養と同一条件下で培養した。

このようにして得られた発酵ブイヨンを、ＴＬＣ（薄層クロマトグラフィー）プ レート（キーセルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０Ｆ　イー拳メルック２５４ゝ （Ｅ、Ｍｅｒｃｋ）　（商標）２０Ｘ２０ｃｍ）に適用し、ＣＨＣｌ３：ＣＨ３ ０Ｈ（９：　１）によって展開した。溶媒を除去した後、ＴＬＣプレートをバイ オプレート（２８Ｘ４４ｃｍ）に入れ、そしてビソクラミスーフルヴアを播種し た麦芽酵母寒天（１，０００ｍ１中に麦芽エキス２０ｇ、酵母エキス４ｇ、寒天 ２０ｇ）３００ｍｌを上に重ねた。バイオプレートを２８℃で４８時間インキュ ベートした。試験微生物に対する阻害区域としてＲｆ値が０．３０および０．５ ５の少なくとも２Ｗ類の化合物を検出した。

Ｂ、フラスコ発酵 既知の化合物と同一のところにある化合物がＮ９２７−１０１によって生じたか どうかを決定するために、フラスコ培養を実施した。微量滴定発酵からの冷凍種 培養０．５ｍｌを接種した種培養（１００ｍｌ）を前記のように発酵させた後、 その５ｍｌを用いて、前記のように発酵させた主培養１００ｍ１を製造した。得 られた発酵ブイヨン１５０ｍ１を酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）１００ｍｌで抽出し た。ＥｔＯＡｃ溶液を濃縮乾固させた。残留物をアセトン２ｍｌ中に溶解させ且 つＴＬＣ−バイオオートグラフィーに供した。ビソクラミス・フルヴアに関する ＴＬＣ−バイオオートグラフィーは、２種類のＦＫ関連化合物が再生されたこと カラム：４．６ｍｍＸ２５ｃｍ；溶離剤：５５％水／４５％アセトニトリルｉ流 量：１ｍｌ／分；検出：ＵＶ２１４ｎｍ）　。Ｒｔ値が０．３０のもう一つの化 合物は新規であった。

した。最初の種培養は、振とうフラスコ発酵からの冷凍種培養５ｍｌを培地１０ ０ｍ１に接種することによって製造した。培地（ＷＧＢ培地）は、水、グルコー ス（２０ｇ／ｌ）、ポリペプトン（５ｇ／ｌ）、酵母エキス（５ｇ／ｌ）、牛肉 エキス（３ｇ／ＩＬ小麦グルテン（５ｇ／ｌ）、血液ミール（３ｇ／ｌ）および Ｃａ　ＣＯａ　（４ｇ／　ｌ　）を含んだ。培養を２０Ｏｒｐｍで回転させなが ら２８℃で４日間保持した。

第二の種培養は、発酵した最初の種培養７．５ｍｌをＷＧＢ培地１５０ｍ１に接 種することによって製造した。培養を２００ｒｐｍで回転させ且つ１．０容量／ 容量／分で通気しながら２８℃で３日間保持した。

主培養は、６リツトルのミニジャー５個において第二の種培養１５０ｍ１を各ジ ャー中の培地３リツトルに接種することによって製造した。培地（ＩＴ−２培地 ）は、グルコース（１０ｇ／ｌ）、デキストリン（２０ｇ／ｌ）、小麦グルテン （１０ｇ／Ｉ）、トウモロコシ浸漬液（５ｇ／ｌ）、ポリペプトン（Ｉｇ／ｌ） を７０％水性アセトン５リツトルずつで２回抽出し且つ濃縮して水性懸濁液２゜ 液を濃縮し、モしてｎ−ヘキサン１００ｍ１を加えてガム状固体１．７ｇを生じ た。ガム状固体２．８ｇおよび１．７ｇを合わせ、微細メツシュシリカゲルカラ ム１２０ｇに適用し、それを３：ｌのへ牛サン／酢酸エチルＩＩ、に続いて２： １のへ牛サン／酢酸エチルＬＬ、１：１のヘキサン／酢酸エチルＬＬ、２：１の 酢酸エチル／ヘキサンＩＬ、そして最後に酢酸エチル２して展開してＦＫ−５２ ０を２５ｍｇと、ＦＫ−５２０および新規の化合物の混合物１２５ｍｇを生じた 。

この混合物を微細メツシュシリカゲルカラム１０ｇに適用し、それをクロロホル ム２００ｍ１に続いて２％メタノールを含むクロロホルム２００ｍ１．５％メタ ノールを含むクロロホルム２００ｍ１、そして最後に１０％メタノールを含むク ロロホルム１００ｍ１で溶離して新規の化合物Ｌｏｎｇを生じ九これを４／１の 比率のメタノールおよび水で展開される０１８力ラム１ｇ上で更に精製して、後 に式Ｉを有することが分った新規の化合物４ｍｇを生じた。

実施例２ 大規模フラスコ発酵 ＡＴＣＣ１７２培地８０ｍ１が入っている振とうフラスコに接種し、そして２８ ℃で３〜４日間発酵させた後、その１０ｍ１を用いて、ＡＴＣＣ１７２培地１リ ツトルが入っている２、８リツトルのフエルンバッハフラスコに接種した。

発酵装置を３〜５日間運転した後、採収した。

Ｎ９２７−１０１ブイヨン４７リツトルを、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ ）を用いて自然のｐＨで抽出した。ＭＩＢＫ相を分離し且つ真空中で濃縮して油 にした。その油をアセトニトリルおよびヘキサンを用いて脱脂して、暗色の粘稠 な液体４．０ｇを生じた。この残留物を、ヘキサンおよび酢酸エチル（１：　１ ）で予め平衡にした微細メツシュシリカゲル１２８ｇ上のクロマトグラフィーに よって分離した。カラムを１：１の酢酸エチル／ヘキサンＩＬに続いて２：ｌの 酢酸エチル／ヘキサンＬＬ、４：１の酢酸エチル／ヘキサンＬＬ、そして最後に 酢酸エチル１．５Ｌで展開して黄色油２９０ｍｇを生じた。次に、この混合物を 、クロロホルムで予め平衡にした第二の微細メツシュシリカゲルカラム上でクロ マトグラフィーによって分離し且つクロロホルム２００ｍ１に続いて１％メタノ ールを含むクロロホルム５００ｍ１、次に２％メタノールを含むクロロホルム５ ００ｍ１で展開して油１２５ｍｇを生じた。この油を、メタノールおよび水（３ ：１）を用いるフラッシュクロマトグラフィー用のべ一カー（Ｂ　ａ　ｋ　ｅ　 ｒ）　（商標）は、生成物の化学的構造が式１で示されたようにあることを示し た。ＦＡＢ　（高速原子衝撃）買置分光分析法によって決定される分子量７７７ は、式■と一致する。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：４６５） （Ｃ１２Ｐ　１７／１８ Ｃ１２Ｒ１：４６５） （７２）発明者　ファン、リアン・エイチアメリカ合衆国コネチカット州０６３ ３３．イースト・ライム、サンライズ・トレイル（７２）発明者　兼１）敬二 愛知県知多郡武豊町ゑケ屋敷２７−５ （７２）発明者　小咄　仲夫 愛知県名古屋市名東区社台３−１５３−１Ｉ （７２）発明者　小鴫　康広 愛知県西尾市平板町上縄８３−２ （７２）発明者　コステック、グロリア・ジエイアメリカ合衆国コネチカット州 ０６３６０．ブレストン、ルート１６４．ボックス　２０４（７２）発明者　百 出　を 愛知県知多郡武豊町石川１−５５ （７２）発明者　山口　雄治 愛知県半田市板山１−９８−３

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．式 ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ を有する化合物を製造する方法であって、式Ｉを有する化合物を生産する細菌の 菌株を、炭素源および窒素源を含む水性培地中において好気性条件下で発酵させ ることを含む上記の方法。
2. ２．ストレプトミセス・ブレジェンシヌ亜種ブルチェリムス・ワンダ亜種新種（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｂｒａｅｇｅｎｓｉｓ　ｓｕｂｓｐ，ｐｕｌｃｈｅ ｒｒｉｍｕｓ　Ｈｕａｎｇ　ｓｕｂｓｐ，ｎｏｖ，）ＡＴＣＣ　５５１５０の特 徴を有する微生物を発酵させること、またはＡＴＣＣ　５５１５０を発酵させる ことから成り、上記発酵はいずれの場合も炭素源および窒素源を含む水性培地中 の好気性条件下に行なわれる請求項１に記載の方法。
3. ３．前記の発酵を約４．０〜約８．０のｐＨで行なう請求項１または２に記載の 方法。
4. ４．発酵ブイヨンを約４．０〜約８．０のｐＨで有機溶媒を用いて抽出すること によって前記の式Ｉを有する化合物を回収することを更に含む請求項１または２ に記載の方法。
5. ５．菌糸体を分離し且つそれを約４．０〜約８．０のｐＨで有機溶媒を用いて抽 出することによって前記の式Ｉを有する化合物を回収することを更に含む請求項 １または２に記載の方法。
6. ６．前記の発酵を約２０℃〜約４０℃の温度で約５０時間〜約１５０時間行なう 請求項１に記載の方法。
7. ７．前記の発酵を、炭素源および窒素源、微量金属を含む１種類またはそれ以上 の無機塩並び１種類またはそれ以上の緩衝剤から成る培地で撹拌および通気しな がら液内条件下において約２４℃〜約３６℃の温度で行なう請求項９に記載の方 法。
8. ８．ストレプトミセス・ブレジェンシス亜種ブルチェリムス・ワンダ亜種新種Ａ ＴＣＣ　５５１５０の特徴を有する生物学的に純粋な培養物および式▲数式、化 学式、表等があります▼Ｉ を有する化合物を生産することができるその全ての突然変異体または形質転換体 。
9. ９．請求項１４に記載の生物学的に純粋な培養物ＡＴＣＣ　５５１５０。