JPH02142795A - 新規な免疫抑制剤化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な免疫抑制剤“ツクバマイシンＡ”　ＦＫ
−５０６のＣ−９ジヒドロ類似体及び微生物ストレプト
ミセスツクハエンシス（５ｔｒｅｐｔｏｖｓｙｃｅｓｔ
ｓｕｋｕｂａｅｎｓｉｓ）Ｎｏ、９９９３（ＦＥＲＭ　
ＢＰ−９２７）を利用してＦＫ−５０６を生産する発酵
方法の副生成物として得られるＦＫ−５０６のＣ−２１
プロピル類似体である免疫抑制剤“ツクバマイシンＢ”
の新規な製造方法に関する。この方法は、Ｆに−５０６
を製造する条件下で微生物を培養することを包含する。

また自己免疫疾患、感染症を治療し及び／又は器官移植
片拒否反応を防止するためのヒト宿主に於ける使用方法
か開示される。

１９８３年に米国ＦＤＡは非常に有効な抗拒否反応薬剤
、シクロスポリンを認可し、これは器官移植片手術の分
野に革命をもたらした。この薬剤は、移植片の異種タン
パク質を拒絶する莫大な量の天然保護物質を移動させる
ことによって体内の免疫系を阻害することによって作用
する。

この薬剤は、移植拒否反応を抑えるのに有効であるほど
、腎不全、肝障害及び潰瘍を引き起こすという欠点かあ
り、多くの場合、かなり重篤であり得る。

本明細書に引用されるフジサワによる欧州特許庁公開番
号第０１８４１６２号は、シクロスポリンより　１００
倍有効であるとみなされる新規なマクロライド免疫抑制
剤ＦＫ−５０５を記載している。このマクロライドはス
トレプトミセスックハエンシスＮｏ、９９９３（ＦＥＲ
Ｍ　ＢＰ−９２７）と特定菌株の発酵によっ′Ｃ生産さ
れる。また極めて関連のあるマクロライド免疫抑制剤で
ある同し微生物によって生産されたＦＫ−５２５及びＳ
、ヒフロスコピカス（Ｓ、ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ
）亜種ヤクシマエンシス（ｙａｋｕｓｔ＋ｉｍａｅｎｓ
ｉｓ）によって生産されたＦＫ−５２０及びＦＫ−５２
３も記載されている。

■、アライによる米国特許第３，２４４，５９２号はス
トレプトミセスヒゲロスコピカス変異種アスコミセチカ
ス（ａｓｃｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）を培養して抗真菌剤
゛アスコマイシン°′を製造することを記載している。

しかしながら文献中には、シクロスポリンの副作用か実
質的にない免疫抑制剤を製造することについて記載され
ていない。

この分野では副作用の少ない新しい安全な薬剤か絶えず
探索されている。

新規な免疫抑制剤、ＦＫ−５０６のＣ−９ジヒドロ類似
体である“ツクハマイシンＡ”及びＦＫ−５０６のＣ−
２１プロピル類似体である“ツクハマイシンＢ　”か窒
素栄養源を含む炭化水素水性培地中ＦＫ−５”６を生産
する侵情ＩＩ（気性条件ドて微生物ストレブトミセスツ
クバエンシスＮｏ、９９９：ｌ（ＦＥＲＭＯＰ−９２７
）の発酵の副生物として得ることかＣき、該条件がｐＨ
約７て行われることを見い出した。

結果として生した“°ツクハマイシンＡ及びＢ　ＩＩは
免疫抑制作用即ち本明細書て°°Ｔ−細胞増殖検定”と
呼ばれるカルシウムイオノフオア（イオノマイシン）＋
ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）誘発Ｔ−
細胞刺激検定によって示された場合Ｔ−細胞活性化の阻
害か陽性を示す。

この検定の原理はイノマイシンとＰＭＡの組合わせ゛Ｃ
刺激したマウスＴリンパ球の増殖を測定することである
。この検定の陽性試料は原理トリチウム標識チミジンの
取り込みによって示される通り、Ｔ−細胞増殖を阻害す
る。

本発明によれば、Ｔ−細胞増殖検定によりＴ−細胞活性
化の阻害か陽性を示し、テトラ（トリメチルシリル）ｔ
Ａ導体として高分解能質琶スペクトル分子イオン（ｍ／
ｚ）　１０９３．６５５６とｍ／ｚ６７３及び４８１に
於て特徴的フラクメントイオンを示す新規な免疫抑制剤
゛ツクハマイシンＡ”か提供される。

また医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は賦形
剤と共に“ツクハマイシンＡ”の治療上有効な量を含有
する医薬組成物か提供される。

更に“ツクハマイシンＡ゛の治療上有効な菫をヒト宿主
に投与することを特徴とする移植拒否反応を防止するた
めに該宿主を治療するか又は自己免疫疾患又は感染症を
治療する使用方法か提供される。

更にその−１−２窒素栄養源を含有する炭化水素水性培
地中侵漬好気性条件下で微生物ストレブトミセスツクバ
エンシスＮｏ、９９９３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９２７）を
発酵させる１程を包含し、かかる条件かｐｌ＋約７て行
なわれ、°°ツクハマイシンＢ”を回収するＴ−細胞増
殖検定によりＴ−細胞活性化の阻害か陽性を示しトリ−
（トリメチルシリル）誘導体として高分解能質量スペク
トル分子イオン（ｍ／ｚＮ０２１．６１６！ｌとｔｍ／
ｚ６７５及び４８３に於て特徴的フラグメントイオンを
示す免疫抑制剤“ツクハマイシンＢ”の新規な製造方法
か提供される。

本発明は“ツクハマイシンＡ及びＢ”　ｆ生産するスト
レプトミセスツクハエンシスＮｏ、９９９３（ＦＥＢＭ
　ＢＰ−９２７）の発酵を包含する。物理的特徴及び分
類を含む即ち形態、培養、生物及び生理的特徴を含む微
生物はフシサワによる欧州特許庁公開番号第０１８４１
６２号に記載されている。

一般に“ツクバマイシンＡ及びＢ”は同化可能な炭素及
び窒素源を含有する水性栄養培地中好ましくは浸漬好気
性条件下（例えば振盪培養、浸浸培養等）てストレブト
ミセスックバエンシスＮｏ、９９９３（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−９２７）を培養（発酵）することによって産生される
。水性培地は発酵工程の開始及び終結（集菌）に於てｐ
Ｈ約７に維持されることか好ましい。ｐＨかこれより高
いと生産物の実質的及び／又は全体の損失となる。

望ましいｐｔ＋は、緩衝液例えばモルフォリノエタンス
フレホン＃（ＭＥＳ）　、モルフオソノプロバンスルホ
ン酸（ＭＯＰＳ）等の使用によって又は本質的に緩衝特
性を有する栄養材料例えば以下に記載される産生培地の
選択によって維持することかてきる。

栄養培地中好ましい炭素源は炭水化物例えばクルコース
、キシロース、ガラクトース、グリセリン、デンプン、
デキストリン等である。包含される他の炭素源はマルト
ース、ラムノース、ラフィノース、アラヒノース、マン
ノース、サリシン、コハク酸ナトリウム等である。

好ましい窒素源は酵母エキス、肉エキス、ペプトン、タ
ルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び他の植物性
ミール（一部又は全部脱脂された）、カゼイン加水分解
物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーン浸漬液
、乾燥酵母、麦芽、フェザ−ミール、落花生末、醸造可
溶成分等並びに無機及び有機窒素化合物例えばアンモニ
ウム塩（例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸等である。

炭素及び窒素源は、併用して使用されるのか有利である
が、生育因子の痕跡量と無機栄養素のかなりの量を含む
純度の低い材料も使用に適当であるためそれらの純粋な
形で使用される必要はない。所望される場合培地に鉱酸
塩例えば炭酸ナトリウム又はカルシウム、リン酸ナトリ
ウム又はカリウム、塩化ナトリウム又はカリウム、ヨウ
化ナトリウム又はカリウム、マグネシウム塩、銅塩、コ
バルト塩等を添加することかできる。必要な場合特に培
地かひどく発泡するときに、泡止め剤例えば流動パラフ
ィン、脂肪油、植物油、鉱油又はシリコーンを添加する
ことかできる。

多量に“ツクバマイシンＡ及びＢ”を生産する条件に関
して浸漬好気性培養条件か好ましい。少量の生産に対し
てはフラスコ又はビンで振盪又は表面培養か使用される
。更にその上大きなタンクで増殖を実施する場合“ツク
バマイシンＡ及びＢ”の生産過程て生育の遅滞を避ける
ために生産タンクの接種に増殖形の微生物を使用するこ
とか好ましい。従ってまず比較的少量の培地に゛斜面（
ｓｌａｎｔ）゛て産生された微生物の胞子又は菌糸を接
種し、“種子培地′°とも呼ばれる＃接種培地を培養す
ることによって増殖形接種物の微生物を産生じ、次に培
養される増殖形接種物を無菌的に大きなタンクに移すこ
とか望ましい。接種物か産生される発酵培地は“°ツク
ハマイシンＡ及びＢ′”の生産に利用される培地と実質
的に同しか又は異なり、一般に接種前に培地を滅菌する
ためにオートクレーブにかけられる。培地のｐＨは一般
にオートクレーブ工程の前に酸又は塩基、好ましくは緩
衝液の形て適当に添加することによって約７．０に調整
される。

培養混合物の攪拌及び通気は様々な方法て行なうことか
てきる。攪拌は、プロペラ又は類似の機械的撹拌装置に
よって、発酵槽を回転又は振盪することによって種々の
ポンプ装置によって又は、培地に無菌空気を通過させる
ことによって行なうことかできる。通気は、発酵混合物
に無菌空気を通過させることによって行なうことかでき
る。

発酵を実施するために好ましい培養／増殖培地は次の培
地を包含する。

−ＦＫ−８ｌ セレロース グリセロール コーンスターチ ファーマメジア コーン浸漬液 炭酸カルシウム ポリグリコールＰ−２００ Ｆに−Ｐ１ 可溶性デンプン コーン浸漬液 一次乾燥酵母 炭酸カルシウム ポリグリコールＰ−２００ ５、５９／交 １０．５９／す １０．０９／交 １０．０９／見 ５．０９／見 ２．０９／交 １．０”／１ ４５゜ ｌ　Ｏ６ ｌ　Ｏｏ ｌ　。

２゜ ０９／見 ０９／又 ０９／見 ０９／１ ０”／文 産生された“ツクハマイシンＡ及びＢ”は−般に他の公
知の生物学的に活性な物質の回収に用いられる常法によ
って培地から回収することかできる。産生された“ツク
バマイシンＡ及びＢ”物質は培養された菌糸及び炉液中
に見られ、従って培養ツイヨンを濾過又は遠心すること
によって得られる菌糸及びＰ液から、常法例えば減圧下
で濃縮、凍結乾燥、メタノール等の通常の溶媒で抽出、
ｐＨ調整、通常の樹脂（例えばアニオン又はカチオン交
換樹脂、非イオン吸着樹脂等）、通常の吸着剤（例えば
活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等
）、結晶化、再結晶等によって分離及び精製することか
できる。好ましい方法は特にメタノールを用いる溶媒抽
出である。

発酵による生産物“ツクハマイシンＡ及びＢ”は、“Ｔ
−細胞増殖検定”て免疫抑制作用か陽性を示しこれに基
づき有用性を有する。

生産物“ツクハマイシンＡ”は次の物理的特性を示す。

１、白色無定形粉末 ２、メタノール溶解性 ３、質量分析で定量した分子量８０５、テトラ（トリメ
チルシリル）誘導体に対する （ｍ／ｚ）１０９３．６５５６に於ける分子イオンと（
＠／Ｚ）６７３及び４８１に於ける特徴的フラグメント
イオンと一致する。

生産物“ツクバマイシンＢ”は次の物理的特性を示す。

１、白色無定形粉末 ２、メタノール溶解性 ３、質量分析で定量した分子量８０５、トリ−（トリメ
チルシリル）誘導体に対する （−／ｚ）１０２１．６１６９に於ける分子イオンと（
鳳／ｚ）６７５及び４８３に於ける特徴的フラグメント
イオンと一致する。

Ｌ記で説明した発酵工程で得られた“°ツクバマイシン
Ａ及びＢ”は常法例えば抽出、沈殿、分別結晶、再結晶
、クロマトグラフィー等で分離精製することかてきる。

この物質の適当な塩は医薬的に使用し得る塩例えば塩基
性塩即ちアルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウ
ム塩等）アルカリ土類金属塩（例えばカルシウム塩、マ
クネシウム塩等）アンモニウム塩、アミン塩（例えばト
リエチルアミン塩、Ｎ−ペンシル−Ｎ−メチルアミン塩
等）及び他の通常の有機塩を包含することかできる。

本発明の“ツクハマイシンＡ及びＢ”は薬理作用例えば
免疫抑制作用、抗菌作用を有し、従って心臓、腎臓、肝
臓、骨髄、皮膚等のような器官又は組織の移植拒否反応
、骨髄移植による対宿主移植片疾患、リウマチ様関節炎
、全身性エリテマトーデス、橋本甲状腺炎、多発性硬化
症、重症筋無力症、タイプＩ糖尿病、葡萄膜炎のような
自己免疫疾患等の治療及び予防に有用である。

本発明の医薬組成物は有効成分として本発明の“ツクバ
マイシンＡ及びＢ”を外用、腸内又は非経口用に適した
有機又は無機担体又は賦形剤と混和して含有する医薬製
剤の形態で例えば固体、半固体又は液体形態で使用する
ことができる。有効成分は、例えば通常無毒性の医薬的
に使用し得る担体と錠剤、ベレット、カプセル剤、生薬
、液剤、乳剤、懸濁液剤及び使用に適した他のいかなる
形態にも配合することかできる。使用することかできる
相体は水、クルコース、ラクトース、アラビアゴム、ゼ
ラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マクネシ
ウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイタル
シリカ、ジャガイモデンプン、尿素及び固体、半固体又
は液体形態の製剤を製造するための使用に適した他の担
体であり、更に助剤、安定剤、粘度付与剤、着色剤及び
香料を使用することができる。有効な目的化合物は、疾
患の過程又は症状により望ましい効果かｆ分生しる量で
医薬組成物中に包含される。

この組成物をヒトに適用するには、非経口又は経腸投与
で適用することが好ましい。“ツクバマイシンＡ及びＢ
”の治療上有効な量の投与量は治療される個々の患者の
年令及び症状によって変化するが、１日当り（体重７０
ｋｇの男性を基準として）有効成分的０．０１〜１００
０■ｇ好ましくは０．１〜５００■ｇ更に好ましくは０
．５〜１００ｍｇか一般に疾患治療に投与され１回の平
均服用量的０．５ｍｇ、　ＩＢ、　５■ｇ、　１０ｍｇ
、　５０曹ｇ、　１００ｍｇ。

２５０ｍｇ及び５００ｍｇか一般に投与される。

次の実施例は本発明を具体的に説明するために示され本
発明の範囲及び精神を限定するものとして解釈されるべ
きてはない。

支隻薯Ｊ ■ ３−バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中のＦに一３
ｌ培地４０１に斜面培養液Ｍ−６４９２（Ｓ　、ツクバ
エンシスＮｏ、９９９３）を接種して種子培養液を生産
した。接種した培地を振盪機２２０ｒｐｍで２９．０℃
に於て７２時間温叙した。

ＦＫ−８ｌ培地２５０１を含有するいくつかの３−バッ
フル付２１エルレンマイヤーフラスコに得られた培養液
２．５ｍＬを接種した。接種した培地を２２０ｒｐｍ振
盪機で２９．０℃に於て２４時間温叙した。

次いで得られた培養液７５０１を３０Ｏｎのステンレス
鋼の攪拌発酵槽中に含まれるＦＫ−３ｌ培ｊＩ！”８０
！Ｌに接種した。接種した培地を撹拌、１２０ｒｐｉ＋
エアフロー１６０１９ａ及び背圧０．７ｋｇ／ｃｍ２を
用い２９．５℃で２４時間温叙した。

４つのヒドロホイルインペラーで攪拌されるＦＫ−ＰＩ
培地１３，０００文を含む１９，０００文のステンレス
鋼発酵槽に得られた培養液１３０見を接種した。発酵は
撹拌を１００ｒｐ■エアフロー１０．５にＬ／分及び背
圧０．７ｋｇ／ｃ■”で２９．５℃に於て１０４時間行
なった。溶存酸素濃度は空気飽和５０％以上に維持した
。

メタノール（６０００文）を全ブイヨン（１２，０００
文）に激しく撹拌しながら添加した。得られた浮遊液を
ディスク遠心機によって固形分を除去した。次いで遠心
分離した水性メタノール抽出液を平行して行なったＤＩ
ＡＩＯＮ　ＩＰ−２０（三菱ケミカルス）の２本のカラ
ム（４５Ｘ　１８０ｃ■、各々約２８５１に通過させた
。各カラムをメタノール（１６００４”て溶離し目的化
合物を含む両分をプールして混合リッチカット（１４０
０１を生成した。リッチカットを真空中で最終容量８０
５Ｌに濃縮した。

水（３２０ｆＬ）を濃縮物に加え次に酢酸エチルで２回
（各２００４１　）抽出した。次いでプールした酢酸エ
チル抽出液を真空中で濃縮して重油状物質（８文）を生
成した。

濃縮した酢酸エチル抽出物をヘキサン（４文）で希釈し
ヘキサン中シリカゲル（６０〜２００メツシユ、Ｗ、Ｒ
，クレース社）のカラム（３０Ｘ９０Ｃ騰、約３５ｆＬ
）でクロマトグラフィー処理した。

カラムをまずヘキサン（２００Ｍ　）で洗浄し次にヘキ
サン：アセトン（３：１．４００１　）で溶離した。

目的化合物を含む両分をプールし真空中で濃縮して粘稠
な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製を行なった。リッチカットをダイナマッ
クス−６０Ａ　Ｃ１８カラム（２１，４ｘ　２５０■腸
、ライニンインスツルメンツ）により５５°Ｃて操作し
てクロマトクラフィー処理した。カラムをアセトニトリ
ル：水（３：２）を用いて９．９騰ｌ／分で溶離した。

溶離は２０５ナノメーターに於けるｕｖ吸光度をモニタ
ーした。！−述した抽出物の注入を繰り返している間に
化合物を集めた。目的化合物を含有する両分をプールし
真空中で濃縮し次に同一条件下でクロマトクラフィー処
理を繰り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシ ル−５０ＤＳ：ｌカラム（４，６ｘ　２５Ｌｌｓ＋＊ホ
ワツトマン）を用い５６℃て操作して逆相ＨＰＬＣによ
り分析し２０５ナノメーターに於ける紫外吸光度をモニ
ターした。カラムはアセトニトリル：水（１３ニア）を
用い１．５ｍｌ／分てイソクラチカルに溶離した。これ
らの条件下で“ツクバマイシンＡ”と呼ばれる目的化合
物（１，２７ｇ）は欧州特許庁公開番号第０１８４１６
２号に記載されるフジサワのＰＲ−９００５０６，ＦＲ
−９００５２０及びＰＲ−９００５２３と異なる保持時
間７．３６分を有した。

“ツクハマイシンＡ”はそのテトラ−（トリメチルシリ
ル）誘導体の高分解能質量分析によって確認した。ｍＨ
ｚ　”１９３．６５５６に於て分子イオン（テトラ−（
トリメチルシリル）誘導体Ｃ４４）１７１ＮＯ１２の計
算値１０９３．６５５７）とｍ／ｚ６７３及びｍ／ｚ４
８１に於て特徴的フラグメントイオンか兄られた。

全フイヨン（１２，００［Ｌ　）をディスク遠心機で遠
心分離して、培養固形分の濃縮浮遊液（２０００交）を
生成した。この浮遊液にメタノール（２００１）を激し
く攪拌しながら添加した。この抽出液をディスク遠心機
により固形分を除去し、得られた固形分をメタノール、
水（１：１．２０００４１　）で再抽出した。ディスク
遠心機を用いて固形分を除去した後、２つの水性メタノ
ール抽出液をプールし、真空中て溶媒を除去して水性濃
縮液２０００！ｌを生成した。水性濃縮液を酢酸エチル
て２回（各”＋００ＪＩ）抽出した。プールした酢酸エ
チル抽出液を真空中で溶媒を除去して重油状物質（８１
）を生成した。

濃縮酢酸エチル抽出物をヘキサン（４又）て希釈しヘキ
サン中シリカゲル（ｂＯ〜２００メツシュ、Ｗ、Ｒ，ブ
レース社）のカラム（３０ｘ９０ｃｍ、約３！ｌ　）に
よりクロマトクラフィー処理した。カラムをまずヘキサ
ン（２０（ＨＬ　）で洗浄し、次にヘキサン：アセトン
（３：１．４００１　）て溶離した。目的化合物を含む
両分をプールし濃縮して粘稠な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトクラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製を行なった。リッチカットをタイナマッ
クス−６０Ａ　Ｃ１８カラム（２１，４Ｘ２５０ｍｓ、
ライニンインスツルメンツ）により５５℃て操作してク
ロマトクラフィー処理した。カラムをアセトニトリル：
水（３：２）を用い９．９ｍｌ／分で溶離した。溶離は
２０５ナノメーターに於けるＵｖ吸光度をモニターした
。−Ｌ述した抽出物を繰り返し注入している間に化合物
を集めた。［１重化合物を含有する両分をプールし真空
中て濃縮して同一条件下でクロマトタラフィー処理を繰
り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシ ル−５０ＤＳ：ｌカラム（４，６ｘ　２５ｈａ、ホワッ
トマン）を用い５６°Ｃて操作して逆相■ＰＬＣにより
分析し、２０５ナノメーターに於ける紫外吸光度をモニ
ターした。カラムをアセトニトリル：水（１３ニア）を
用い１．５ｍｌ／分てイソクラチカルに溶離した。これ
らの条件下て“ツクバマイシンＡ”と呼ばれる目的化合
物（１，２７ｇ）は欧州特許庁公開番号第０１８４１６
２号に記載されるフシサワのＰＲ−９００５０６、ＦＲ
−９００５２０及びＦＲ−９００５２３と異なる保持時
間７．３６分を有した。

“°ツクハマイシンＡ”はそのテトラ−（トリメチルシ
リル）誘導体のプロトン及び１３Ｇ核磁気共鳴分光分析
及び高分解能質量分析によって確認した。ｍ／ｚ１０９
３．６５５６に於て分子イオン（テトラ（トリメチルシ
リル）誘導体ＩＬｎＨ７＋ＮＯ＋２の計算値１０９３．
５５５７　）及びｍ／ｚ６７３及びＩＩ／Ｚ４８１に於
て特徴的フラグメントイオンか見られた。

実」１随４ １．試）しＬ１製 上記ＨＰＬＣによって調製された“°ツクハマイシンＡ
”を無水エタノールに溶解した。

２・梃元 Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肺臓を無菌条件下て採取し、ｌ
Ｏ％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）で補足した水
冷却”ＰＭＩ　１６４０培地（ＧＩＢＣＯ，グランドア
イランド、ニューヨーク）て緩やかに解離させた。細胞
を１５０叶ｐ■で８分間遠心分離によって沈降させた。

この沈降物を塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＧＯ
）と４°Ｃて２分間処理して混入赤血球を除去した。冷
却培地を加え細胞を１５００ｒｐｍて８分間再び遠心分
離した。次いで細胞浮遊液をナイロンウールカラムで次
の通り分離してＴリンパ球を単離した。洗浄乾燥ナイロ
ンウール約４９を２０１のプラスチック注射器に充填し
てナイロンウールカラムを調製した。カラムを２５０＠
Ｆで３０分間オートクレーブにかけて滅菌した。ナイロ
ンウールカラムを加温（３７’Ｃ）培地で湿らせ、同し
培地ですすいた。加温培地に再浮遊させた洗浄肺細胞を
ナイロンクールに徐々に注いた。次いてカラムを３７°
Ｃで１時間立てたまま温置した。非付着Ｔリンパ球を加
温培地を含むカラムから溶離し、細胞浮遊液を上記の通
り繰り返した。

精製したＴリンパ球を１０％熱不活化ウシ胎仔血清、１
０”ｍＭグルタミン、１鳳Ｍピルビン酸ナトリウム、　
２Ｘ　１０−５Ｍ−メルカプトエタノール及び５０μ９
／１ゲンタマイシンを含むＲＰＭＩＩ６４０培地からな
る完全培地に２．５　ｘ１０５細胞／■ｌで再浮遊させ
た、イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｍｌ及びＰＭＡを１
０ｎｇ／ｍｌ加えた。細胞浮遊液を直ちに９６ウエル平
底ミクロ培養プレート（コスタ−）に２００μ文／ウェ
ルて分配した。次いで試験薬剤を含まない培地である対
照及び試験される試料（上述の精製“ツクバマイシンＡ
”）の以下に示される種々の希釈液を３つ組のウェルに
２０μ皇／ウエルて加えた。標準として１．−６７９，
９３４を使用した。次に培養プレートを５％ＣＯ３−９
５％空気の湿った雰囲気中で４４時間３７℃で温置した
。■リンパ球の増殖をトリチウム標識チミジンの取り込
みを測定して算定した。４４時間培養した後、細胞をト
リチウム標識チミジン（ＮＥＮ、ケンブリッジ、マサチ
ューセッツ）２μＣｉ／ウエルでパルス標識した。更に
４時間温置した後、多回式試料ハーベスタ−を用いガラ
ス繊維フィルターにより集菌した。個々のウェルに対応
するフィルターディスクの放射能を標準液体シンチレー
ション計数法（βカウンター）によって測定した。２つ
組ウェルの平均計数７分を計算し、結果は次の通りトリ
チウム標識チミジン取り込みの阻害％として表わした。

種々の濃度に於ける°“ツクハマイシンＡ　”の阻害％
の結果はその免疫抑制特性を示した。

また“ツクバマイシンＡ”によるＴ−細胞増殖の阻害は
培養の始めにＩＬ−２（組換え体ヒトＩＬ−２）　５０
単位／１を加えることによって逆になった。

１廠１ｊ 魚蓋 ３−バッフル付エルレンマイヤーフラスコ中のＦＫ−３
ｔ培地４０１に斜面培養液ＭＡ−６４９２（Ｓ。

ツクハエンシスＮｏ、９９９３）を接種して種子培養液
を生産した。接種した培地を振盪機２２０ｒｐ■で２９
．０°Ｃに於て７２時間温叙した。

ＦＫ−３ｌ培ｊｌｊ１２５０ｍｌを含有するいくつかの
３＝バツフル付１エルレンマイヤーフラスコに得られた
培養液２．５１を接種した。接種した培地を振盪機２２
０ｒｐ■て２９．０°Ｃに於て２４時間温温置た。

次いで得られた培養液７５０１を３００文のステンレス
鋼の攪拌発酵槽中に含まれるＦに一８１培地１８０１に
接種した。接種した培地を攪拌１２０ｒｐｍエアフロー
１６０ｕｐｍ及び背圧０．７ｋｇ／ｃｍ２を用い２９．
５°Ｃて２４時間温温置た。

４つのヒドロホイルインペラーで攪拌されるＦに−ＰＩ
培地１３．０００１を含む１９，００”文のステンレス
鋼発酵槽に得られた培養液１３１を接種した。発酵は撹
拌１００ｒｐ−エアフロー１Ｏ０５にＬ／分及び背圧０
．７ｋｇ／ｃｍ２を用い２９．５℃で１０４時間行なっ
た。溶存酵素濃度は空気飽和の５０％以上に維持した。

メタノール（６０００文）を全ブイヨン（１２，０００
１）に激しく攪拌しながら添加した。得られた浮遊液を
ディスク遠心機によって固形分を除去した。次いで遠心
分離した水性メタノール抽出液を平行して行なったＤＩ
ＡＩＯＮ　ＨＰ−２０（三菱ケミカルス）の２本のカラ
ム（４５ｘ１８０ｃ■、各々約２８５Ｊ１）に通過させ
た。各カラムをメタノール（１６００ｆｉ　）で溶離し
、目的化合物を含む画分をプールして混合リッチカット
（１４００ｕ　）を生成した。リッチカットを真空中で
最終容量８０文に濃縮した。

水（３２（ＤＪ　）を濃縮物に加え次に酢酸エチルで２
回（各２０ｉ）抽出した。次いでプールした酢酸エチル
抽出液を真空中で濃縮して重油状物質（８文）を生成し
た。

濃縮した酢酸エチル抽出物をヘキサン （４文）て希釈し、ヘキサン中シリカゲル（６０〜２０
０メツシユ、Ｗ、Ｒ，ブレース社）のカラムでクロマト
クラフィー処理した。カラムをまずヘキサン（２００１
）で洗浄し、次にヘキサン：アセトン（３：１．４００
５Ｌ）で溶離した。目的化合物を含む画分をプールし、
真空中で濃縮して粘稠な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製を行なった。リッチカットをダイナマッ
クス−６０Ａ　Ｃ１８カラム（２１，４Ｘ　２５０ｍｍ
、ライニンインスツルメンツ）により５５℃で操作して
クロマトクラフィー処理した。カラムをアセトニトリル
：水（３：２）を用い９．９ｍｌ／分で溶離した。溶離
は２０５ナノメータに於けるＵｖ吸光度をモニターした
。上述した抽出物の注人を繰り返している間に化合物を
集めた。目的化合物を含有する両分をプールし、真空中
で濃縮し、次に同一条件下でクロマトグラフィー処理を
繰り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシル−５０ＤＳ３カ
ラム（４，６ｘ　２５０ｍｍ、ホワットマン）を用い、
５６℃で操作して逆相ＨＰ１．Ｃにより分析し。

２０５ナノメーターに於ける紫外吸光度をモニターした
。カラムはアセトニトリル：水（１３ニア）を用い１．
５ｍｌ／分でイソクラチカルに溶離した。これらの条件
下で“ツクハマイシンＡ”と呼ばれる目的化合物は欧州
特許庁公開番号第０１８４１６２号に記載されるフジサ
ワのＰＲ−９００５０６、ＦＲ−９００５２０及びＰＲ
−９００５２３と異なる保持時間１０．２４分を有した
。

“ツクバマイシンＢ′′はプロトン及び１３Ｇ核磁気共
鳴分光分析及びそのトリ−（トリメチルシリル）誘導体
の高分解能質量分析によって確認した。■／ｚ１０２１
．６１６９に於て分子イオン（トリ−（トリメチルシリ
ル）誘導体Ｃ４４Ｈ？ＩＮＯ□の計算値１０２１．６１
６２）とｍ／ｚ６７５及びｍ／ｚ４８３に於て特徴的フ
ラグメントイオンか見られた。

全ブイヨン（１２，００１）をディスク遠心機で遠心分
離して培養固形分の濃縮浮遊液（２０００１）を生成し
た。この浮遊液にメタノール（２００［１）を激しく攪
拌しながら添加した。この抽出液をディスク遠心機によ
り固形分を除去し得られた固形分をメタノール：水（ｌ
：１．２０００１）で再抽出した。ディスク遠心機を用
いて固形分を除去した後、　２つの水性メタノール抽出
液をプールし、真空中で溶媒を除去して、水性濃縮液２
０００ｊｌを生成した。水性濃縮液を酢酸エチルで２回
（各ｔｏｏｏｌ　）抽出した。プールした酢酸エチル抽
出液を真空中で溶媒を除去して重油状物質（８文）を生
成した。

濃縮酢酸エチル抽出物をヘキサン（４交）で希釈し、ヘ
キサン中シリカゲル（６０〜２００メツシユ、Ｗ、Ｒ，
ブレース社）のカラム（３０Ｘ９０ＣＩ、約３５１）に
よりクロマトクラフィー処理した。カラムをまずヘキサ
ン（２００Ｊ２　）で洗浄し、次にヘキサン：アセトン
（３：１．４０１）で溶離した。目的化合物を含む両分
をプールし濃縮して粘稠な油状物質を生成した。

更に分取用逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ
Ｃ）により精製を行なった。リッチカットをタイナマッ
クスーｆｉＯＡ　Ｃ１８カラム（２１，４Ｘ　２５０腸
■、ライニンインスッＪレメンツ）により５５°Ｃで操
作してクロマトグラフィー処理した。カラムをアセトニ
トリル：水（３：２）を用い９．９ｍｌ／分で溶離した
。溶離は２０５ナノメーターに於けるＵｖ吸光度をモニ
ターした。上述した抽出物を繰り返し注入している間に
化合物を集めた。目的化合物を含有する両分をプールし
真空中で濃縮して同一条件下でクロマトグラフィー処理
を繰り返した。

目的化合物を含有する両分をバーチシ ル−５００Ｓ３カラム（４，６Ｘ　２５０ｍ層、ホワッ
トマン）を用い５６°Ｃで操作して逆相ＩＩ　Ｐ　Ｌ　
Ｃにより分析し、　２０５ナノメーターに於ける紫外吸
光度をモニターした。カラムをアセトニトリル：水（１
３ニア）を用い１．５ｍｌ／分でイソクラチカルに溶離
した。これらの条件で“ツクバマイシンＢ”と呼ばれる
目的化合物は、欧州特許庁公開番号０１８４”ｉ２号に
記載されるフジサワのＰＲ−９００５０６、ＦＲ−９０
０５２０及びＰＲ−９００５２３と異なる保持時間１０
．２４分を有した。

°°ツクバマイシンＢ”はそのトリ−（トリメチルシリ
ル）誘導体の高分解能質量分析によって確認した。ｍ／
ｚ１０２１．６１６９に於て分子イオン（トリ−（トリ
メチルシリル）誘導体（４，Ｉｂ＋ＮＯ＋ｔの計算値１
０２１．６１６２）及びｍ／ｚ６７５及びｍ／ｚ４８３
に於て特徴的クラクメントイオンが見られた。

ｌ−賦ｌ］匹１製 上記ＨＰ　１．Ｃによって調製された“ツタバマイシン
Ｂ”を無水エタノールに溶解した。

２、蝮笈 Ｃ５７Ｂ１／６マウスの肺臓を無菌条件下で採取し、１
０％熱不活化ウシ胎児血清（ＧＩＢＧＯ）で補足した水
冷却ＲＰＭ”６４０培地（ＧＩＢＧＯ、グランドアイラ
ンド、ニューヨーク）で緩やかに解離させた。細胞を１
５００ｒｐｍで８分間遠心分離によって沈降させた。こ
の沈降物を塩化アンモニウム溶解緩衝液（ＧＩＢＣＯ）
と４℃で２分間処理して混入赤血球を除去した。冷却培
地を加え、細胞を１５”［１ｒｐ＊で８分間遠心分離し
た。次いて細胞浮遊液をナイロンウールカラムで次の通
り分離してＴリンパ球を単離した。洗浄乾燥ナイロンウ
ール約４９を２０１のプラスチック柱射器に充填してナ
イロンウールカラムを調製した。カラムを２５０１で３
０分間オートクレーブにかけて滅菌した。ナイロンウー
ルカラムを加温（３７℃）培地で湿らせ同じ培地ですす
いた。加温培地に再浮遊させた洗沙牌細胞をナイロンウ
ールに徐々に注いた。次いでカラムを３７℃で１時間立
てたまま温置した。非付着Ｔリンパ球を加温培地を含む
カラムから溶離し、細胞浮遊液を上記の通り繰り返した
。

精製したＴリンパ球を１０％熱不活化ウシ胎仔血清、　
１００ｍＭグルタミン、　１ｍＭピルビン酸ナトリウム
、　２Ｘ　１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール及び５
０μ９／膳ｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ　１６４０
培地からなる完全培地に２．５ｘ　１０’細胞／ｍｌで
再浮遊させた。イオノマイシンを２５０ｎｇ／ｍｌ及び
ＰＭＡを１０ｎｇ／ｍｌ加えた。細胞浮遊液を直ちに９
６ウエル平底ミクロ培養プレート（コスタ−）に２００
μ交／ウエルで分配した。次いで試験薬剤を含まない培
地である対照及び試験される試料（上述の“ツクバマイ
シンＢ″）の以下に示される種々の希釈液を３つ組のウ
ェルに２０μ皇／ウエルで加えた。標準としてＦＫ−５
０６を使用した。次に培養プレートを５％Ｇｏ２−９５
％空気の湿った雰囲気中で４４時間３７℃で温置した。

Ｔリンパ球の増殖をトリチウム標識チミジンの取り込み
を測定して算定した。４４時間培養した後、細胞をトリ
チウム標識チミジン（ＮＥＮ、ケンブリッジ、マサチュ
ーセッツ）　２μＣｉ／ウエルでパルス標識した。更に
４時間装置した後、多回式試料へ−へスターを用い、ガ
ラス繊維フィルターにより集菌した。個々のウェルに対
応するフィルターディスクの放射能を標準液体シンチレ
ーション計数法（βカウンター）によって測定した。２
つ組ウェルの平均計数７分を計算し、結果は次の通りト
リチウム標識チミジン取り込みの阻害％として表わした
。

種々の濃度に於ける“ツタバマイシンＢ”の阻害％の結
果は、その免疫抑制特性を示した。

また“ツクバマイシンＢ”にょるＴ−細胞増殖の阻害は
培養の始めにＩＬ−２（組換え体ヒトＩＬ−２）　５０
単位／１を加えることによって逆になった。

手続補正書 １．事件の表示 平成１年特許願第２３１７８７号 ２、発明の名称 新規な免疫抑制剤化合物 ３、補正をする者 本件との関係

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ−細胞増殖検定によりＴ−細胞活性化の阻害が陽
   性を示し、テトラ−（トリメチルシリル）誘導体として
   高分解能質量スペクトル分子イオン（ｍ／ｚ）１０９３
   ．６５５６とｍ／ｚ６７３及び４８１に於て特徴的フラ
   グメントイオンを示す免疫抑制剤“ツクバマイシンＡ”
   。 ２、医薬的に使用し得る実質的に無毒性の担体又は賦形
   剤と共に“ツクバマイシンＡ”の治療上有効な量を含有
   する医薬組成物。 ３、“ツクバマイシンＡ”の治療上有効な量をヒト宿主
   に投与することを特徴とする移植拒否反応を防止するた
   めに該宿主を治療するか又は自己免疫疾患又は感染症を
   治療する使用方法。 ４、窒素栄養源を含む炭水化物水性培地中で浸漬好気性
   条件下で微生物ストレプトミセスツクバエンシスＮｏ．
   ９９９３（ＦＥＲＭ　ＢＰ−９２７）を発酵させる工程
   を包含し、該条件がｐＨ約７で行なわれ、“ツクバマイ
   シンＢ”を回収するＴ−細胞増殖検定によりＴ−細胞活
   性化の阻害が陽性を示しトリ−（トリメチルシリル）誘
   導体と して高分解能質量スペクトル分子イオン （ｍ／ｚ）１０２１．６１６９とｍ／ｚ６７５及び４８
   ３に於て特徴的フラグメントイオンを示すＦＫ−５０６
   のＣ−２１プロピル類似体である免疫抑制剤“ツクバマ
   イシンＢ”の製造方法。