JPH06153975A - Ｃ−３１デスメチルｆｒ−９００５２０環式ヘミケタール免疫抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【構成】 窒素養分を含有する水性炭水化物培地中、
深部好気性発酵条件下で、ストレプトマイセス ラベン
デューレ（Streptomyces lavendulae)の菌株を、化合物
Ｉを製造するのに十分な時間、ＦＲ−９００５２０と共
に培養することを含む、ＦＲ−９００５２０のＣ−３１
デスメチル、Ｃ−１９／Ｃ−２２環式ヘミケタール生物
変換アナログ（化合物Ｉ）の免疫抑制剤の製造方法。 上記の方法で得られた化合物Ｉを含む医薬組成物なら
びに化合物Ｉの有効量をヒトに投与することによるヒト
の移植拒否反応の防止または自己免疫疾患を治療する方
法。 【効果】 上記マクロライド免疫抑制剤は、ヒトの非自
己臓器移植（例えば骨髄移植、肝移植、肺移植、腎移
植、心移植）拒否を防止するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＦＫ−５０６型
免疫抑制剤であるＦＲ−９００５２０（ＦＫ−５２０）
のＣ−３１デスメチル、Ｃ−１９／Ｃ−２２環式ヘミケ
タール類似体、化合物Ｉ、新規な微生物ストレプトマイ
セス ラベンデューレ（Streptomyceslavendulae) ＡＴ
ＣＣ５５２０９号を利用する、その製造のための新規な
発酵方法に関する。当該方法は、ＦＲ−９００５２０の
Ｃ−３１脱メチル化およびＣ−１９／Ｃ−２２環式ヘミ
ケタール形成を誘発する条件の下に、ＦＲ−９００５２
０の存在下で当該微生物を培養することから成る。ま
た、メチル転移酵素であるＤＩＭＴを用いて、化合物Ｉ
を酵素的にメチル化することにより製造される、化合物
ＩのＣ−３１メチル化誘導体（化合物IIと呼ぶ）も開示
される。さらにまた、自己免疫疾患、感染症の治療およ
び／または臓器移植拒否反応の予防のためのヒト被治療
主についてのその使用方法が開示される。

【０００２】

【従来の技術】１９８３年に米国食品医薬局はシクロス
ポリンを承認したが、これは、臓器移植外科領域におい
て革命を引き起こした、非常に効果的な抗拒絶剤であっ
た。この薬剤は、生体の免疫システムが、移植片の外来
蛋白を排除するために、その生まれ持つ防御剤の膨大な
兵器工場を稼働させるのを抑制する。

【０００３】この薬剤が移植拒絶反応との戦いにおいて
効果的であるのと同程度に、それは、腎不全、肝障害、
潰瘍（多くの場合非常に重篤である）を引き起こす副作
用をもつ。

【０００４】藤沢薬品のヨーロッパ特許公報第０１８４
１６２号明細書（本書に参考として記載）は、シクロス
ポリンより１００倍も有効される新規なマクロライド免
疫抑制剤ＦＫ−５０６を開示している。このマクロライ
ドは、ストレプトマイセスツクバエンシス（Streptomyc
es tsukubaensis) の特定の株の培養により製造され
る。またストレプトマイセスヒグロスコピカス（hygros
copicus)亜種ヤクシマエンシス（yakushimaensis) によ
って製造される非常に近縁なマクロライド免疫抑制剤、
ＦＲ−９００５２０も開示されている。ＦＫ−５２０お
よびイムノマイシンなる用語は、また、ＦＲ−９００５
２０の同義語としてメルク社により使用されている。

【０００５】T. Arai の米国特許第３，２４４，５９２
号明細書は、ＦＲ−９００５２０と同じ化合物であるこ
とが示された、抗菌性の“アスコマイシン”を製造する
ためのストレプトマイセス ヒグロスコピカス変種アス
コミセティカス（ascomyceticus)の培養を開示する。

【０００６】しかしながら、実質的に副作用を示さな
い、またはシクロスポリンと同様な副作用を示さない、
ＦＫ−５０６型のいずれの免疫抑制剤の製造についても
文献に記載が無い。

【０００７】この点に関して、新規なＦＫ−５０６型の
免疫抑制剤の研究が続けられている。

【０００８】新規なＦＫ−５０６免疫抑制剤、化合物Ｉ
は、窒素栄養分を含有する水性炭水化物培地中で好気的
浸漬条件下、pHおよそ７で、ＦＲ−９００５２０をＣ−
３１脱メチル化し、Ｃ−１９／Ｃ−２２環式ヘミケター
ル形成を誘発するに十分な条件下で、マクロライド免疫
抑制剤、ＦＲ−９００５２０と共に微生物ストレプトマ
イセスラベンデューレＡＴＣＣ５５２０９号を培養する
ことにより得られることが発見された。

【０００９】生じた化合物Ｉは、ＦＫ−５０６免疫抑制
活性、すなわち、カルシウムイオン透過担体（イオノマ
イシン ionomycin) とホルボールミリステートアセテー
ト（ＰＭＡ）誘発Ｔ細胞活性化アッセー（また本明細書
中においてＴ細胞増殖アッセーとも呼ぶ）により示され
るような、Ｔ細胞活性化抑制陽性を示す。

【００１０】このアッセーの原理は、F. Dumont らによ
り J. Immunology（１４４巻、２５１−２５８ページ、
１９９０）に記載されたように、アイオノマイシン＋Ｐ
ＭＡの組み合わせで活性化されたマウスのＴリンパ球の
増殖を測定するものである。このアッセーで陽性の薬
剤、例えばＦＫ−５０６は、トリチウム化チミジンの取
り込み減少によって示されるように、Ｔ細胞増殖を抑制
する。

【００１１】さらに、ＤＩＭＴ（メチル転換酵素）によ
る化合物Ｉの酵素的メチル化により製造される、化合物
ＩのＣ−３１メチル化類似体であって、化合物IIと称さ
れる化合物が開示される。

【００１２】本発明に従えば、化合物Ｉとして特定され
る、新規なＦＫ−５０６免疫抑制剤の製造方法が提供さ
れる。該製造方法は、窒素源を含む水性炭水化物培地中
で好気的浸漬培養条件下において、化合物Ｉを産生する
に十分な時間、ストレプトマイセス ラベンデューレＡ
ＴＣＣ５５２０９号をＦＲ−９００５２０と共に培養す
ることから成る。

【００１３】さらに上記の方法により製造され、Ｔ細胞
増殖アッセーによりＴ細胞活性化抑制陽性を示し、さら
に、図１に示されるようなプロトン核磁気共鳴スペクト
ルを示し、また図１に特定されるような帰属構造を有す
る、新規なＦＫ−５０６免疫抑制剤、化合物Ｉが提供さ
れる。

【００１４】また、医薬的に許容できる、実質的に無毒
な担体または賦形剤と組み合わされた、化合物Ｉの治療
的有効量を含有する医薬組成物が提供される。

【００１５】さらにまた、Ｔ細胞増殖アッセーによりＴ
細胞活性化抑制陽性を示し、図２に示されるようなプロ
トン核磁気共鳴スペクトルを示し、また図２に特定され
るような帰属構造を有する、新規なＦＫ−５０６免疫抑
制剤、化合物IIが提供される。

【００１６】また、医薬的に許容できる、実質的に無毒
な担体または賦形剤と組み合わされた、化合物IIの治療
的有効量を含有する医薬組成物も提供される。

【００１７】さらに、移植拒絶を防ぐためにヒトホスト
を治療するための使用方法、または自己免疫患者もしく
は感染症治療のための使用方法が提供される。該使用方
法は、当該ホストに、治療的有効量の化合物Ｉもしくは
IIを投与することから成る。

【００１８】さらにまた、ストレプトマイセス ラベン
デューレＡＴＣＣ５５２０９号の生物学的に純粋な微生
物が提供される。

【００１９】本発明は、化合物Ｉの製造のために、ＦＲ
−９００５２０と共にストレプトマイセス ラベンデュ
ーレＡＴＣＣ５５２０９号を培養することから成る。該
微生物は、現在ブタペスト条約の規定に従い、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（メリーランド、ロッ
クビル、パークローンドライブ１２３０１）にＡＴＣＣ
５５２０９号として寄託されている。該微生物は、また
メルクカルチャーコレクションでＭＡ６９５４として保
持されている。形態学的、培養学的、生物学的および生
理学的諸特性を含み、その物質的性質およびその分類を
下に簡単に述べる。

【００２０】下記は、免疫調節剤、ＦＲ−９００５２０
を化合物Ｉに変換する、ストレプトマイセス ラベンデ
ューレＡＴＣＣ５５２０９号の一般的な記述である。増
殖、一般的な培養特性および炭素源利用についての観察
は、ShirlingとGottleibの方法（Internat. J. System.
Bacteriol. １６：３１３−３４０）に従い実施した。
菌体の化学組成は、Lechevalier と Lechevalier (Acti
nomycete Taxonomy 、Ａ．Dietz D. W. Thayer編、工業
微生物学会、１９８０）の方法を用いて決定した。培養
の呈色は、インターソサイエティ色彩評議会−中央事務
局のスタンダードセントロイドカラーチャート（Inter-
Society Color Council-National Bureau of Standards
Centroid Color Charts) 〔米国商務省中央事務局ＮＢ
Ｓサーキュラー＝スタンダードサプリメント、５５３、
１９８５（US Dept. of CommerceNational Bureau of S
tandards Supplement to NBS Circular) 〕に収められ
ているカラースタンダードとの比較により決定した。

【００２１】由来−この微生物は Piscataway （ニュー
ジャージー）で採取した土壌サンプルから分離した。

【００２２】細胞壁組成の分析−ペプチドグリカンは、
ＬＬ−ジアミノピメリン酸を含む。

【００２３】一般的増殖特性−酵母麦芽エキス寒天培地
（ＹＭＥ）、無機塩澱粉寒天培地、オートミール、トリ
プチケース大豆寒天培地およびペプトン鉄寒天培地で増
殖良好。グリセロールアスパラギン寒天培地で中等度の
増殖。ツァペック氏寒天培地およびＮＺ−アミン（Shef
ield Chemical Co.)補充水道水寒天培地では増殖不良。
トリプトン酵母エキスブロスでも増殖。２７℃および３
７℃で増殖。

【００２４】コロニーの形態−（ＹＭＥで２１日）：下
層菌糸体はかすかに黄褐色。気中菌糸体は白色。胞子塊
は豊富で、色は桃色がかった灰色である。コロニーは不
透明で隆起し、周縁は葉状である。ざらざらした表面を
有し、弾力性のあるテクスチャーを示す。

【００２５】微小形態−気中菌糸体（０．７６μｍ）は
下層菌糸体から生じ、分枝していて微かに湾曲してい
る。成熟培養では（接種後７〜２８日）、気中菌糸体
は、湾曲した胞子鎖で終わり、時折、鉤状、ループ状ま
たは伸展した螺旋状の末端を有する。この特徴は気中増
殖の強い部分で特に顕著である。胞子形成は、ＹＭＥ、
無機塩−澱粉寒天培地、グリセロールアスパラギン寒天
培地、ＮＺ−アミン補充水道水寒天培地およびツァペッ
ク氏寒天培地で生じる。

【００２６】その他の生理学的反応−ペプトン−鉄寒天
培地で H₂Sを発生する。ＴＹブロスおよびペプトン鉄寒
天斜面培地でメラノイド色素を産生する。澱粉は弱く加
水分解される。炭素源利用パターンは以下の通り：セロ
ビオース、α−Ｄ−グルコース、Ｄ−マルトース及びＤ
−マンノースは中等度の利用；Ｄ−フラクトース、α−
Ｄ−ラクトース及びβ−Ｄラクトースの利用は低度；Ｄ
−アラビノース、Ｌ−アラビノース、イノシトール、Ｄ
−マンニトール、Ｄ−ラフィノース、Ｌ−ラムノース、
スクロース、Ｄ−キシロース又はＬ−キシロースの利用
は無し。

【００２７】鑑別−細胞壁の分析により、ＡＴＣＣ５５
２０９号はタイプＩの細胞壁を有することが示される。
形態学的研究により、当該培養は湾曲性の胞子体上に胞
子の長い鎖を生じ、時折、ループ状、鉤状または伸展螺
旋状の末端を有する。胞子体は気中菌糸体から生じる。
これらは、ストレプトマイセスに属する株に典型的な特
徴である。

【００２８】ＡＴＣＣ５５２０９号の表現形のデーター
と分類学の文献に正式に発表されたストレプトマイセス
の種（下記文献１−７）のそれとの比較により、この株
は、ストレプトマイセス ラベンデューレ、ストレプト
マイセス バージニエ（Streptomyces virginiae)、ス
トレプトマイセス フラボトリシニ（Streptomycesflav
otricini) 、ストレプトマイセス ゴシキエンシス（St
reptomyces goshikiensis) 、ストレプトマイセス コ
ロンビエンシス（Streptomyces colombiensis) に非常
に類似していることが分かる。これらの種は、灰色系ま
たは赤色系のいずれかに分類され、特異的にループ状、
鉤状または螺旋状末端を有する湾曲性の胞子体を形成す
る。殆どのものはメラノイド色素を産生し、さらに、す
べてのものが、本質的に同一の炭素源利用パターンを示
す。ストレプトマイセス バージニエ、ストレプトマイ
セス フラボトリシニ、ストレプトマイセス ゴシキエ
ンシスおよびストレプトマイセス コロンビエンシス
は、現在、ストレプトマイセス ラベンデューレ（７）
の本質的な同義語であると考えられている。これらの結
果に基づき、ＡＴＣＣ５５２０９号はストレプトマイセ
ス ラベンデューレの新規な株であると考えられる。

【００２９】参考文献 1. E.B. Shirling, D. Gottlieb : Int. J. System Bac
teriol. 18:69(1968) 2. E.B. Shirling, D. Gottlieb : Int. J. System Bac
teriol. 18:279(1968) 3. E.B. Shirling, D. Gottlieb : Int. J. System Bac
teriol. 19:391(1969) 4. E.B. Shirling, D. Gottlieb : Int. J. System Bac
teriol. 22:265(1972) 5. H.J. Nomura : Ferment. Technol. 52:78(1974) 6. T. Pridam, H. Tresner : Bergey's Manual of Dete
rminative Bacteriology, 第８刊、R. E. Buchanan, N.
E. Gibbons 編、Williams and Wilkins社刊、バルチモ
ァ(1974) 7. R. Loci : Bergy's Manual of Systematic Bacterio
logy, ４巻、St. Williams, M. E. Sharpe, J. G. Holt
編、Williams and Wilkins社刊、バルチモァ(1989)

【００３０】 ＡＴＣＣ第５５２０９株の２１日間の炭水化物利用パターン 炭素源 ATCC 55209による利用 Ｄ−アラビノース ０ Ｌ−アラビノース ０ セロビオース ２ Ｄ−フルクトース １ イノシトール ０ α−Ｄ−ラクトース １ β−Ｄ−ラクトース １ Ｄ−マルトース ２ Ｄ−マンニトール ０ Ｄ−マンノース ２ Ｄ−ラフィノース ０ Ｌ−ラムノース ０ スクロース ０ Ｄ−キシロース ０ Ｌ−キシロース ０ α−Ｄ−グルコース（コントロール） ２ ─────────────────────────────── ３＝良好な利用 ２＝中等度の利用 １＝貧弱な利用 ０＝利用せず

【００３１】 ＡＴＣＣ ５５２０９号の２１日間の培養の特性 培地 ATCC 55209 ATCC 55209号の 可溶性 裏面の色 号の増殖量 気中菌糸体 色素 ─────────────────────────────────── 酵母エキス 良好 気中菌糸体桃灰色 認めず 微かに黄味がかっ 麦芽エキス (10 pk Gray) た褐色(74s.yBr) 微かに湾曲性の末端が 鉤状およびループ状の 鎖に胞子は生じる グルコース 普通 気中菌糸体桃灰色 認めず 黄白色 アスパラギン (10 pk Gray) (92 y. White) 微かに湾曲性の末端が 時に鉤状およびループ 状の鎖に胞子は生じる 無機塩 良好 気中菌糸体桃灰色 認めず 黄白色 澱粉 (10 pk Gray) (92 y. White) 多数の鉤状およびルー プを有する微かに湾曲 性の鎖に胞子は生じる 澱粉は弱く加水分解さ れる オートミール 良好 気中菌糸体桃灰色 認めず 黄白色 (10 pk Gray) (92 y. White) 鉤状およびループを有 する微かに湾曲性の鎖 に胞子は生じる 澱粉は弱く加水分解さ れる 水道水 不良 黄白色 認めず 黄白色 (92 y. White) （９２ ｙ． Ｗ
ｈｉｔｅ） 鉤状、ループおよび螺 旋を有する微かに湾曲 性の鎖に胞子は生じる ツァペック 不良 黄白色 認めず 黄白色 （９２ ｙ． Ｗｈｉｔｅ） (9
2 y. White) 湾曲性気中菌糸体 ペプトン鉄 良好 −−− メラニン陽性 −−− H₂S 陽性

【００３２】本発明の方法は、化合物Ｉを産生するスト
レプトマイセス ラベンデューレのいずれの株でも実施
できるが、特に好ましいものは、ＡＴＣＣ５５２０９号
である。

【００３３】一般には、化合物Ｉは放線菌（Actinomyce
te) 株を、同化可能炭素および窒素源を含有する水性栄
養培地中で、好ましくは好気的浸漬条件下で（例えば震
盪培養、深部培養）培養する（発酵させる）ことによっ
て製造することができる。水性培地は、発酵プロセスの
開始時および終了時（採取時）にpHが７に維持されてい
るのが好ましい。これより高いpHは、産生物の実質的お
よび／または全体的な損失につながる。上記の所望のpH
は、ホルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、モルホリ
ノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）等のような緩衝剤を
使用するか、または本質的に緩衝作用を有する栄養物質
（例えば以下に記載するような産生用培地）を選択する
ことにより維持できる。

【００３４】栄養培地の好ましい炭素源は、グルコー
ス、キシロース、ガラクトース、グリセリン、澱粉、デ
キストリン等の炭水化物である。他のソースで含むこと
ができるものは、マルトース、ラフィノース、マンノー
ス、サリシン、琥珀酸ナトリウム等である。

【００３５】好ましい窒素源は、酵母エキス、肉汁エキ
ス、ペプトン、グルテンミール、ひき割り綿実、碾り割
り大豆および他の植物性碾り割り（部分的に又は完全に
脱脂されたもの）、カゼイン水解物、大豆水解物および
酵母水解物、コーンスティープリカー、乾燥酵母、麦
芽、フェザーミール、ピーナツパウダー、醸造家可溶成
分等の他、アンモニウム塩（例えば硝酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、ウレア、
アミノ酸等の無機および有機窒素化合物である。

【００３６】炭素源および窒素源は、組み合わせて都合
よく用いることができるが、不純物を含まないものを使
用する必要はない。なぜならば痕跡量の増殖因子および
少なからぬミネラル栄養物を含む純度の高くない物質も
使用に適しているからである。所望の場合には、培地に
鉱物塩（例えば炭酸ナトリウムもしくはカルシウム、リ
ン酸ナトリウムもしくはカリウム、塩化ナトリウムもし
くはカリウム、ヨー化ナトリウムもしくはカリウム、マ
グネシウム塩、銅塩、コバルト塩等）を添加しても良
い。必要により、特に培養液が非常に泡立つ場合は、消
泡剤（例えば液体パラフィン、脂肪油、植物油、ポリプ
ロピレングリコール、鉱物油またはシリコーン）を加え
ても良い。

【００３７】ＦＲ−９００５２０（メルクはＦＫ−５２
０と称している）出発物質は、米国特許第３，２４４，
５９２号明細書に記載されているように、ストレプトマ
イセス ハイグロスコピカス変種アスコミセティクスＡ
ＴＣＣ１４８９１号の培養により、またヨーロッパ特許
公報第０１８４１６２号（藤沢）および米国特許第４，
８９４，３６６号明細書に記載されているように、スト
レプトマイセス ハイグロスコピカス亜種ヤクシマエン
シス７２７８号を培養してＦＲ−９００５２０を産生さ
せることにより得ることができる。

【００３８】大量に化合物Ｉを産生させる条件について
は、好気的浸漬培養条件が好ましい。少量の産生には、
フラスコまたは瓶での震盪培養または表層培養を用いる
ことができる。さらに大容量のタンクで増殖させる場合
には、化合物Ｉの産生過程において増殖遅滞を避けるた
めに、製造用タンクに接種する微生物は発育形を用いる
ことが好ましい。従って、まず最初に、斜面寒天培地で
増殖した微生物の胞子または菌糸体を比較的少容量の培
養液に接種し、この接種された培地（種培地と呼ぶ）を
培養することにより、発育形の接種用微生物をつくり、
それからこの増殖させた接種用発育形をタンクに無菌的
に移すことが望ましい。接種菌を増殖させる発酵用培地
は実質的に化合物Ｉの産生に使用されるものと同一でも
異なっていても良く、一般には接種前に滅菌のためにオ
ートクレーブにかける。培地のpHは、一般にはオートク
レーブの操作の前に、適切に酸または塩基を、好ましく
は緩衝液の形で添加し、およそ７．０に調整する。

【００３９】培養混合物の攪拌および通気は、様々な方
法で達成することができる。攪拌は、プロペラもしくは
同様な機械的攪拌装置により、種々のポンプ装置によ
り、発酵槽を回転または震盪することにより、または培
地中に滅菌空気を通すことにより達成できる。通気は発
酵混合物に滅菌空気を通すことにより実施できる。

【００４０】発酵は、通常約２０℃と４０℃の間の温度
において、好ましくは２５〜３５℃において、約１０時
間から２０時間行われるが、この時間は発酵条件および
発酵規模により異なる。好ましくは産生用培地は２７℃
において１７時間、２２０rpm の回転シェーカー上で培
養され、この培地のpHは採取時まで７．０に維持され
る。

【００４１】発酵を行うための好ましい増殖／産生用培
地には以下の培地が含まれる。 種培地 ｇ／リットル デキストロース １．０ デキストリン １０．０ 牛肉エキス ３．０ アルダミンpH ５．０ ＮＺアミンタイプＥ ５．０ MgSO₄ ・７H₂O ０．０５ K₂HPO₄ ０．３７ pHを７．１に調整 CaCO₃ を０．５ｇ／リットル添加 転換培地Ｂ ｇ／リットル グルコース ２０ ソヤミール ５ イーストオートライセート ５ ＮａＣｌ ５ ＭＥＳ ９．８ pHを７．０に調整

【００４２】産生された化合物Ｉは、既知の他の生物学
的活性物質を回収するために通常使用される慣用的な手
段により培養培地から回収できる。産生された化合物Ｉ
物質は、培養菌糸体およびロ液に見いだされ、従って、
菌糸体および濾液から分離、精製できる。化合物Ｉは、
培養ブロスの濾過、遠心分離によって、また減圧下での
濃縮、凍結乾燥、慣用的な溶媒（メタノール等）による
抽出、pH調節、慣用的な樹脂（陰イオンもしくは陽イオ
ン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等）による処理、慣用
的な吸着剤（活性炭、珪酸、シリカゲル、セルロース、
アルミナ等）による処理、結晶化、再結晶化等の慣用的
な手段により得ることができる。好ましい方法は溶媒抽
出、特にメタノールを用いるものである。

【００４３】発酵の産生物、化合物Ｉは、「Ｔ細胞増殖
アッセー」によるＦＫ−５０６免疫抑制活性に対して拮
抗活性を示し、これに基づく有用性をもつ。さらに以下
の物質的特性を有する。 １．白色無定形粉末 ２．メタノール可溶性 ３．分子量７９３（ＦＡＢ質量分光分析により決定、測
定Ｍ＋Ｌｉ＝８００）は、図１の帰属構造と一致する。

【００４４】上に説明したような発酵過程により得られ
た化合物Ｉは、慣用的な方法（例えば抽出、沈澱、分画
結晶化、再結晶化、クロマトグラフィー等）で分離、精
製できる。

【００４５】上記発酵反応およびその発酵混合物の後処
理中において、化合物Ｉの非対称性炭素原子または二重
結合のために、化合物Ｉの相似形および／または立体異
性体が、場合によっては、他の相似形および／または立
体異性体に変換されるかもしれないが、そのような場合
もまた本発明の範囲に含まれるということは留意される
べきである。

【００４６】さらに、特異的にかつ優先的に化合物Ｉの
Ｃ−３１ヒドロキシル基をメチル化して化合物IIを生じ
る、新規な酵素、３１−０−デスメチル−イムノマイシ
ン０−メチル転移酵素（ＤＩＭＴ）が開示される。該酵
素は、ストレプトマイセスハイグロスコピカス変種アス
コミセティクスＡＴＣＣ５５０８７号から抽出できる。
活性形の該酵素を用い、Ｍｇ⁺²イオンを補ってメチルド
ナーであるＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の存在
下で、化合物ＩをＣ−３１メチル化して化合物IIを得る
ことができる。

【００４７】開示される酵素は無細胞系または精製酵素
として用いることができる。精製ＤＩＭＴは、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥで測定されたように分子量が約３２Ｋダルト
ン、等電点（ＰＩ）は４．４で、Ｍｇ⁺²イオンが補充さ
れたとき、メチル転移剤の存在下、Ｃ−３１ヒドロキシ
を含むＦＫ−５０６型分子のＣ−３１ ０−メチル化を
触媒することができる。

【００４８】該酵素は、微生物ストレプトマイセス ハ
イグロスコピカス変種アスコミセティクスＡＴＣＣ５５
０８７号から分離でき、酵素として使用するために実施
例に記載されたような方法で精製できる。

【００４９】該酵素は、水性溶媒中で、開示されたＤＩ
ＭＴ酵素の存在下に、Ｍｇ⁺²イオンを補い、化合物Ｉを
メチル転移剤（例えばＳ−アデノシルメチオニン）と接
触させる工程を含む、化合物ＩのＣ−３１ヒドロキシル
基をメチル化するための方法に有用である。

【００５０】一般には、この方法はおよそ７〜９の間の
pHで、２５〜４０℃の温度範囲内で実施される。水性溶
媒系は一般には、pH＝７〜８のリン酸緩衝液である。Ｍ
ｇ⁺²イオンは可溶性マグネシウム塩、例えば塩化マグネ
シウム、硫酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム等と
して補充される。

【００５１】化合物IIの分離、精製は、実施例において
記載されたように、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣを含む慣用
的な技術により達成できる。

【００５２】該酵素は、化合物ＩのＣ−３１ヒドロキシ
ル基のみをメチル化することにおいて特異的である。

【００５３】本発明に含まれる化合物の構造には以下の
ものが含まれる。

【化１】

【化２】

【化３】

【００５４】ＦＲ−９００５２０免疫抑制剤は、ヨーロ
ッパ特許出願第０１８４１６２号明細書（藤沢）におい
て開示されており、メルクのものと番号付において多少
異なる。すなわち、

【化４】 付与された化学名は、１７−エチル−１，１４−ジヒド
ロキシ−１２−〔２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシ
シクロヘキシル）−１−メチルビニル〕−２３−２５−
ジメトキシ−１３，１９，２１，２７−テトラメチル−
１１，２８−ジオキサ−４−アザトリシクロ〔２２．
３．１．０⁴,⁹ 〕オクタコス−１８−エン−２，３，１
０，１６−テトラオンである。

【００５５】本発明の化合物ＩおよびIIは、薬理学的に
免疫抑制活性を有し、したがって、心臓、腎臓、肝臓、
骨髄、皮膚等の組織もしくは臓器の移植、骨髄移植によ
る移植片対宿主反応の治療および予防のために、またリ
ュウマチ性関節炎、全身性狼瘡紅斑、橋本甲状腺炎、多
発性硬化症、重症性筋無力症、糖尿病タイプＩ、葡萄膜
炎等の自己免疫疾患の治療および予防のために設定され
た、ＦＫ−５０６型治療を含む治療プログラムにおいて
有用である。

【００５６】本発明の医薬組成物は、医薬的調製物の形
態、例えば固形、半固形または液体として用いることが
できる。この医薬的調製物は、外用、内服用または注射
用に適した、有機もしくは無機の担体もしくは賦形剤の
混合物として、活性成分として本発明の化合物Ｉまたは
IIを含むものである。活性成分は、例えば、錠剤、小丸
薬、カプセル、座薬、水薬、乳剤、懸濁剤およびその他
の使用に適した剤形のための通常の無毒な医薬的に許容
できる担体と混ぜ合わせても良い。用いることができる
担体は、水、グルコース、ラクトース、アラビアゴム、
ゼラチン、マンニトール、澱粉ペースト、三珪酸マグネ
シウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド
状シリカ、馬鈴薯澱粉、尿素および、固形、半固形また
は液状形の調製物を製造するために適したその他の担体
である。さらに、補助剤、安定剤、膨張剤、着色剤およ
び香料も使用できる。活性を有した目的化合物は、疾患
の進行度または状態に応じて所望の効果を発揮するに十
分な量で、医薬組成物に含まれる。

【００５７】ヒトにこの組成物を適用するには、非経口
投与または内服により投与するのが好ましい。化合物Ｉ
またはIIの治療的に有効な投与量は、治療される個々の
患者年齢、状態で変化し、またそれらに依存するが、一
日の投与量（体重７０kgの成人に換算）として、およそ
０．０１−１０００mgで、好ましくは０．１−５００m
g、より好ましくは０．５−１００mgの活性成分が、疾
患の治療のために一般には与えられる。さらに一回の投
与量は、平均して一般におよそ０．５mg、１mg、５mg、
１０mg、５０mg、１００mg、２５０mg、５００mgであ
る。

【００５８】以下の実施例は、本発明を詳述するための
ものであり、本発明の範囲または神髄を制限するものと
して解釈されるものではない。

【００５９】実施例１ 微生物および培養条件 培養、ＡＴＣＣ５５２０９号の凍結バイアルを、デキス
トリン１０．０、デキストロース１．０、牛肉エキス
３．０、アルダミンＰＨ（Yeast Product, Inc.)５．
０、Ｎ−ＺアミンタイプＥ５．０、MgSO₄7H₂O ０．０
５、KH₂PO₄ ０．３７、CaCO₃ ０．５（単位はｇ／ｌ）
から成る、オートクレーブした（滅菌した）種培地５０
mlを有する、２５０ml容量のバッフル付き震盪フラスコ
に接種するために使用した。種接地のpHは、オートクレ
ーブする前に７．１に調節した。この種を種培地中で２
７℃で２４時間、ロータリーシェーカー上で２２０ppm
で回転させながらインキュベートした。生じた種培地の
２．５ml量を、予めオートクレーブした（滅菌した）下
記の発酵培地５０mlを含む、２５０ml容量のバッフル無
しの震盪フラスコに接種するために使用した。

【００６０】大豆−グルコース接地 グルコース ２０．０ ソヤミール ５．０ イーストオートライセート ５．０ NaCl ５．０ ＭＥＳ ９．８ pHを７．０に調節

【００６１】ＦＲ−９００５２０は、ジメチルスルホキ
シド溶液として添加し、最終濃度を０．０５mg／mlとし
た。震盪フラスコの内容は、その後２２０rpm で回転さ
せながら、４８時間、２７℃でインキュベートした。

【００６２】分離と精製 全ブロス（２５０ml）を塩化メチレンで三度抽出した
（３Ｘ２５０ml）。塩化メチレン抽出物を集め、硫酸ナ
トリウム上で乾燥させ、真空下で油状残留物となるまで
濃縮した。この残留物をメタノールに溶かし、高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に付した。ＨＰＬＣ
は、室温でワットマンマグナム２０パーティシル１０
（Whatman Magnum 20 Partisil 10 ）ＯＤＳ−３カラム
（２２．１mmＩＤ×２５cm）で実施し、２０５nmでモニ
ターした。カラムは、０．１％リン酸中の３５％から８
０％のアセトニトリルの直線状濃度勾配で、７ml／分、
６５分間で展開した。上記の抽出物を繰り返し注入しな
がら、該化合物を採取した。保持時間５７分の分画をプ
ールし、pHを４．０に調節し、アセトニリトルを蒸発除
去した。Ｃ１８ Sep Pak（Watera Associate) を用いて
脱塩し、４mgの化合物Ｉを得た。

【００６３】分析スペクトルデーター ＡＴＣＣ ＃５５２０９培養とＦＲ−９００５２０をイ
ンキュベートして得られた、本題の化合物Ｉ生物変換産
物の質量スペクトルデーターは、図１のスペクトルに示
されたようなＮＭＲデーターと併せて、下記の付与分子
構造（Ｉ）（図１にも示されている）と一致し、該構造
のＣ−３１デスメチルおよびＣ１９／Ｃ−２２環式へミ
ケタール特性を明らかにするものである。

【化５】

【００６４】Ｃ−３１デスメチル環状化構造（Ｉ）と一
致する、上記の生物変換産物のＮＭＲ分析の重要な特色
は、以下の事項により与えられる。 １．Ｈ−３１のダウンフィールド移行に基づき該３１−
OCH₃に付与されたメトキシの損失。 ２．１９−メチルが存在しない。 ３．誘導１９−メチルに合理的に付与された、新規な C
H₂O の存在（３．７４ppm 、４．０６ppm Jgem: １６H
z）。 ４．典型的な２３−メチレンシグナルが無い。 ５．アップフィールド移行したＨ−２１。 ６．Ｈ−２０の０．６ppm ダウンフィールド置換および
そのビシナルカップリング定数が９からおよそ７Hzに減
少。

【００６５】２２ケトンの還元は上記４、５の事項によ
り暗示される。一方、プロトンＮＭＲスペクトルでは、
１９−ＣＨ₂０Ｈと１９−ＣＨ₂０Ｒとの判別ができなか
った。Ｈ−２０のゆらぎ（事項６）は、環状構造を提唱
している。いくつかの可能性を考えると、Ｉは、ＮＭＲ
およびＭＳの観察結果と完全に一致する（すなわち、二
つの質量単位の増加は、メトキシルの損失および酸素の
取り込みによって説明される）。

【００６６】実施例２ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニンの分離と特性：３１−
０−デスメチルイムノマイシン ０−メチル−転移酵素 イムノマンシン（構造は上記参照）は、効果的な免疫抑
制および抗黴活性を有する、新規なマクロサイクリック
ラクトン／ラクタム抗生物質である（ヨーロッパ特許公
報第０３２３８６５号（１９８９）、F. J. Dumontら参
照) 。本研究所の前駆体供給研究により、このマクロサ
イクリック構造のポリケチドの性質が明らかにされた。
さらに、供給研究のデーターから、１３、１５および３
１位の三つのメチル基は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオ
ニン（ＳＡＭ）を介してメチオニンから生じることが示
された。３１−０−デスメチルイムノマイシンを産生す
る、ストレプトマイセス ハイグロスコピクス変種アス
コミセティクス（ＭＡ６６７４）の変異株の探索によ
り、酵素、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：３１−０
−デスメチルイムノマイシン０−メチル転移酵素（ＤＩ
ＭＴ）の分離および特性を明らかにすることができた。

【００６７】微生物の増殖および菌糸体調製 ストレプトマイセス ハイグロスコピクス変種アスコミ
セティクス（ＡＴＣＣ５５０８７）の凍結発育形菌糸体
を種培地および発酵培地で培養した。菌糸体細胞を７２
時間で採取し、０．５ＭのＫＣｌを含む５０mMのリン酸
緩衝液（pH７．５）で三度洗浄し、最後にＫＣｌを含ま
ない同様の緩衝液で洗浄した。洗浄菌糸体を無細胞系抽
出の調製物用に使用した。

【００６８】菌糸体増殖とイムノマイシン産生のタイム
コース 種々の時間間隔で、発酵培養の適量を２０００rpm で１
０分間遠心し、沈澱した細胞の容積を求めた。同様に適
量をメタノールで抽出し、イムノマイシン産生をＨＰＬ
Ｃで定量した。

【００６９】Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：３１−
０−デスメチルイムノマイシン ０−メチル−転移酵素
（ＤＩＭＴ）アッセーと産生物同定 ５０mMリン酸緩衝液（pH７．５）中に、０．０２５mMの
３１−デスメチルイムノマイシン、１mMの MgSO₄および
種々の量の酵素源を含む１mlの混合物中でアッセーを実
施した。１nmole の¹⁴Ｃ−ＳＡＭ（Ｓ−アデノシル−Ｌ
−〔メチル−¹⁴Ｃ〕メチオニン（特異活性４６mCi ／mm
ole)の添加により、反応を開始させた。混合物全体を３
４℃２０分間インキュベートし、酢酸エチルを添加して
反応を終了させた。反応生成物を２mlの酢酸エチルで抽
出し、該抽出物の１mlをＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析に使
用した。放射性反応生成物（イムノマイシン）の分析の
ために、酢酸エチル抽出物に標準イムノマイシンを導入
し、プラスチック支持層を有するプレートでＴＬＣを行
った。このプラスチックシートをクロロホルム：メタノ
ール（９：１）で展開し、紫外線下で標準イムノマイシ
ンを示す領域を切り出し、この切り出した小片の放射能
活性を測定した。生成産物の量を測定放射能から計算し
て求めた。酵素反応生成物のＨＰＬＣ分析のためには、
いくつかの酵素反応混合物を集めて、その抽出物を、上
記のようにＴＬＣ分析に付した。標準イムノマイシンと
同一のRf値を有するバンドが有る。シリカゲルプレート
上の領域を掻き取り、酢酸エチルで溶出させた。該酢酸
エチル抽出物を水で洗浄し、窒素下で乾燥させ、残留物
を、溶出溶媒としてアセトニトリル：水：リン酸（６
５：３５：０．１）を用い、パーティシル５−ＯＤＳ−
３カラムでＨＰＬＣ分析に付した。１mlづつ分画し、各
分画の一部の放射能を調べた。

【００７０】３１−０−メチル転移酵素（ＤＩＭＴ）の
分離 （すべての操作は冷蔵室または氷上で４℃で実施し
た。）洗浄菌糸体を１mMのＰＭＳＦおよび１mg／mlのリ
ゾチームを含む、５０mMのリン酸緩衝液（pH７．５）に
浮遊させ、この浮遊液を一晩攪拌し、１５０００rpm で
３０分遠心した。このようにして得た沈澱物を、マイク
ロチップ搭載音波発振装置で３０秒間隔で２分間超音波
処理した。この細胞ホモジネートを上記のように遠心
し、上清を集め、１０５Ｋ×ｇで４５分間、再遠心し
た。該上清を１％硫酸ストレプトマイシンに移し、３０
分間攪拌して、上記のように１０５Ｋ×ｇで４５分間遠
心した。生じた上清（粗抽出物と呼ぶ）に０．１mMのＳ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）および１０％
エタノールを、その後ストレプトマイセスフラディエ
（Strepomyses fradiae)、タイロシン産生微生物（N.
J. Bauernら、J. B. C.２６３巻、１５６１９ページ
（１９８８）参照）からメチル転移酵素分離のために提
唱された緩衝系を加えた。粗抽出物をそれから３０％飽
和硫酸アンモニウムに移し、３０分攪拌後、１５０００
rpm で３０分遠心した。生じた上清を６０％飽和硫酸ア
ンモニウムに移し、同様に攪拌、遠心した後、その沈澱
物を回収した。この分画（３０％−６０％カットと呼
ぶ）を、ＰＤ−１０ファルマシアカラムを用いて、１mM
のＰＭＳＦ、０．１mMのＳＡＭおよび１０％エタノール
を含む５０mMリン酸緩衝液（pH７．５）（緩衝液Ｌと呼
ぶ）に対して透析した。この分画をＤＥＡＥ−セファロ
ース含有カラムでクロマトグラフィーに付した。このカ
ラムを種々の濃度のＫＣｌを含む緩衝液Ｌで段階的に溶
出させた。ＤＩＭＴ活性は、０．３Ｍ ＫＣｌを含む緩
衝液で完全に溶出した。該ＤＩＭＴ活性分画を、緩衝液
Ｌで透析し、これを、先に同一の緩衝液で平衡化させ
た、調製用MonoQ ＨＲ１０／１０−ＦＰＬＣカラムに
かけた。緩衝液Ｌ中の０から１ＭのＫＣｌの直線状濃度
勾配を用いて、６０ml／時間の流速で１３０分間溶出さ
せ、１mlの分画を集め、ＤＩＭＴ活性を調べた。ＤＩＭ
Ｔ活性を示す分画をプールし、必要な処理を施した後、
分析用 MonoQ ＨＲ５／５−ＦＰＬＣカラムに付した。
ＫＣｌ濃度が０．５Ｍ以外は上記と同様に、このカラム
を展開し、分画のＤＩＭＴ活性を調べた。活性分画をプ
ールし、クロマトホーカシング（chromatofocusing) に
付した。クロマトホーカシングは、ファルマシアＦＰＬ
Ｃシステムで実施した。カラムは、ポリバッファーで展
開し、１時間に３０mlの流速で１mlずつ分画した。分画
のpHを、溶出およびpH測定後直ちに７．２に調整した。
酵素アッセーは、いろいろな分画について行い、ＤＩＭ
Ｔ活性のピークは、分画３５にあった。この分画をスー
パーロース−１２カラムにかけた。このカラムを１５０
mMの NaCl を含む緩衝液Ｌで、流速１８ml／時間で溶出
し、０．３mlずつ分画した。ＤＩＴＭ活性のピークがあ
る分画を、最終的に、１２．５％非変成ポリアクリルア
ミド電気泳動（非変成ＰＡＧＥ）に付した。電気泳動
後、ゲルを輪切りにし、各ゲル片を拡散により溶出さ
せ、ＤＩＭＴ活性を調べた。ＤＩＭＴ活性は、同一ゲル
において標準卵白アルブミンのRf値より大きいRf値をも
つゲル片の溶出分画にあった。

【００７１】ＤＩＭＴの一般特性 ＤＩＭＴ活性の至適温度、至適pHおよび金属要求生を、
ＤＥＡＥ−セファロースカラムから得た酵素調製物で調
べた。キネティクス分析のためには、二回目のMonoQカ
ラムにより精製された調製物を用いた。

【００７２】ＤＩＭＴの分子量と等電点測定 非変成酵素の分子量は、スーパーロース−１２カラムに
よるゲル濾過クロマトグラフィーで求めた。カラムは、
１５０mMの NaCl を含む緩衝液Ｌで平衡化し、流速１８
ml／時間で流した。変成酵素の見かけの分子量は、Laem
mli(Nature(London)、２２７巻、６８０−６８５ページ
（１９７０））に従い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで概算した。
ゲル濾過とＳＤＳ−ＰＡＧＥの両方において、標準とし
てウシ血清アルブミン（Mr＝６６０００）、卵白アルブ
ミン（Mr＝４５０００）、炭酸脱水酵素（Mr＝３１００
０）、チトクロームＣ（Mr＝１２４００）を用いた。精
製酵素の等電点は、７−４のpH間隔のファルマシア Mon
oP ＨＲ５／２０カラムでのクロマトホーカシングと３
−９の間隔を有する目盛り付き等電点ホーカシング（fo
cusing) −ＰＡＧＥとで算定した。

【００７３】一般的分析方法 非変成−ＰＡＧＥを、Laemmli(上記）に従い、緩衝液系
からＳＤＳを除いて実施した。ウシ血清アルブミンを標
準として、蛋白濃度をＢio−Ｒadアッセーで求めた。

【００７４】菌糸体増殖とイムノマイシン産生のタイム
コース 時間の関数として、遠心沈澱細胞の容積およびイムノマ
イシン産生を、イムノマイシン生合成酵素の力価の指標
として求めた。菌糸体重量もイムノマイシン産生も培養
後７２時間から９５時間の間でピークになった。従って
７２時間経過の菌糸体をＤＩＭＴ酵素の分離に使用する
こととした。

【００７５】ＤＩＭＴの特性と局在 まず最初に、粗抽出物を用いて、チロシンとアベルメク
チンのＳ−アデノシル−Ｌメチオニン−依存メチル化の
ために、先に報告されたアッセーシステム（N.J. Bauer
nら、J. Biol. Chem.、２６３、１５６１９ページ、
（１９８８）および M. D. Schulman ら、Antimicrobia
l Agents Chemotherapeutics, ２９、６２０ページ（１
９８９）参照）に基づいて酵素アッセーを確立した。こ
の調製物は、ＳＡＭおよびマグネシウムイオンを絶対的
に要求することを示し、ＥＤＴＡは完全に活性を抑制し
た。酵素活性は、また硫酸アンモニウムによっても抑制
されたが、これは完全に透析した後回復した。至適反応
温度およびpHは、それぞれ３５℃および８．５であるこ
とがわかった。最適条件を用いて、酵素活性は、１０５
ｋ×ｇの遠心工程後に得られた無細胞系抽出物（粗抽出
物）でのみ検出できた。粗抽出物でペレットを再構成し
ても活性の増強は認められなかった。

【００７６】ＤＩＭＴの分離と精製 最適アッセー条件を用いて、７２時間経過菌糸体によ
り、ＤＩＭＴ活性に関して機能を有する無細胞系調製物
が供給された。この活性を有する分画を、硫酸アンモニ
ウム沈澱、ＤＥＡＥ−セファロース、調製用および分析
用 MonoQ、クロマトホーカシングおよびスーパーロース
−１２カラムクロマトグラフィーを含む一連の精製工程
により高純度で分離した。調製用 MonoQ、分析用 Mono
Q、クロマトホーカシングＰおよびスーパーロース−１
２カラムからの分画の溶出プロフィルおよびＤＩＭＴ活
性を求めた。該ＤＩＭＴは常に、増加する特異活性をも
つ単一ピークで溶出した。スーパーロース−１２カラム
からの高純度分画を、非変成−ＰＡＧＥに付したとき
に、最終的に、極めて高純度のＤＩＭＴが得られた。非
変成ポリアクリルアミドゲルから電気泳動後溶出させた
分画は、酵素活性を有し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび等電
点ホーカシングゲルで単一バンドを示した。

【００７７】分子量と等電点ホーカシングポイント ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびスーパーロース−１２カラムク
ロマトグラフィーにより、精製ＤＩＭＴの分子量を求め
た。目盛り付きＳＤＳ−ＰＡＧＥから、精製ＤＩＭＴ
は、およそ３２，０００の見かけの分子量を有する単一
で均質なバンドであることが分かった。この調製物は、
目盛り付きスーパーロース−１２カラムからも、標準の
炭酸脱水酵素（ＭＲ＝３１０００）のそれと同一の溶出
容量で、対称的に溶出し、それゆえ非変成酵素の見かけ
の分子量は、３１０００であることが示唆される。精製
ＤＩＭＴの等電点を、クロマトホーカシングおよび目盛
り付き等電点ホーカシング−ＰＡＧＥによって概算し
た。両システムとも、非変成酵素の等電点は４．４であ
ることを示した。

【００７８】Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン(SAM)依
存性とマグネシウムイオン要求性 ＤＩＭＴはＳＡＭおよびＭｇ⁺²をその活性に必要とす
る。ＤＩＭＴ活性は、ＥＤＴＡ、シネファンギン（sine
fungin) およびＳ−アデノシル−ホモシステイン（ＳＨ
Ａ）により大きく抑制されることが見いだされ、これ
は、この酵素のＳＡＭおよびＭｇ⁺²要求性を再確認させ
るものである。

【００７９】ＤＩＭＴのpHおよび温度依存性 ＤＩＭＴの最高活性は、pH８．５および３５℃で認めら
れる。

【００８０】キネティクスタディ 既に確立されたインキュベーションの条件では、酵素反
応速度は、およそ６０μgまでは、蛋白質と直接比例関
係にある。同じ条件下で、２５μgの蛋白を異なる時間
インキュベートすると、初めの速度は３０分間維持され
た。初め速度の測定のための条件の下で、ＤＩＭＴの見
かけのKmおよびＶmax を、４０μMのＳＡＭで求めた。
一方補助基質として２５μmM の３１−０−デスメチル
イムノマイシンを用いて、ＳＡＭのキネティック利用を
調べた。３１−０−デスメチルイムノマイシンおよびＳ
ＡＭに対する見かけのＤＩＭＴのKmおよびＶmax を、ラ
インウィーバー−バークの逆数のプロットから求めた。
グラフから得られたキネティックパラメーターは、３１
−０−デスメチルイムノマイシンが可変基質である場合
は、見かけのＶmax およびKmとしてそれぞれ４５．５nm
ole ／hr／mgおよび１１μMを示唆した。同様に、ＳＡ
Ｍが可変基質として利用される場合は、ＶmaxおよびKm
の概算値は、それぞれ１００nmole ／hr／mgおよび１
２．５μMであった。

【００８１】実施例３ 大容量酵素のアッセーのための一般的方法 ５０mMのリン酸緩衝液で（pH＝７．３０）で全容量を１
０mlに調製した反応混合物は、３５mg部分精製ＤＩＭ
Ｔ、２mMの硫酸マグネシウム、６．２５μMの基質、６
０μMのＳＡＭを含むものであった。先に報告したイン
キュベーション条件下で、ＳＡＭの添加により反応を開
始させた。反応混合物を酢酸エチルで抽出し、その後、
溶媒としてクロロホルム：メタノール（９：１）を用い
るＴＬＣシステムに付した。１４−Ｃ ＳＡＭを使用し
た対応する実験で、放射活性の分離により求めたRf値を
有するＴＬＣプレートのシリカゲル部分をこすり取り、
十分に酢酸エチルで溶出した。それから、逆相ＨＰＬＣ
による精製のために、酢酸エチル抽出物を調製した。
水：アセトニトリル：リン酸（４５：５５：０．１）を
含む溶媒系で、６０℃で、逆相ＨＰＬＣシステムを行っ
た。１４−Ｃ ＳＡＭを用いた酵素活性産物のために既
に求めたものと対応する、溶出時間で溶出させた分画を
集めプールした。それから、生物学的試験および化学的
性状を調べるために、プールした分画をさらに精製し
た。

【００８２】化合物IIの酵素的合成 供給された状態のまま、化合物Ｉを直接、我々の放射性
同位元素使用アッセーシステムに用いた。この物質の保
持時間は、我々の逆相ＨＰＬＣシステムでは、１９．４
４分であった。この物質および[³H-CH₃]−SAM(Ｓ−アデ
ノシル−Ｌメチオニン）を基質／補助基質として使用し
た酵素反応生成物を分離し、放射性ＴＬＣおよび放射性
ＨＰＬＣ系で調べた。我々の放射性−ＴＬＣでは、基質
のメチル化を示唆する、特異的なRfを有する放射性分画
が検出された。放射性−ＨＰＬＣ系では、放射能は、２
５−２７分画に溶出し、分画２６に放射能のピークがあ
った。放射性−ＴＬＣおよび放射性−ＨＰＬＣから得ら
れた情報に基づき、大容量酵素反応を実施し、反応生成
物を分離、ＨＰＬＣで調べた。分画２６に対応する、２
５．１５分のピーク溶出時間をもつ、この物質の溶出プ
ロフィルは、放射性分画の溶出位置と同じであった。酵
素的に産生されたこの物質の溶出時間は、同一のＨＰＬ
Ｃ系での標準イムノマイシンの溶出時間（３１．７９
分）より４分短かった。これは、この酵素的に産生され
た化合物が異なった性状であることを示唆している。従
って、この物質を分離し、ＦＡＢおよびＮＭＲ分光学的
分析に付した。ＦＡＢ分光学的分析の結果から、酵素的
メチル化の結果として、１４原子集団ユニット〔８１４
−７（Li) ＝８０７〕の付加が示唆され、ＮＭＲは、特
異的であった（図２）。

【００８３】生物学的活性 化合物Ｉ、化合物IIおよびＦＲ−９００５２０のＨＰＬ
Ｃ精製サンプルを、同一実験セットで生物学的活性につ
いて調べた。これらの実験の結果は、これら化合物のＩ
Ｃ₅₀は、それぞれ１１、６および１nMであることを示し
た。

【００８４】実施例４ Ｔ細胞増殖アッセー １．サンプル調製 上記ＨＰＬＣにより調製された通りに精製した化合物Ｉ
を、１mg／mlで無水エタノールに溶かした。

【００８５】２．アッセー Ｃ５７Ｂ１／６マウスの脾臓を無菌的に摘出し、熱不活
化ウシ胎児血清１０％（GIBCO, Grand Island, N. Y.)
を補充した、氷冷ＲＰＭＩ１６４０（GIBCO)培養液中で
穏やかにほぐした。細胞を１５００rpm で８分遠心して
沈澱させた。混入赤血球を、沈澱を塩化アンモニウム溶
解緩衝液（GIBCO)で４℃で２分間処理することにより除
去した。冷培養液を加え、細胞を再び１５００rpm ８分
間遠心した。それからＴリンパ球を、以下のようにナイ
ロンウールカラムで細胞浮遊液を分別して分離した。ナ
イロンウールカラムは、およそ４グラムの洗浄乾燥ナイ
ロンウールを２０mlのプラスチックシリンジに詰めて調
製した。このカラムを約１２１℃（２５０°Ｆ）で３０
分オートクレーブして滅菌した。ナイロンウールカラム
を温かい（３７℃）培養液で湿らせ、同じ液で洗浄し
た。温かい培養液に再浮遊した洗浄脾細胞を、ナイロン
ウール上にゆっくりと載せた。それからカラムを直立さ
せた状態で３７℃で１時間インキュベートした。非吸着
Ｔリンパ球を暖培養液でカラムから溶出させ、この細胞
浮遊液を上記のように遠心した。

【００８６】精製Ｔリンパ球を、１０％熱不活化ウシ胎
児血清、１００mMグルタミン、１mMナトリウムピルベー
ト、２×１０^-5Ｍの２−メルカプトエタノールおよび５
０μｇ／mlゲンタマイシン添加ＲＰＭＩ１６４０培地か
ら成る、完全培養液中に２．５×１０⁵ 細胞／mlで再浮
遊させた。イムノマイシンを２５０ng／ml、ＰＭＡを１
０ng／ml加えた。この細胞浮遊液を、９６穴（ウェル）
平坦底マイクロカルチャプレート（Costar) に、直ちに
２００μｌ／ウェルで分注した。被験薬を含まない培養
液のみのコントロールおよびテストする種々の下記希釈
サンプル（上記の精製化合物Ｉ）を、２０μｌ／ウェル
で三ウェルづつ加えた。ＦＲ−９００５０６を標準とし
て使用した。それからカルチャープレートを３７℃で、
湿潤５％CO₂ −９５％空気中で４４時間インキュベート
した。Ｔリンパ球の増殖は、トリチウム化チミジンの取
り込み測定により算定した。４４時間培養後、２μＣｉ
／ウェルでトリチウム化チミジン（ＮＥＮ，ケンブリッ
ジ、ＭＡ）で細胞をパルス−ラベルした。さらに４時間
培養後、マルチサンプルハーベスターで、培養物をグラ
スファイバーフィルター上に採取した。個々のウェルに
対応するフィルターディスクの放射能を、標準的な液体
シンチレーション計測法（Betacounter)で測定した。三
組のウェルの１分当たりの平均カウント数を計算し、結
果は、下記のようにトリチウム化チミジン取り込み（増
殖）百分率抑制として表した。

【化６】

【００８７】化合物Ｉの種々の濃度における％抑制の結
果を、下表に示す。 表 イオノマイシン＋ＰＭＡ刺激脾Ｔ細胞の増殖応答に対する化合物Ｉの効果 サンプル濃度（nM) 百分率抑制 ─────────────────────────── ３１５．２ ９８ １５７．６ ９８ ７８．８ ９５ ３９．４ ８９ １９．７ ６５ ９．９ ３９ ４．９ ０ ２．５ ０ ─────────────────────────── 注記：１．マウスＴ細胞は、４８時間で採取する前に、
４時間 ³Ｈ−チミジンでパルス−ラベルした ２．標準用ＦＲ−900506（１０ng／ml）は、９９％抑制
を示した。 ３．化合物ＩのＩＣ₅₀＝１１．５ng／ml＝１４．５nM
で、一般に１０−１８×１０^-9モルの範囲にある。 ４．化合物ＩのＴ細胞増殖抑制は、培養開始時のＩＬ−
２（遺伝子組み換えＩＬ−２）添加により無効となっ
た。 ５．化合物IIも上記のＴ細胞増殖アッセーにおいて、陽
性の結果を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】CDCl₃ 中で４００ＭHzで実施された、化合物Ｉ
の ¹Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルおよび付与され
たその分子構造。

【図２】CDCl₃ 中で４００ＭHzで実施された、化合物II
の ¹Ｈ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルおよび付与され
たその分子構造。

【図３】CDCl₃ 中で４００ＭHzで実施された、ＦＲ−９
００５２０（またはイムノマイシンと称される）の ¹Ｈ
核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルおよび付与されたその
分子構造。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:56） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:56） (72)発明者 レイモンド エフ．ホワイト アメリカ合衆国，07726 ニュージャーシ ィ，イングリッシュタウン，ベケット ロ ード 12 (72)発明者 ジョルジェッテ デゼニィ アメリカ合衆国，07078 ニュージャーシ ィ，ショート ヒルズ，テニソン ドライ ヴ 149 (72)発明者 バイロン エッチ．アリソン アメリカ合衆国，07060 ニュージャーシ ィ，ウォッチュング，センチュリー レー ン 88 (72)発明者 トマス アール．ビューティー アメリカ合衆国，07076 ニュージャーシ ィ，スコッチ プレインズ，ヘザー レー ン ４ (72)発明者 エイミィ エム．ヘイル アメリカ合衆国，08826 ニュージャーシ ィ，グレン ガードナー，アールアール ２−ボックス 69 (72)発明者 フランシス デュモン アメリカ合衆国，07065 ニュージャーシ ィ，ローウェイ，ウエスト チェリー ス トリート 54

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 窒素養分を含有する水性炭水化物培地
   中、深部好気性発酵条件下で、ストレプトマイセス ラ
   ベンデューレ（Streptomyces lavendulae)の菌株を、図
   １に示したプロトン核磁気共鳴スペクトルを有する化合
   物Ｉを製造するのに十分な時間、ＦＲ−９００５２０と
   共に培養することを特徴とする化合物Ｉで表わされる免
   疫抑制剤の製造方法。
2. 【請求項２】 前記微生物が、ＡＴＣＣ ５５２０９号
   である請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 化合物Ｉを含有する請求項１記載の方法
   により製造される非濾過ブロス。
4. 【請求項４】 請求項１記載の方法により製造される免
   疫抑制生産物。
5. 【請求項５】 Ｔ細胞増殖アッセーによりＴ細胞活性化
   抑制陽性を示し、かつ図１に示したプロトン核磁気スペ
   クトログラムを示す免疫抑制剤である化合物Ｉ。
6. 【請求項６】 図１に示した分子構造を有する請求項５
   記載の免疫抑制剤。
7. 【請求項７】 医薬的に許容し得る、実質的に無毒な担
   体または賦形剤と組み合わせた治療的に有効な量の化合
   物Ｉを含む医薬組成物。
8. 【請求項８】 治療的に有効な量の化合物Ｉをヒトに投
   与することを特徴とする、ヒトの移植拒否を防止または
   自己免疫疾患を治療するための使用方法。