JPH02258786A - Ｌ―６７９，９３４の微生物変換産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規免疫抑制剤Ｌ−６８３，５１９及び微生
物未同定放線菌（ＭＡ　６４７４）ＡＴＣＣ阻５３８２
Ｂを用いたその産生のための発酵方法に関する。本方法
は、Ｌ−６７９，９３４の構造を転位及びモノ脱メチル
化しうる条件下でその微生物及びＬ　−６７９，９３４
を培養することを含む。自己免疫疾患、感染疾患の治療
及び／又は臓器移植拒絶の予防に関するヒト宿主におけ
るその使用方法も開示されている。

１９８３年に米国ＦＤＡは、臓器移植手術の分野に革命
をおこすシクロスポリン及び非常に有効な抗拒絶剤につ
いて認可した。その薬物は、体の免疫系がその真人な蓄
積物である在来の保護剤を動員して外来のタンパク賞を
拒絶するのを阻害することにより作用する。

その薬物の移植拒絶と戦う上で有効であるが、それは多
くの場合に非常に深刻な腎不全、肝障害及び潰瘍をおこ
す欠点がある。

参照によってその内容を本明細書に組入れたこととする
フジサワの欧州特許公開第１８４．１６２号明細書では
、シクロスポリンよりも１００倍有効といわれる新規マ
クロライド系免疫抑制剤ＦＫ　−５０６について記載し
ている。そのマクロライドは、特定株ストレプトミセス
・ツクバエンシス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｐ。

ｍｙｃｅｓ　ｔｓｕｋｕｂａｅｎｓ：ｓ）の発酵によっ
て産生される。

Ｓ、ヒゲロスコピカス（Ｓ、　ｈｙｇｒｏａｃｏｐｉｃ
ｕｓ）亜種ヤクシマエンシス（ｙａｋｕＳｈｉｍａｅｎ
ｓｉｓ）から産生される密接に関連したマクロライド系
免疫抑制剤についても記載されている。

Ｔ、アライの米国特許第３，２４４．５９２号明細書で
は、抗カビ剤“アスコマイシン”を産生ずるストレプト
ミセスヒゲロスコピカス変種アスコミセチカス（ａｓｃ
ｏｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）の培養について記載している。

しかしながら、シクロスポリンの副作用を実質上欠くい
かなる免疫抑制剤の産生に関しても文献中に記載がない
。

より少ない副作用を示す更に新規で安全な薬物について
は、本分野で常に探索されている。

新規免疫抑制剤Ｌ−６８３，５１９は液内好気性条件下
窒素栄養素含有水性炭水化物培地中マクロライド系免疫
抑制剤Ｌ−６７９，９３４の存在下における微生物未同
定放線菌（ＭＡ　６４７４）ＡＴＣＣＮｌ１５３８２８
の発酵によって得られることが判明したが、上記条件は
Ｌ−６７９，９３４を選択的にモノ脱メチル化しく即ち
、１３位メトキ・シ基を除去する）かつ六員ピラニル環
から五員フラニル環（ヒドロキシルは１４位に存在する
）への転位をおこすために十分な時間にわたり９Ｈ８，
０以下、例えば約７で行われる。

得られたＬ−６８３，５１９は、本明細書中“Ｔ細胞増
殖アッセイ”とも呼ばれるカルシウムイオン透過担体（
イオノマイシン）＋フォルバールミリステートアセテー
ト（ＰＭＡ）誘導Ｔ細胞刺激アッセイで証明されるよう
な免疫抑制活性、即ちＴ細胞活性化の正の阻害を示す、
このアッセイの原理は、イオノマイシン＋ＰＭＡの組合
せで刺激されるマウス下リンパ球の増殖性を測定するこ
とである。このアッセイにおける陽性サンプルは、トリ
チウム化チミジン取込み量低下で示されるようにＴ細胞
増殖を阻害する。

本発明によれば、液内好気性発酵条件下窒素栄養素含有
水性炭水化物培地中でＬ−６８３，５１９産物を産生ず
る上で十分な時間にわたりＬ　−６７９，９３４と共に
未同定放線菌（ＭＡ　６４７４）ＡＴＣＣ磁５３８２Ｂ
株を培養することにより産生され、Ｌ−６８３，５１９
として同定される免疫抑制剤が提供される。

新規免疫抑制剤Ｌ−６８３，５１９はＴ細胞増殖アッセ
イでＴ細胞活性化の正の阻害を示し、第１図で＊Ｖｔさ
れるようなプロトン核磁気共鳴スペクトル図及びＦＡＢ
ｉ量スペ多スペクトル分析れるような分子量７８９を示
す。

液内好気性発酵条件下窒素栄養素含有水性炭水化物培地
中ｐＨ８，０以下でＬ−６８３，５１９を産生ずる上で
十分な時間にわたりＬ　−６７９，９３４と共に放線菌
（Ｍへ６４７４）　ＡＴＣＣ阻５３８２８株を培養する
工程を含むＬ−６８３，５１９として同定される免疫抑
制剤の産生方法も更に提供される。

しかも、Ｌ−６８３，５１９を含有した上記方法で産生
されるブイヨンが提供されるが、このブ・イヨンはＴ細
胞増殖アッセイでＴｍ、胞活性化の正の阻害を示す。

加えて、上記方法で産生される免疫抑制剤産物も提供さ
れる。

薬学上許容され実質上無毒性の担体又は賦形剤と共に治
療有効量のＬ−６８３，５１９を含有した医薬組成物も
提供される。

加えて、治療有効量のＬ−６８３，５１９を宿主に投与
することからなる、移植拒絶を防止するためヒト宿主を
治療し又は自己免疫疾患もしくは感染疾患を治療するた
めの使用方法が提供される。

本発明では、Ｌ−６８３，５１９を産生ずるためし−６
７９、９３４と共に未同定放線菌（ＭＡ　６４７４）　
ＡＴＣＣ隘５３８２８の発酵を要する。この微生物は、
メリーランド州ロックビル、バークローンドライブ１２
３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ
ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃ
ｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣＮ１５３８２８として
及びニューシャーシー州ローウェイのメルク・カルチャ
ー・コレクション（ＭｅｒｃｋＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１
１ｅｃｔｉｏｔｉ）にＭＡ　６４７４としてブダペスト
条約に従い現在制限寄託されている。形態学的、培養的
、生物学的及び生理学的特性を含めた物理的特性及び分
類は以下で簡単に記載されているにれまでに行われた分
類学的分析に基づき、培養物は未同定放線菌として一応
決定された。更に分類学的特性がこの生物の属及び種を
最終的に決定するために試験されている。

この培養物は、（２８及び３７℃）酵母麦芽エキス寒天
、グリセロールアスパラギン寒天無機塩デンプン寒天、
オートミル寒天、ザベックードソクス（Ｃｚａｐｅｋ−
Ｄｏｘ）　、ザベック溶液寒天、ペプトン寒天及びベネ
ット（Ｂｅｎｎｅｔｔ’　ｓ）寒天を含めた日常的寒天
上においてすべて２８℃で十分に増殖する。

長■−この培養物は径約０．７６μの分岐繊維状菌糸体
として増殖する。コロニーは不透明、隆起状で、でこぼ
こしている。コロニーのテキスチャーは酵母麦芽エキス
寒天の場合ゴム様であるが、菌糸体の顕著な断片化が観
察される他の培地の場合にはバター様となる傾向がある
。コロニー表面は外観上粒状となる傾向がある。拡散性
の色素は観察されなかった。

ｍ−主に短鎖であって、径４〜２５μのサイズである。

胞子嚢は通常２１日目までに目視され、グリセロールア
スパラギン寒天の場合にはゆ着する傾向がある。胞子は
平滑端の桿状形（０，７６×１．０μ）で非運動性であ
り、長さ１５０μ以内の非分岐状長鎖として生じる。

栄養増殖：背面：タン皮包、表面：タン皮包、隆起増殖
着生菌糸体（Ａｅｒｉａｌ　Ｍｙｃｅｌｉｕｍ）　：希
薄、白色、粉末状 可溶性色素：なし 栄養増殖：淡黄色、粒状、平坦、１つのプレートは増殖
周辺部で清澄化しているこ とを示す。

着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし 腔」 栄養増殖：黄色、平坦、粒状 着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし グ！セロ−ルアスパーギン 栄養増殖：背面：乳黄色、平坦、粒状、表面二同様 着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし 、　声−−゛ンブン夾 栄養増殖：黄色、平坦、粒状 着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし 末１累±ユ之ｌｌ天 栄養増殖：背面：タン皮包 着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし チロシンの分解：多増殖領域で観察される。

ス土ム亙灰叉寒天 栄養増殖：黄タン皮包、平坦、粒状 着生菌糸体ｚなし 可溶性色素：淡褐色 カゼインの加水分解；優良 エキス−エキス 栄養増殖；背面：タン皮褐色、表面：タン皮褐色、隆起
、しわ状 着生菌糸体：灰白色、粉末状 可溶性色素：なし 宋ｌ寒仄。

栄養増殖：黄タン皮包、隆起、しわ状、粒状着生菌糸体
：なし 可溶性色素：なし 末１１ヱヱ１之Ｊ仄 栄養増殖：黄タン皮包、隆起、しわ状、粒状着生菌糸体
：なし 可溶性色素：なし デンプンの加水分解：良好 トマトペースト−オー　ミール兼 栄養増殖：１つのプレートは暗黄色栄養増殖のしわ状で
′盛上り”隆起を示す。第 二のプレートは集密的黄褐色しわ状 増殖及び分離した暗黄色しわ状“盛 上り”コロニーを示す。

着生菌糸体二上記第ニブレート上において薄白色着生菌
糸体 可溶性色素：なし 差ｌ±ｆｆｉ 栄養増殖：なし 着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし ゼラチンの液化：なし ペプトン−−エキス寒 栄養増殖二橙褐色隆起しわ状のでこぼこした端着生菌糸
体：なし 可溶性色素：なし メラニン；陰性 Ｈａｓ　　：陰性 ザベ　クー′　クス集 栄養増殖：無色 着生菌糸体：なし 可溶性色素：なし ｌブ　クー　　エキスブイヨン 可溶性色素：なし 災素■且立 ブリダム−ゴツトリーブ（Ｐｒ３ｄｈａｔｓ−Ｇｏ　ｔ
　ｔｌ　１ｅｂ）基本培地＋１％炭素源；“ストレプト
ミセス種の特徴化方法”、インターナショナル・ジャー
ナル・オブ・システマティフク・バクテリオロジー（Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、第
１６巻、第３号、第３１３−３４０頁。

１９６６年７月での標準に従−い等線分けした。

ＮＳ（無炭素源）　　　　　　　　　　　微増殖α−Ｄ
−グルコース　　　　　　　　　優良増殖（陽性コント
ロール） Ｄ−アラビノース　　　　　　　　　　　　　＋１、−
アラビノース　　　　　　　　　　　　千〇−フルクト
ース　　　　　　　　　　　　　丑し−グルコース イノシトール α−Ｄ−ラクトース β−〇−ラクトース Ｄ−マルトース　　　　　　　　　　　　　尋り〜マン
ニトール　　　　　　　　　　　　イーＤ−マンノース
　　　　　　　　　　　　　　＋Ｌ−マンノース Ｄ−ラフィノース Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　　　　　　＋スクロ
ース Ｄ−キシロース　　　　　　　　　　　　　　→ト■４
−キシロース 他に指摘のない限り、２８℃で３週間のインキュベート
後にすべての読取りを行う。全培地のｐＨはほぼ中性（
６，８〜７．２）である。

本発明の方法は放線菌のいずれの“Ｌ　−６８３，５１
９産生”株でも行えるが、ＡＴＣ（Ｊｋ１５３８２８株
が特に好ましい。

一般にＬ　−６８３，５１９は、同化性炭素及び窒素源
含有水性栄養培地中Ｌ−６７９，９３４の存在下、好ま
しくは液内好気性条件下（例えば、振盪培養、湾内培養
等）で上記“Ｌ−６８３，５１９産生株”を培養（発酵
）することによって産生ずることができる。

水性培地は、発酵プロセスの開始時及び終了（収集）時
にｐ）Ｉ約７で維持することが好ましい。高ｐＨの場合
には、生成物の実質的及び／又は全体的損失を招く。望
ましいｐＨは、モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）
、モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等のよう
な緩衝剤の使用又は下記産生培地のように本質的に緩衝
性を有する栄養物質の選択によって維持される。

栄養培地中で好ましい炭素源は、グルコース、キシロー
ス、ガラクトース、グリセリン、デンプン、デキストリ
ン等のような炭水化物である。含有可能な他の供給源は
、マルトース、ラムノース、ラフィノース、アラビノー
ス、マンノース、サリシン、コハク酸ナトリウム等であ
る。

好ましい窒素源は、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、
グルテンミール、綿実ミール、大豆ミール及び他の植物
性ミール（部分的又は全体的脱脂）、カゼイン加水分解
物、大豆加水分解物及び酵母加水分解物、コーン・ステ
イープ・リカー、乾燥酵母、小麦麦芽、フェザ−ミール
、ピーナツ粉、ジスチラーズ・ソリューブルス等、並び
にアンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸
等のような無機及び有機窒素化合物である。

炭素及び窒素源は有利には組合せて用いられるが、痕跡
量の増殖因子及び多量のミネラル栄養素を含有した非純
粋物質も使用に適することから、それらの純粋な形で用
いられる必要はない。所望であれば、炭酸ナトリウム又
はカルシウム、リン酸ナトリウム又はカリウム、塩化ナ
トリウム又はカリウム、ヨウ化ナトリウム又はカリウム
、マグネシウム塩、銅塩、コバルト塩等のような媒質無
機塩に加えてもよい。必要であれば、特に培地が過度に
発泡する場合、流動パラフィン、脂肪油、植物油、鉱油
又はシリコーンのような脱泡剤も加えてよい。

Ｌ　−６７９，９３４出発物質は、１９８８年８月５日
付発行米国特許出願第２２９　、３６４号（ケース１７
７６８）明細書で記載されたようなアクチノブラナセア
エ（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎａｃｅａｅ）ＡＴＣＣＩ’ｈ
５３７７０の発酵又はフジサワの欧州特許公開第１８４
，１６２号明細書で記載されたよう上Ｓ、ツタバエンシ
スＮ１９９９３の発酵（Ｌ−６７９，９３４と同一のＰ
Ｒ−９００５０６、即ち“ＦＫ−５０６”を産生ずるた
め）により得られるが、上記参考文献はこの具体的目的
の参考のため本明細書に組込まれる。

Ｌ−６８３，５１９の大量産生条件のためには、液内好
気性培養条件が好ましい、少量産生の場合には、フラス
コ又はボトル中での振盪又は表面培養が用いられる。更
に、増殖が大タンクで行われる場合には、Ｌ−６８３，
５１９の産生プロセスで増殖遅滞を避けるため産生タン
ク中で接種用に増殖型の生物を用いることが好ましい。

したがって、最初に“斜面″で産生された生物の胞子又
は菌糸体で比較的少量の培地に接種し“種培地”とも呼
ばれる上記接種培地を培養することにより生物の増殖接
種原を産生じ、しかる後培養された増殖性接種原を無菌
的に大タンクに移すことが望ましい。接種原が産生され
る発酵培地はＬ−６８３，５１９の産生に用いられる培
地と実賞上同−であるか又は異なっており、接種前に培
地を滅菌するため通常オートクレーブ処理される。培地
のｐＨは、通常オートクレーブ処理工程前に好ましくは
緩衝液の形で酸又は塩基の適切な添加によりｐＨ８，０
以下、例えば約７．０に調整される。

培養混合物の攪拌及び通気は様々な方法で行うことがで
きる。攪拌は、プロペラ又は同様の機械的攪拌装置で、
発酵槽を回転又は振盪することにより、様々なポンプ駆
動装置であるいは培地への無菌空気導入により行われる
。通気は、発酵混合物中に無菌空気を通じることにより
行われる。

発酵は約１０〜２０時間にわたり通常約２０〜４０℃、
好ましくは２５〜３５℃の温度で行われるが、発酵条件
及び規模に応じて変動する。好ましくは、産生培養物は
ロータリーシェーカー上２２Ｏｒｐｍ、２７℃で約２４
時間インキュベートされるが、その場合に発酵培地のｐ
Ｈは収集まで７．０で維持される。

発酵を行うために好ましい培養／産生培地としては下記
培地がある： １１皿八 へキストロース デキストリン 牛肉エキス アルゾミンｐｔ＋ ＮＺアミンタイプＥ ＭｇｓＯａ　　・７　ＨｔＯ にｚＩ（ＰＯａ ｐＨ７，１に調整 ＣａＣＯｘ　Ｏ−５ｇ　／　ｌ添加 斐遺壇逍旦 グルコース 酵母エキス 牛肉エキス ０ＰＳ ｐＨ７，２に調整 産生されたＬ−６８３，５１９は、他の公知の生物学的
活性物質の回収のために通常用いられる常法に従い培地
から回収することができる。産生された１１仝Ｌ １．０ ｉｏ、。

３．０ ５゜０ ５．０ ０、０５ ０．３７ １！６Ｌ １１．６ Ｌ−６８３，５１９物質は培養菌糸体及び濾液中に゛み
られ、したがって菌糸体及び濾液から単離及び精製する
ことができるが、これは減圧濃縮、凍結乾燥、メタノー
ル等のような慣用的溶媒での抽出、ｐＫｔ１４整、慣用
的樹脂（例えば、陰イオン又は陽イオン交換樹脂、非イ
オン吸着樹脂等）での処理、慣用的吸着剤（例えば、活
性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナ等〉
での処理、結晶化、再結晶化等のような常法で培養ブイ
ヨンを濾過又は遠心することにより得られる。好ましい
方法は、特にメタノールを用いる溶媒抽出であろう発酵
産物Ｌ−６８３，５１９は“ｒ細胞増殖アッセイ”で陽
性の免疫抑制活性を示し、これに基づく有用性をもち、
下記物理的特性を示す： １、　白色非晶質粉末 ２、　メタノールに可？容性 ３、ＦＡＢ質量スペクトル分析で測定される分子量７８
９であって、第１図で特定された分子構造と一致する。

上記発酵プロセスに従い得られるＬ−６８３，５１９は
、例えば抽出、沈殿、分別結晶化、再結晶化、クロマト
グラフィー等のような常法で単離及び精製することがで
きる。

本物質の適切な処方剤は、酢酸エステルのように、分子
上のヒドロキシ基を介して形成されたし−６８３，５１
９の慣用的な薬学上許容される生物学的不安定エステル
を含有していてもよい。

前記発酵反応及びその発酵混合物の後処理においてＬ　
−６８３，５１９へミケタノール環系の転位によるＬ　
−６８３，５１９の互変性転位異性体も本発明の範囲内
に含まれることに留意すべきである。

本発明のＬ−６８３，５１９は免疫抑制活性、抗菌活性
等のような薬理学的活性を有しており、したがって心臓
、腎臓、肝臓、骨髄、皮膚等のような臓器又は組織の移
植拒絶、骨髄移植による移植片対宿主疾患、リウマチ様
関節炎、全身性狼癒、紅斑狼癒、橋本氏甲状腺炎、多発
硬化症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ブドウ膜炎等のよ
うな自己免疫疾患の治療及び予防に有用である。

本発明の医薬組成物は、外用、腸内又は非経口向に適し
た有機又は無機担体又は賦形剤と共に活性成分として本
発明のＬ−６８３，５１９を含有する例えば、固体、半
固体又は液体形の医薬製剤の形で用いることができる。

活性成分は、錠剤、ベレット、カプセル、坐剤、溶液、
乳濁剤、懸濁剤及び使用に通したいずれかの他の形の場
合において例えば通常の無毒性の薬学上許容される担体
と配合される。使用可能な担体は固体、半固体又は液体
形の製剤を製造する場合使用に適した水、グルコース、
ラクトース、アラビアゴム、ゼラチン、マンニトール、
デンプンペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コ
ーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトス
ターチ、尿素及び他の担体であって、更に補助剤、安定
剤、増粘剤、着色剤及び芳香剤も使用可能である。活性
対象化合物は、疾患の処１又は症状に望ましい効果を与
えるために十分な量で医薬組成物中に含有される。

この組成物をヒトに適用する場合には、非経口又は腸内
投与でそれを適用することが好ましい。

治療有効量のＬ−６８３，５１９の用量は治療すべき個
々の各患者の年令及び症状により変動しかつ依存するが
、１日量（男性７０ｋｇに基づき計算した場合）約０．
０１〜１０００■、好ましくは０．１〜５００■、更に
好ましくは０．５〜１００■の活性成分が疾患を治療す
るため通常投与され、約０．５■、■噂、５＋ａ＋ｒ、
１０ｍｇ、５ＯＮ、１００■、２５０■及び５００■の
平均１回分用量が通常投与される。

下記実施例は本発明を説明する目的で示されており、本
発明の範囲又は精神に関する制限として解釈すべきでは
ない。

実施例１ 微生立及−級鹿灸■ 凍結乾燥培養物（ＭＡ　６４７４　’）　ＡＴＣＣ１ｋ
５３８２８を用いて、デキストリンＩ　Ｑ、　０％、デ
キストロース１．０％、牛肉エキス３．０％、アルゾミ
ンｐ１（〔イースト・プロダクツ社（Ｙｅａｓｔ　Ｐｒ
ｏｄｕｃｔｓ、　　Ｉｎｃ）３５．０％、Ｎ−Ｚアミン
タイプＥ５．０％、ＭｇＳＯ４・７１１ｚｏ　ｏ、　０
５％、ＫＨｚＰＯｓ　ｃ、　３７％及びＣａＣ０゜０、
５％（ｇ／ｉ！の単位）からなるオートクレーブ処理（
滅菌）種培地Ａ３０−含有２５（ｌｄパフフル付振盪フ
ラスコに接種した。種培地のｐＨをオートクレーブ前７
．１に調整した。種をロータリーシェーカー上２２０ｒ
ｐ…、２７℃で７２時間種培地中においてインキュベー
トした。一方、凍結栄養菌糸体又は斜面培養源が用いら
れる場合には、培＼ 獲物を２２Ｏｒｐｍ、２７℃でｎ゛、１、時間種培地中
においてインキュベートする。得られた種培地の一部５
゜Ｏｍｌを用いて、下記のオートクレーブ（滅菌）処理
済変換培地Ｂ５０−含有２５〇−無バソフル振盪フラス
コに接種した。Ｌ−６７９，９３４をジメチルスルホキ
シド溶液として加え、濃度０．１■／　ｍｌの最８！−
濃度に調整した。次いで、振盪フラスコ内容物をロータ
リーシェーカー上２２０ｒｐｍ、２７℃で７２時間イン
キエベートした。

１、変換培地Ｂはグルコース１０．０、酵母エキス１．
０、牛肉エキス１０．　ＭＯＰＳＩ　１．６　（ｇ／Ｉ
Ｉ）を含有していた；ｐＨはオートクレーブ処理前７．
２に８周整された。

７’（ａｙ（７）”−０＝　　’１作 変換培地Ｂの全ブイヨン（１００ｄ）を塩化メチレン（
３ｘ２００ｄ）で３回抽出した。塩化メチし・ン抽出液
を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥し、油状残渣に減圧濃
縮した。残渣をアセトニトリルに溶解し、高性能液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）精製に付した。

ＨＰ　Ｌ　Ｃはワットマン・パーティシル（Ｗｈａｔｍ
ａｎＰａｒｔｉｓｉｌ）　　１０　０ＤＳ−３の９，４
ｍｍＸ２５Ｃｆｆｉカラムで行い、６０℃において２０
５ｎｍ及び２２５ｎｍでモニターした。カラムは０．１
％水性ＨｓＰＯａＣｌ（３ＣＮ　５５　：　４５〜０．
１％水性Ｈ３Ｐ０ａ−ＣＨ３ＣＮ２０：８０の直線勾配
で４０分間３１Ｒ１，／ｗｉｎにて展開した。化合物は
上記抽出液の繰返し２注人中に集めた。保持時間１４．
８分の分画をプールし、ｐＨ６，５に調整し、蒸発させ
てアセトニトリルを除去した。化合物をＣｌセプーパン
ク（Ｓｅｐ−Ｐａｋ）　（ウォーターズ１アソシエーツ
（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｓ５ｏｃ：ａｔｅｓ）〕及びアセト
ニドυルー水溶離液で更に精製し、し−６８３，５１９
として示される住成物１．８ｎｖを得た。

苛立 Ｌ−６８３，５１９はＮ　Ｍ　Ｒスペクトル分析で特徴
付けられ、第１図のプロトンＮＭＲスペクトル図を示し
たが、そこでは特定された分子構造も含んでいる。

質量スペクトルは分子量７８９と一致した。ＨＰＬＣ及
びＮＭＲの双方は、２種以上のＬ−６８３゜５１９が平
衡状態で存在することを示している。

実施例２ 上記ＨＰＬＣで得られるような精製Ｌ−６８３，５１９
を無水エタノールに１ｆｆｆ／−で熔解した。

２、アッセイ Ｃ５７Ｂ１／６マウス由来牌臓を無菌条件下で取り出し
、１０％熱不活化生胎児血清〔ギブコ（ＧＩＢＣＯ））
補充氷冷ＲＰ旧１６４０培地にューヨーク州グランドア
イランドのギブコ）に穏やかに分離した。細胞を１５０
０　ｒｐｍで８分間の遠心によりベレット化した。塩化
アンモニウム溶離緩衝液（ギブコ）で２分間４℃にてペ
レットを処理することにより、混入赤血球を除去した。

冷培地を加え、細胞を再度１５００　ｒｐｍで８分間遠
心した。次いで、Ｔリンパ球を下記のようにナイロンウ
ールカラムでの細胞懸濁液の分離により単離した：洗浄
乾燥されたナイロンウール約４ｇを２０−プラスチック
シリンジに充填することによりナイロンウールカラムを
調製した。カラムを２５０　’Ｆ（約１２１℃）で３０
分間オートクレーブ処理して滅菌した。ナイロンウール
カラムを加温く３７℃）培地で湿潤し、同一培地で洗浄
した。加温培地に再懸濁された洗浄肺臓細胞をナイロン
ウールに徐々に通用した。次いで、カラムを直立位置で
３７℃にて１時間インキュベートした。非付着Ｔリンパ
球を加温培地でカラムから溶離し、細胞懸濁液を上記の
ようにスピンさせた。

精製Ｔリンパ球を１０％熱不活化牛脂児血清、１００ｍ
Ｍグルタミン、ｌｌ１１Ｍピルビン酸ナトリウム、２Ｘ
１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール及び５０μｇ／Ｉ
Ｒ１ゲンタマイシンを有するＲＰ旧１６４０培地からな
る完全培地に細胞２．５Ｘ１０’／−で再懸濁した。イ
オノマイシンを２５０ｎｇ／−で及びＰＭＡをＬｏｎｇ
／−で加えた。細胞懸濁液を９６ウエル平底微量培養プ
レート〔コースタ−（Ｃｏｓ　ｔａｒ）　３中に２００
μｌ／ウエルで直ちに分配した。次いで、試験薬物なし
の培地たる対照及び試験すべきサンプル（上記精製Ｌ　
−６８３，５１９）の様々な下記希釈液を２０　ｔｔ　
ｌ　／ウェルで同じ３つのウェルに加えた。Ｌ　−６７
９，９３４を標準として用いた。次いで、培養プレート
を５％ＣＯ２−９５％空気の湿気雰囲気中３７℃で４４
時間インキュベートした。

Ｔリンパ球の増殖性は、トリチウム化チミジン取込み量
の測定により評価された。培養４４時間後、細胞をトリ
チウム化チミジン（マサチューセソツ州ケンブリッジの
ＮＥＮ）２μＣｉ／ウエルで瞬間標識した。更に４時間
のインキュヘート後、多数サンプル収集器を用いて培養
物をガラスファイバーフィルターで収集した。個々のウ
ェルに対応するフィルターディスクの放射能を標準液体
シンチレーションカウント法（ベータカウンター）で測
定した。反復ウェルの平均カウント数／ｍｉｎを計測し
、結果を下記のようにトリチウム化チミジン取込み（増
殖）の聞書率として示した：Ｌ　−６８３，５１，９の
様々な１】変時における阻害率％の結果は下記表で示さ
れている： 表 Ｌ−６８３，５１９によるＴ ｋ遅Ｊバシ」−（ｎ　ｇ　／　ｎ　ｍ　）５０．０ ３３．０ ２２．０ １５．０ ９．９ ６．６ ４．４ ２．９ １．９ １．３ ０．８７ ０．５８ の ■五岸±− 注；１．　　マウスＴ細胞培養物を４８時間後の収集の
４時間前に３１１−チミジンで瞬間標識した。

２、標準Ｌ　−６７９，９３４（１０ｎｇ／ｄ）は９９
％阻害を示した。

３、　　Ｌ−６８３，５１９の場合１ｃｓｏ　＝　１．
７ｎｇ／ｍｔ’＝　２．２　ｎＭ、通常２．０〜４．Ｏ
Ｘ　１０−９モルの範囲 ４、　増殖阻害は組換えヒトＩＬ−２５０，ｉｊｉ位／
−の添加で逆転された。

【図面の簡単な説明】

第１図はＣＤＣｌ　ｆｆ中４００Ｍ）ｌｚで測定された
Ｌ６８３．５１９の１８核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクト
ル図であって、Ｌ−６８３，５１９に関して特定された
化学構造も示されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｔ細胞増殖アッセイでＴ細胞活性化の正の阻害、第
   １図で示されるようなプロトン核磁気スペクトル図及び
   ＦＡＢ質量スペクトル分析で測定されるような分子量７
   ８９を示す、Ｌ−６８３，５１９と称される免疫抑制剤
   。 ２、第１図で示されるような分子構造を有する免疫抑制
   剤Ｌ−６８３，５１９。 ３、薬学上許容される実質上無毒性の担体又は賦形剤と
   共に治療有効量のＬ−６８３，５１９を含有した医薬組
   成物。 ４、液内好気性発酵条件下、窒素栄養素含有水性炭水化
   物培地中、ｐＨ８．０以下で、Ｌ−６８３，５１９を産
   生する上で十分な時間にわたり放線菌ＡＴＣＣＮｏ．５
   ３８２８株を培養する工程を含む、Ｌ−６８３，５１９
   として同定される免疫抑制剤の産生方法。 ５、Ｌ−６８３，５１９を含有した請求項４記載の方法
   で産生されるブイヨンであって、 Ｔ細胞増殖アッセイによりＴ細胞活性の正 の阻害を示すことを特徴とするブイヨン。 ６、請求項４記載の方法で産生される免疫抑制剤産物。 ７、移植拒絶を防止するためヒト宿主を治療し又は自己
   免疫疾患もしくは感染疾患を治療するための使用方法で
   あって、 上記宿主に治療有効量のＬ−６８３，５１９を投与する
   ことを特徴とする方法。