JPH06133769A - Ｆｋ−９００５２０の新規な酵素的及び／又は微生物的メチル化産物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 免疫現象の調節に役立つ物質、その物質に変
換するための酵素組成物、その方法を提供する。 【構成】 Streptomyces hygroscopicus subsp. ascosc
opicus ATCC55087の菌体から抽出される新規な酵素、３
１−Ｏ−デスメチルイムノマイシンメチルトランスフェ
ラーゼ（ＤＩＭＴ）を使用して新規なＦＫ９００５２０
誘導体を調製する。 【効果】 ＦＫ９００５２０から誘導される新規なマク
ロライド化合物は濃度によりＦＫ５０６型免疫抑制剤の
拮抗剤または免疫抑制剤として作用するものである。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、ＦＫ−５０６型分子、例えば３
１−デスメチルイムノマイシンに於けるＣ−３１ヒドロ
キシル基をメチル化することが出来る新規な酵素、３１
−Ｏ−デスメチルイムノマイシンメチル転化酵素（ＤＩ
ＭＴ）、及び新しい免疫抑制剤、１５、３１−デスメチ
ルイムノマイシンに関するものである。亦、これ等の物
質を、自己免疫疾患症、感染症、及び／又は臓器移植拒
絶反応の抑制治療用として人・宿主への利用をも開示す
るものである。１９８３年に、米国合衆国食品医薬局
（ＵＳ ＦＤＡ）は臓器移植手術の分野に大変革をもた
らした極めて有効な抗拒絶反応薬、シクロスポリンを認
可した。この薬剤は、移植された異種蛋白を拒絶するた
めに、体内の免疫システムが広大な天然防御要員を起動
させるのを阻止する働きがある。この薬剤は、移植拒絶
反応に対抗するのには有効であるが、多くの場合極めて
重症となることがある腎臓機能不全、肝臓損傷及び潰瘍
を起こす欠点がある。ここに引用として組み入れるフジ
サワ(Fuzisawa)に対する欧州特許局（ＥＰＯ）公報No.
０１８４１６２は、シクロスポリンより１００倍有効で
あると評されている新規なマクロライド免疫抑制剤ＦＫ
−５０６（ＦＲ−９００５０６）について記述してい
る。本マクロライドは、ストレプトミセス・ツクバエン
シス(Streptomyces tsukubaensis) の特定菌株の醗酵に
より製造される。亦、ストレプトミセス．ハイグロスコ
ピクス亜種．ヤクシマエンシス(S.hygorscopicus subs
p.yakushimaensis.) により製造される密接な関連があ
るマクロライド免疫抑制剤ＦＫ−９００５２０について
も記述されている。T.Araiに対する米国合衆国特許３，
２４４，５９２は、ストレプトミセス・ハイグロスコピ
クス変種アスコミセチクス(Streptomyces hygroscopicu
s var.ascomyceticus)の培養により抗真菌性の“アスコ
マイシン”を製造すると記述している。本技術分野で望
まれる薬剤は、挙動がＦＫ−５０６類似であって副作用
のない新規免疫抑制剤およびＦＫ−５０６が持つ免疫抑
制効果を本質的に反転して拮抗剤として作用し、且つ、
シクロスポリンの様な他の化学系物質と比較したＦＫ−
５０６マクロライド型活性の測定が必要な状況において
有用であるＦＫ−５０６拮抗剤である。ＦＫ−５０６の
新規な作用剤及び拮抗剤がこの分野では常に探索されて
いる。

【０００２】本発明を要約すると新規な酵素、ＤＩＭＴ
を、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス変種アスコ
ミセチクス(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyce
ticus)、（メルク・カルチャー・コレクションNo. ＭＡ
６６７８）ＡＴＣＣNo. ５５０８７からほぼ純粋な形で
分離できることを見出した。本酵素は、分子量は約３
２、０００ダルトン、等電点は４．４、であり、そして
Ｓ−アデノシル・メチオニン（ＳＡＭ）、メチル基供与
体試薬の存在下で３１−デスメチルＦＫ−５０６型分子
中のＣ−３１ヒドロキシル基を選択的にメチル化するこ
とが出来る点で有用なものである。本酵素の手段によ
り、新規なＣ−３１メトキシＦＫ−５０６型化合物を初
めて調製することができ、また公知のＣ−３１メトキシ
化合物類を新規なメチル化経路により特異的に調製する
こともできる： （１）Ｌ−６８３，７５６として記述されている１３，
３１−ビスデスメチルイムノマイシンを出発物質として
公知のＣ−１３デスメチルイムノマイシンを異る経路で
製造することができる。公知の経路は、微生物ＭＡ６４
７４（ＡＴＣＣNo.５３７７１）を用いたＦＫ−９００
５２０の生物変換によるものである。 （２）Ｌ−６８６，２９２として知られている公知の１
５，３１−ビスデスメチルイムノマイシンを出発物質と
して、新規な１５−デスメチルイムノマイシンを製造す
ることができる。 （３）公知の１３，１５，３１−トリスデスメチルイム
ノマイシン、Ｌ−６８７，７９５を出発物質として、新
規な１３，１５，−ビスデスメチルイムノマイシンを製
造することができる。 本発明により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて測定した分子量が
約３２キロダルトンであり、等電点（ＰＩ）が４．４で
あり、そしてメチル転移剤の存在下でＭｇ⁺²イオンを補
足した場合に、Ｃ−３１ヒドロキシを含有するＦＫ−５
０６型分子のＣ−３１位Ｏ−メチル化を触媒することが
出来る精製無細胞酵素、ＤＩＭＴからなる組成物が提供
される。更に、上述のＤＩＭＴ酵素の存在下で、Ｍｇ⁺²
イオンを補足した水溶性溶媒中でＦＫ−５０６型分子を
メチル転移試薬Ｓ−アデノシル・メチオニンと接触させ
る工程からなるＣ−３１にヒドロキシを有するＦＫ−５
０６型分子中のＣ−３１ヒドロキシル基のメチル化工程
が提供される。亦、次式の化合物を提供するものであ
る：

【化７】 更に次式の化合物も提供するものである：

【化８】

【０００３】以下本発明を詳細に説明する。本発明は、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した分子量が約３２キロダルト
ンであり、等電点（ＰＩ）が４．４であり、そしてメチ
ル転移剤の存在下でＭｇ⁺²イオンを補足した場合に、Ｃ
−３１位にヒドロキシを有するＦＫ−５０６型分子のＣ
−３１・Ｏ−メチル化を触媒することが出来る精製無細
胞酵素、ＤＩＭＴを含有する組成物に関する。本酵素
は、ストレプトミセス・ハイグロスコピクス変種アスコ
ミセチクス(Streptomyces hygroscopicus var.ascomyce
ticus)（Ｍａ６６７８）ＡＴＣＣ No.５５０８７から分
離され、そして実施例１に記載の方法に準じて酵素とし
て用いるために精製した。本酵素は、ＦＫ−５０６型分
子を、上述のＤＩＭＴ酵素の存在下で、Ｍｇ⁺²イオンを
補足しながら、そのための水性溶媒中でメチル転移剤、
例えばＳ−アデノシルメチオニンと接触させる工程を含
む、Ｃ−３１ヒドロキシを有するＦＫ−５０６型分子中
のＣ−３１ヒドロキシル基をメチル化する工程に於いて
有用なものである。一般的に、本方法はpH約７−９で、
約２５−４０℃の温度範囲で行われる。本水性溶媒系
は、一般的にpH＝約７−８のリン酸塩緩衝液である。本
Ｍｇ⁺²イオンは、可溶性マグネシウム塩、例えば塩化マ
グネシウム、硫酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム
などとして供給される。分離及び精製は、実施例に記載
の如くＨＰＬＣ又は逆相ＨＰＬＣを含む通常の方法で行
ってもよい。本酵素は、“ＦＫ−５０６型分子”中のＣ
−３１ヒドロキシ基のみをメチル化することで特異的で
あり、ＦＫ−５０６型分子とは、ＰＴＣ８９／０５３０
４（６月１５日、１９８９年）及びフィソンズ(Fisons)
に対する欧州特許公報０，３２３，０４２（７月５日、
１９８９年）に記載されている次の様な構造式Ａに相当
する分子を意味する。

【化９】 ここで、置換基の各隣接した一組：Ｒ¹ 及びＲ² ；Ｒ³
及びＲ⁴ ；Ｒ⁵ 及びＲ⁶；は独立に： ａ）二つの隣接する水素原子を表す、又は ｂ）上記置換基が接続する隣接炭素原子間に第二の結合
を形成する；上記の特徴に加えて、Ｒ² はＣ₁ −Ｃ₁₀ア
ルキル基を表すことが出来；Ｒ⁷ はＨ、ＯＨ又はＯ−Ｃ
₁ −Ｃ₁₀アルキル、又はＲ¹ と共に＝Ｏを表わす；Ｒ⁸
及びＲ⁹ は独立にＨ又はＯＨを表す；Ｒ¹⁰はＨ；Ｃ₁ −
Ｃ₁₀アルキル（ここで上述のアルキルは一個又はそれ以
上のヒドロキシル基により置換されることが出来る；又
はＣ₁ −Ｃ₁₀アルケニル（これは一個又はそれ以上のヒ
ドロキシル基で置換されてもよい）、又は＝Ｏにより置
換されたＣ₁ −Ｃ₁₀アルキルを表す；ＸはＯ、（Ｈ、Ｏ
Ｈ）、（Ｈ、Ｈ）又は−ＣＨ₂ Ｏ−を表す；ＹはＯ、
（Ｈ、ＯＨ）、（Ｈ、Ｈ）、Ｎ−ＮＲ¹¹Ｒ¹²又はＮ−Ｏ
Ｒ¹³を表す ここで、Ｒ¹¹及びＲ¹²は独立にＨ、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキ
ル、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アリール又はトシルを表し、及びＲ¹³、
Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²²、及びＲ²³
は独立にＨ又はＣ₁ −Ｃ₁₀アルキルを表す；ｎは１、
２、又は３である；上記のこれらの特徴に加えて、Ｙ、
Ｒ¹⁰及びＲ²³は、それらが結合している炭素原子と共
に、５個又は６個の原子からなるＮ−、Ｓ− Ｏ−含有
複素環であることができ、この環は飽和又は不飽和であ
り、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、ヒドロキシル、一個又はそれ
以上のヒドロキシル基類により置換されたＣ₁ −Ｃ₁₀ア
ルキル、Ｏ−Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、ベンジル及び−ＣＨ
₂ Ｓｅ（Ｃ₆ Ｈ₅ ）から選択された一個又はそれ以上の
基により置換されてもよい；ただしＸ及びＹが共にＯを
表す場合には、Ｒ⁹ はＯＨを表し、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、
Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹及びＲ²²は各々メチルを表す；Ｒ⁸ 及
びＲ²³は各々Ｈを表す；〔Ｒ³ 及びＲ⁴ 〕及び〔Ｒ⁵ 及
びＲ⁶ 〕は各々炭素結合を表す；及び存在する全てのア
ミン基の酸付加塩を含む薬学的に受容されるその塩類。
亦、フジサワに対する米国合衆国特許４，８９４，３６
６（１月１６日、１９９０年）に公表されている構造Ｂ
に相当する特定のＦＫ−５０６構造およびその薬学的に
許容される塩基性塩も包含されている。

【化１０】 ここで：ＷはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、（Ｈ、Ｈ）を表す；Ｒ
はＨ、ＣＨ₃ である；Ｒ² は水素、ヒドロキシ又は低級
アルカノイルオキシである、Ｒ³ はメチル、エチル、プ
ロピル又はアリルであり、ｎは１又は２の整数であり、
そして線及び点線の記号は一重結合又は二重結合であ
る。特に望ましいものは、ＲはＣＨ₃ である；Ｒ² はヒ
ドロキシである；Ｒ³ はエチルである；ｎは２である；
またはＲはＨである；Ｒ² はヒドロキシである；Ｒ³ は
エチルである；ｎは２である化合物類である。著しく望
ましいものはＣ−３１メチル化工程であり、その出発物
質ＦＫ−５０６型化合物が次式の化合物であって、

【化１１】 そしてメチル化された製造物が次式の化合物であるもの
である。

【化１２】 亦、出発物質ＦＫ−５０６型化合物が次式の化合物であ
って、

【化１３】 生成物が次式の化合物であるプロセスも好ましい。

【化１４】 製造されたＣ−３１メチル化化合物は、免疫抑制活性、
例えばカルシウム・イオンイオノフオア（イオノマイシ
ン）＋・ホルボール・ミリステートアセテート（ＰＭ
Ａ）により誘発されるＴ−細胞刺激アッセイ、（ここで
は“Ｔ−細胞増殖検定”とも言う）で示されるＴ−細胞
活性化陽性阻害を示すことができる。本検定の原理は、
ＰＭＡと組合せたイオノマイシンで刺激されたマウスＴ
リンパ球の増殖を測定するものである。本検定で陽性の
サンプルは、トリチウム化チミジンの取り込みの減少と
して示されるようにＴ−細胞増殖を抑制する。本発明の
プロセスは、ＤＩＭＴ酵素を分離するために、ストレプ
トミセス・ハイグロスコピクス亜種アスコミセチクス(S
treptomyces hygroscopicus subsp.ascomyceticus)、メ
ルク・カルチャー・コレクションＭＡ６６７８、ＡＴＣ
ＣNo.５５０８７を培養し抽出することを伴うものであ
る。本微生物は現在、メリーランド州ロックビル・パー
クロン・ドライブ１２３０１にあるアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション(American Type Culture C
ollection)にＡＴＣＣNo. ５５０８７として、及びニュ
ージャージイ州ラーエイにあるメルク・カルチャ ー・
コレクションにＭＡ６６７８として寄託されている。親
株ＭＡ６４７５、ＡＴＣＣ No.１４８９１に由来する本
微生物の、形態学上の、培養上の、生物学上の、及び生
理学上の特性を含めた自然特徴及び分類学につき以下に
要旨を記述する。下記は、ストレプトミセス・ハイグロ
スコピクス亜種アスコミセチクス菌株ＭＡ６６７８、Ａ
ＴＣＣ５５０８７及び親株ＭＡ６４７５、ＡＴＣＣ No.
１４８９１の一般的な記述である。一般的な培養特徴及
び炭素源利用の観察はシャーリング(Shirling)及びゴッ
トリーブ(Gottleib)の方法（インターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・システム・バクテリオロジー(Internat.
System,Bacteriol) １６巻：３１３−３４０頁）に準じ
て行った。細胞の化学組成については、レチェバリアー
(Lechevalier) 及びレチェバリアー(Lechevalier) の方
法（「放線菌分類学」(actinomycete Taxonomy)A.Kiet
z、D.W.Thayer編、産業微生物学会(Society for Indust
rial Microbiology) 出版、１９８０年）を使用して測
定した。培養物の色調は国際学会色調協議会−国立標準
局セントロイド・カラー・チャート( 米国商務省国立標
準局の国立標準局回状５５３に対する補足、１９８５
年）に含まれる色調標準と比較して決定した。由来 −菌株ＭＡ６６７８（ＡＴＣＣ５５０８７）はＭＡ
６４７５（ＡＴＣＣ１４８９１）、ストレプトミセス・
ハイグロスコピクス亜種アスコミセチクス由来のもので
ある。細胞壁組成の分析 −菌株ＭＡ６６７８及びＭＡ６４７５
のペプチドグリカンは共にＬ−ジアミノピメリン酸を含
む。一般的発育特徴 −両菌株とも酵母麦芽エキス、グリセリ
ン・アスパラギン、無機塩−澱粉、オートミール、及び
トリプチケース大豆寒天培地に良好に発育することが見
られた。生育は２７℃及び３７℃で起きる。両菌株とも
酵母デキストロースブロスの様な液体培地にも良好に発
育する。コロニー形態 （酵母麦芽エキス寒天培地で）ＭＡ６６７８ −基質菌糸は輝く黄色（８３ビリルＹ）で
あり、コロニーは不透明な、台状の、凹凸のある、ゴム
様のものであった。コロニーの表面は粉状から粗いテク
スチャーである。７日間の培養後に気中菌糸が現われ、
その色は白色（２６３ホワイト）である。胞子塊が存在
する場合には、白色（２６３ホワイト）で培養期間が長
くなると黒色（２６７ブラック）に変わる。ＭＡ６４７５ −基質菌糸は中間の黄色（８７ｍ．Ｙ）で
あり、コロニーは不透明な、台状の、凹凸のある、ゴム
様のものである。コロニー表面は粉状である。気中菌糸
が１４日までに現われ中間の灰色（２６５メディアム・
グレイ）である。胞子塊が存在する場合には、中間の灰
色（２６５メディアム・グレイ）であり培養期間が長く
なると黒色（２６７ブラック）に変わる。微細構造ＭＡ６６７８及びＭＡ６４７５ 気中菌糸（０．５７−０．７６μm 径）は基質菌糸から
発生し枝分かれし屈曲性がある。成熟した培養菌に於い
ては、気中菌糸の末端は一般に主に螺旋状鎖に発生した
胞子となる。胞子塊は２１日間で不定形な塊に癒着する
傾向がある。

【表１】酵母エキス−麦芽エキス ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：良好 良好 気中菌糸 ：中間の灰色（２６５メディア 白色（２６３ホワイト）枝分 ム・グレイ）枝分かれした螺 かれした螺旋状担胞子体 旋状担胞子体 可溶性色素 ：無し 無し 基質菌糸体 ：中間の黄色（８７ｍ．Ｙ） 輝く黄色（８３ブリルＹ）グルコース・アスパラギン ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：良好 稀薄 気中菌糸 ：中間の灰色（２６５メディア 黄白色（９２ｙ．ホワイト） ム・グレイ）枝分かれした螺 枝分かれした螺旋状担胞子体 旋状担胞子体 可溶性色素 ：無し 無し 基質菌糸体 ：淡い黄色（８９ｐ．Ｙ） 明い黄色（８６ ｌ．Ｙ）無機塩澱粉 ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：良好 良好 気中菌糸 ：中間の灰色（２６５メディア 黄白色（９２ｙ．ホワイト） ム・グレイ）枝分かれした螺 枝分かれした螺旋状担胞子体 旋状担胞子体 可溶性色素 ：無し 無し 基質菌糸体 ：淡い黄色（８９ｐ．Ｙ） 淡い黄色（８９ｐ．Ｙ）オートミール ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：良好 良好 気中菌糸 ：暗灰色（２６５ｄ．グレイ） 白色（２６３ホワイト） 枝分かれした螺旋状担胞子体 枝分かれした螺旋状担胞子体 可溶性色素 ：無し 無し 基質菌糸体 ：灰色がかった黄色 淡い黄色 （９０ｇｙ．Ｙ） （８９ｐ．Ｙ）シグマ水 ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：並み 稀薄 気中菌糸 ：黒色（２６７ブラック） −−−− 裂片状、螺旋状担胞子体 可溶性色素 ：無し 無し 基質菌糸体 ：−−−− −−−−ツァペック ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：良好 良好 気中菌糸 ：明い灰色（２６４ ｌ．グレ 白色（２６３ホワイト） イ）枝分かれした螺旋状担胞 枝分かれした螺旋状担胞子体 子体 可溶性色素 ：無し 無し 基質菌糸体 ：中間の灰色 黄色かかった白色 （２６５メディアムＧｙ） （９２ｙホワイト）ペプトン鉄 ＭＡ６４７５ ＭＡ６６７８ 発育量 ：良好 良好 気中菌糸 ：−−−− −−−− 可溶性色素 ：メラニン陰性 メラニン陰性 基質菌糸体 ：−−−− −−−−種々の生理学的諸反応 ＭＡ６６７８ −培養菌体は、トリプトン酵母エキス・ブ
ロスではメラノイド色素を生産せず、澱粉を加水分解
し、１％セロビオース、Ｄ−フラクトース又はＤ−マン
ノースを補添したプリドハム−ゴットリーブ基本培地上
では黄色のpH非依存の拡散性色素を生産する。炭素源利
用パターンは次の如くである：セロビオース、Ｄ−フラ
クトース、α−Ｄ−乳糖、β−Ｄ−乳糖、Ｄ−マルトー
ス、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、又はＬ−ラム
ノースは良好に利用する；Ｌ−アラビノースは殆ど利用
しない；Ｄ−アラビノース、イノシトール、Ｄ−ラフィ
ノース、庶糖、Ｄ−キシロース、又はＬ−キシロースは
全く利用しない。ＭＡ６４７５ −培養菌体は、トリプトン酵母エキス・ブ
ロスではメラノイド色素は生産せず、澱粉を加水分解す
る。炭素源利用パターンは次の如くである：セロビオー
ス、Ｄ−フラクトース、α−Ｄ−乳糖、β−Ｄ−乳糖、
Ｄ−マルトース、Ｄ−マンニトール、Ｄ−マンノース、
又はＬ−ラムノース又はＤ−キシロースは良好に利用す
る；Ｌ−アラビノース又はイノシトールはわずかに利用
する；Ｄ−アラビノース、Ｄ−ラフィノース、庶糖、Ｌ
−キシロースは全く利用しない。識別 −菌株ＭＡ−６６７８の化学分類学的及び形態学的
特徴は、親株ＭＡ６４７５のそれとほぼ一致する。親株
からＭＡ−６６７８を区別するのに役立つ表現型の特徴
は：ある種の培地では可溶性の黄色色素を生産するこ
と、及び唯一の炭素源としてイノシトール又はＤ−キシ
ロースの利用は出来ないことを含む。種の小名であるス
トレプトミセス・ハイグロスコピクス（及びその全ての
亜種）は、現今、本質的にストレプトミセス・ビオラセ
ウスニガー(Streptomyces violaceusniger) （バージェ
イズ・マニュアル・オブ・システマティク・バクテリオ
ロジイ、４巻、１９８９年）(Bergey's Manual of Syst
ematic Bacteriology,Vol ４、１９８９）の別名と考え
られていることに留意されたい。

【表２】 ストレプトミセス・ハイグロスコピクス亜種アスコミセチクスＭＡ ６４７５及びＭＡ６６７８株の２１日間での炭水化物利用パターン 炭素源 ＭＡ６４７５による利用 ＭＡ６６７８による利用 Ｄ−アラビノース ０ ０ Ｌ−アラビノース １ １ セロビオース ２ ２ Ｄ−フラクトース ２ ２ イノシトール １ ０ α−Ｄ−乳糖 ２ ２ β−Ｄ−乳糖 ２ ２ Ｄ−マルトース ２ ２ Ｄ−マンニトール ２ ２ Ｄ−マンノース ２ ２ Ｄ−ラフィノース ０ ０ Ｌ−ラムノース ２ ２ 庶糖 ０ ０ Ｄ−キシロース ２ ０ Ｌ−キシロース ０ ０ ａ−Ｄ−グルコース ２ ３ （コントロール） ３＝良好な利用、２＝中ぐらいの利用、１＝わずかに利
用、０＝利用しない 本発明のプロセスは、（ＭＡ６４７５）ＡＴＣＣNo.１
４８９１を含めてストレプトミセス種に属する全ての
“ＤＩＭＴ−生産”株菌を用いて実施することが出来る
ものであり、特に望ましいのはＡＴＣＣNo.５５０８７
株菌である。実施例で使用された出発物質Ｌ−６８３，
５９０（ＦＫ−９００５２０）は、米国合衆国特許番号
３，２４４，５９２(U.S.Patent ３，２４４，５９２）
に記載のストレプトミセス・ハイグロスコピクス変種ア
スコミセチクス、ＡＴＣＣNo.１４８９１の醗酵によ
り、及びフジサワに対する欧州特許局公報No.０１８４
１６２に記載のストレプトミセス・ハイグロスコピクス
亜種ヤクシマエンシスNo.７２７８（Ｌ−６８３，５９
０と同一のものであるＦＲ−９００５２０即ち“ＦＫ−
９００５２０”を製造するために）の醗酵により得るこ
とが出来る。ＦＫ−５０６拮抗物質、Ｌ−６８６，２９
２は、微生物アクチノプラナセテ種（ＭＡ６５５９）(A
ctinoplanacete sp.（ＭＡ６５５９））を窒素栄養素を
含んだ水性炭水化物培地中で液面下の好気的条件で、マ
クロライド免疫抑制剤ＦＫ−９００５２０の存在下で醗
酵させて得ることが出来ることは衆知である。その条件
で、ＦＫ−９００５２０のＣ−１５，Ｃ−３１を選択的
にビスデメチル化する、即ち二個の異なるメトキシ基か
らメチル基を除去するのに十分な時間をかけ、pH約７で
実施する。Ｌ−６８６，２９２は、１９８９年５月５日
に提出された同一の譲受人をもつ同時係属出願 No.３４
８，２４３（ケース１７９１１）で公開された、Ｌ−６
８３，５９０のＣ−１３，Ｃ−１５，Ｃ−１３トリスデ
メチル化アナログであるＬ−６８７，７９５と共にブロ
ス中に見出される副次的な生産物である。本ブロス中の
主たる構成成分は、１９８９年１月１３日に提出され、
同一の発明者と譲受人を持つ出願番号 No.２９７，６３
０にて公開されたＬ−６８３，７５６（Ｌ−６８３，５
９０の誘導体で、Ｃ−１３，Ｃ−３１ビスデメチル化環
転位を有する）、及びＬ−６８３，７４２（Ｌ−６８
５，５９０のモノデメチル化アナログ、同一譲受人）、
及び１９８９年１月１３日に提出され、同一の譲受人を
持つケース番号１７８３２、出願番号 No.２９７，６３
０で公開されたＬ−６８３，７５６（Ｌ−６８３，５９
０のＣ−１３，Ｃ−３１ビスデメチル化アナログ）を包
含する。製造された構造物VII 及びVIIIは、その他既知
の生物学的活性物質の回収によく用いられている普通の
手段により酵素的メチル化培地から回収することが出来
る。製造された構造VII 及びVIIIの物質は、次の様な通
常の方法により濾液から分離・精製することが出来る。
即ち、減圧下で濃縮、凍結乾燥、メタノールなどの通常
の溶媒で抽出、pH調整、通常の樹脂（例えば、陽イオン
又は陰イオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂等々）で処
理、通常の吸着剤（例えば活性炭、ケイ酸、シリカゲ
ル、セルローズ、アルミナ等々）による処理、結晶化、
再結晶化、などである。望ましい方法は、溶媒抽出、特
にメタノールを用いた方法である。生成物である構造VI
IIは、“Ｔ−細胞増殖検定”により陽性の免疫抑制活性
を示し、且つこの基本原理に基ずく有用性を有してい
る。生成物である構造VII は、ＦＫ−５０６に対して拮
抗作用を示し、そしてＦＫ−５０６の過剰投与に対する
解毒剤が要求される場合に有用である。先に記載の方法
に準じて得られた構造物VII 及びVIIIは、通常の方法、
例えば抽出、沈殿、分画結晶、再結晶、クロマトグラフ
ィなどの方法にて分離、精製することが出来る。本素材
の適切な処方は、亦、酢酸エステルの様な、分子上の水
酸基群を通じて生成される、通常薬学的に許容され、生
体内で分解される、VII およびVIIIのエステルを含む。
ヘミケタール環系の転位による物質を含むVII 及びVIII
の互変体性及びコンホメーション異性体（類）も亦、本
発明の範囲内に含まれていることに留意するべきであ
る。本発明の構造物VIIIは、免疫抑制活性、抗菌活性な
どの薬理学的活性を有しており、それ故に心臓、腎臓、
肝臓、骨髄、皮膚等の様な臓器又は組織の移植拒絶、骨
髄移植による移植対宿主疾患、慢性関節リュウマチ、全
身性エリトマトーデス、ハシモト甲状腺炎、多発性硬化
症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、ぶどう膜炎の様な自己
免疫疾患などの疾病の治療及び予防法において有用であ
る。本発明の薬剤組成物は、薬剤的調製の形、例えば外
用の、腸溶性の又は非経口の使用に適した有機又は無機
の担体又は賦形剤と混ぜ合わせて、本発明の構造物VII
又はVIIIを活性成分として含有する固型物、半固形物又
は液体の形で用いることが出来る。本活性成分は、例え
ば錠剤、球粒、カプセル、坐剤、溶液、乳液、懸濁液な
どの使用に適した形として通常無毒の、薬学的に受容さ
れる担体と混ぜ合わせられる。用いられる担体は、水、
グルコース、乳糖、アラビヤゴム、ゼラチン、マンニト
ール、澱粉ペースト、珪酸マグネシウム、タルク、コー
ンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスタ
ーチ、尿素、その他の担体であって固型物、半固形物又
は液体の形に製造するのに適したもの、及び補助剤、安
定剤、着色剤、及び使用可能な香料である。本活性目的
化合物は、疾患に至る過程又は至った状況に於いて望ま
しい効果をもたらすに充分な量で薬学的混合物に含有さ
れる。

【０００４】本混合物を人に適用するには、非経口又は
腸溶性投与による使用がより望ましい。構造物VIIIの治
療上有効な投与量は、治療対象の患者夫々の年齢及び状
況により異なるが、最低、ＦＫ−５０６投与量相当又は
ＦＫ−５０６型免疫抑制の効果を反転させるに充分なＦ
Ｋ−９０６型マクロライドの投与量に相当する用量とし
て（７０kgの男性を基準に計算）、活性成分の約０．０
１−１０００mg、望ましくは０．１−５００mgそしてよ
り望ましくは０．５−１００mg、が一般的に疾病の治療
用に与えられ、平均的単独投与の場合には６．５mg、１
mgで充分である。本発明に含まれる化合物の構造式は次
の如きものである：

【化１５】

【化１６】

【化１７】

【化１８】

【化１９】

【化２０】

【化２１】

【化２２】

【実施例】

【０００５】実施例１ Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：３１−Ｏ−デスメチ
ルイムノマイシン Ｏ−メチル−トランスフェラーゼの
単離及び特性記述 イムノマイシン（構造Ｉ）は効果的な免疫抑制活性及び
抗真菌活性を持つ新規な大環状ラクトン／ラクタム抗生
物質である（F.J. Dumont 等による欧州特許公報Ｎｏ．
０３２３８６５（１９８９）参照）。この研究所による
前駆物質投与試験により大環状構造のポリケチド的性質
が確立された。さらに投与試験のデータにより位置１
３、１５及び３１の３個のメチル基がＳ−アデノシル−
Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を経てメチオニンから生ずる
ことが示された。本酵素であるＳ−アデノシル−Ｌ−メ
チオニン：３１−Ｏ−デスメチルイムノマイシン Ｏ−
メチル−トランスフェラーゼ（ＤＩＭＴ）の単離及び特
性記述は３１−Ｏ−デスメチルイムノマイシンを生産す
るストレプトミセス・ハイグロスコピクス 亜種 アス
コミセチクス(Storeptomyces hygroscopicus var ascom
yseticus) （ＭＡ６６７４）の変異株の開発と共に可能
となった。

【０００６】実験方法 菌の発育及び菌糸体の調製 ストレプトミセス・ハイグロスコピクス 亜種 アセコ
ミセチクス（ＡＴＣＣ５５０８７）の凍結栄養菌糸体を
種菌培地及び発酵培地で培養した。菌糸体細胞を７２時
間で収穫し０．５Ｍ ＫＣｌを含むpH７．５の５０ｍＭ
リン酸塩緩衝液を使用して３回洗浄し、最終的にはＫＣ
ｌを含まない同緩衝液で洗浄した。洗浄した菌糸体を無
細胞抽出物の調製に使用した。菌糸体の発育及びイムノマイシン生成の時間的経過 経時的に発酵培養菌体の一定量を２０００ｒｐｍで１０
分間遠心分離した。次に沈降した細胞容積を測定した。
同様に一定量をメタノールで抽出してイムノマイシン生
産をＨＰＬＣにより定量した。

【０００７】Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：３１−
Ｏ−デスメチルイムノマイシン Ｏ−メチル−トランス
フェラーゼ（ＤＩＭＴ）のアッセイ及び生成物の同定 アッセイはpH７．５の５０ｍＭリン酸塩緩衝液中に０．
０２５ｍＭ・３１−デスメチルイムノマイシン、１ｍＭ
・ＭｇＳＯ₄ 及び種々の量の酵素源を含む１mlの混合液
で実施した。反応は４６ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を持
つ１ｎｍｏｌｅの¹⁴Ｃ−ＳＡＭ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−
〔メチル−¹⁴Ｃ〕メチオニンの添加で開始した。全体の
混合液の培養は３４℃で２０分間行い、反応は酢酸エチ
ルの添加により終了させた。反応生成物は２ｍｌの酢酸
エチルを使用して抽出し、１ｍｌの抽出液をＴＬＣ及び
ＨＰＬＣ分析に使用した。放射性反応生成物（イムノマ
イシン）の分析のために酢酸エチル抽出液に標準イムノ
マイシンを加え、プラスチック・サポートのプレートを
使用してＴＬＣにかけた。プラスチック・シートをクロ
ロホルム：メタノール（９：１）中で展開し、ＵＶ光下
で標準イムノマイシンを示す領域を切りとって切片の放
射能を測定した。生成物の量は測定された放射能から計
算した。酵素反応生成物のＨＰＬＣ分析のために幾つか
の酵素反応混合液を集め、抽出液を上記のようにＴＬＣ
分析にかけた。標準イムノマイシンと一致するＲｆ値を
持つバンドを示すシリカゲル・プレートの領域を削りと
り、酢酸エチルで溶出した。酢酸エチル抽出物を水で洗
浄し、窒素ガス下で乾燥して残渣物を溶出溶媒としてア
セトニトリル：水：リン酸（６５：３５：０．１）を使
用したパーティシル・５−ＯＤＳ−３カラムでＨＰＬＣ
分析にかけた。１mlずつの画分を集め、各画分の１部を
とって放射能を検査した。

【０００８】３１−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（Ｄ
ＩＭＴ）の単離 （全ての手順は低温室内又は氷上で４℃で実行される）
洗浄した菌糸体を１ｍＭ・ＰＭＳＦ及び１ｍｇ／ｍｌの
リゾチームを含むpH７．５の５０ｍＭリン酸緩衝液に懸
濁した。得られた懸濁液を１晩攪拌し、１５，０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離した。次に得られたペレットを
マイクロチップ付き超音波発生器により３０秒間隔で２
分間超音波処理した。細胞ホモジネートを上述のように
遠心分離して上清を合せて１０５０００×ｇで４５分間
再遠心分離した。次に上清に１％硫酸ストレプトマイシ
ンに入れて３０分間攪拌し、上述のように１０５０００
×ｇで遠心分離した。粗製抽出物と呼ばれる、得られた
上清に０．１ｍＭ・Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン
（ＳＡＭ）及び１０％エタノールを含有させ、チロシン
生産微生物であるストレプトミセス・フラディ(Strepto
myces fradiae)からメチルトランスフェラーゼを単離す
るための緩衝液システムを踏習した。N.J.Bauern等、J.
B.C.２６３巻、１５６１９頁（１９８８年）参照）。次
に粗製抽出物を３０％硫酸アンモニウム飽和にして３０
分間の攪拌後に１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離
し、得られた上清を６０％硫酸アンモニウム飽和として
同一の攪拌及び遠心分離手順の後にその沈殿物を回収し
た。３０〜６０％区分と呼ばれる本画分はＰＤ−１０フ
ァルマシア・カラムを使用して、１ｍＭ・ＰＭＳＦ、
０．１ｍＭ・ＳＡＭ及び１０％エタノールを含むpH７．
５の５０ｍＭリン酸塩緩衝液に対して透析した。この画
分をＤＥＡＥ−セファロース含有カラムによりクロマト
グラフ処理した。このカラムを種々の濃度のＫＣｌを含
む緩衝液Ｌを使用して段階的に溶出した。ＤＩＭＴ活性
は０．３Ｍ・ＫＣｌを含む緩衝液で完全に溶出された。
ＤＩＭＴ活性画分を緩衝液Ｌに対して透析し、前もって
同じ緩衝液で平衡にした分取用モノＱ・ＨＲ１０／１０
ＦＰＬＣカラムを用いて処理した。６０ｍｌ／時間の流
速で緩衝液Ｌ中でゼロから１Ｍ・ＫＣｌまでの直線勾配
下１３０分かけて溶出させ１ｍｌづつの画分を集めてＤ
ＩＭＴ活性を検査した。ＤＩＭＴ活性を示す画分をまと
め、必要な処理後に分析用モノＱ・ＨＲ５／５ＦＰＬＣ
にかけた。このカラムをＫＣｌ濃度を０．５Ｍとした他
は上述のように展開した。分析用モノＱカラムから集め
た画分はＤＩＭＴ活性について検査し、活性画分をまと
め、クロマトフォーカシングにかけた。クロマトフォー
カシングはモノＰ・ＨＲ５／２０を用いてファルマシア
・ＦＰＬＣシステムでpH間隔７−４で行った。カラムは
ポリ緩衝液で展開し、１時間当り３０ｍｌの流量により
１ｍｌずつの画分を集めた。画分のpHは溶出後pH測定し
た後直ちに７．２に調整した。酵素アッセイは種々の画
分で行い、ＤＩＭＴ活性のピークは画分３５にあった。
次にこの画分をスパロース(Superose)−１２カラムで処
理した。このカラムを１５０ｍＭ・ＮａＣｌを含む緩衝
液Ｌを使用して１８ｍｌ／時間の流速で溶出し、０．３
ｍｌずつの画分を集めた。ＤＩＭＴ活性のピークを持つ
画分を最終的に１２．５％未変性ポリアクリルアミド電
気泳動（未変性ＰＡＧＥ）にかけた。電気泳動処理後に
ゲルの表面を横に切って切片を作成し、各ゲル切片を拡
散剤で溶出してＤＩＭＴ活性を評価した。ＤＩＭＴ活性
は同一ゲル上の標準卵アルブミンよりも高いＲｆ値をも
つゲル切片から溶出された画分に存在した。

【０００９】ＤＩＭＴの一般的性質 ＤＩＭＴ活性の至適温度、pH及び金属要求の評価はＤＥ
ＡＥ−セファロース・カラムから得られた酵素調製液を
用いて行った。キネティクス分析については第２次モノ
Ｑカラム・クロマトグラフ処理を経て精製した調製液を
利用した。ＤＩＭＴの分子量及び等電点の測定 本未変性酵素の分子量はスパロース−１２・カラムを用
いたゲル濾過クロマトグラフにより測定した。カラムを
平衡にして１５０ｍＭ・ＮａＣｌを含む緩衝液Ｌを使用
し１８ｍｌ／時間の流速で操作した。変性された酵素の
みかけの分子量はLaemmli （Nature（ロンドン）、２２
７巻、６８０−６８５頁（１９７０年））によるＳＤＳ
−ＰＡＧＥによって評価された。ゲル濾過及びＳＤＳ−
ＰＡＧＥの２法の処理には牛血清アルブミン（分子量＝
６６，０００）卵アルブミン（分子量＝４５，００
０）、炭酸脱水酵素（分子量＝３１，０００）、及びチ
トクローム Ｃ（分子量＝１２，４００）を標準物質と
して使用した。精製酵素の等電点は７−４のpH間隔でフ
ァルマシア・モノＰ・ＨＲ５／２０カラムを用いたクロ
マトフォーカシング及び３−９のpH間隔を持つ校正済等
電点分析ＰＡＧＥの２法により評価された。一般的分析方法 未変性ＰＡＧＥは緩衝液システムからＳＤＳを除いた上
記のレムリの方法により行った。蛋白質濃度は標準物質
として牛血清アルブミンを使用したバイオ−ラッド(Bio
-Rad) 蛋白質分析システムにより測定した。

【００１０】結果及び検討 菌糸発育及びイムノマイシン製造の時間的経過 沈降細胞容量及びイムノマイシン生成量を経時的に測定
しイムノマイシン生合成酵素の力価の指標とした。菌糸
体発育及びイムノマイシン製造の双方は菌体の培養７２
から９５時間で最大であった。それ故、ＤＩＭＴ酵素の
単離には７２時間培養した菌糸体の使用が決定された。ＤＩＭＴの性質及び局在性 最初に酵素アッセイはチロシン及びアベルメクチンのＳ
−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存メチル化に関して既
に報告されている分析システムに基づき、粗製酵素を使
用して確立した（Bauern N.J. 等、J.Biol.Chem.、２６
３巻、１５６１９頁（１９８８年）及びSchulmam,M.D.
等、Antimicrobial Agents Chemotherapeutics、２９
巻、６２０頁（１９８９年）参照）。この標品ではＳＡ
Ｍとマグネシウムイオンに対する絶対的な要求性を示
し、ＥＤＴＡは完全に活性を阻害した。また酵素活性は
硫酸アンモニウムによっても阻害されたが、この阻害は
完全な透析により回復した。至適反応温度及びpHもまた
それぞれ３５℃及び８．５として確立された。至適条件
を使用して１０５０００×ｇ遠心分離工程後に得られた
無細胞抽出物（粗製抽出物）中でのみ酵素活性が測定で
きた。粗製抽出物とペレットを再構成しても活性の増加
は観察されなかった。ＤＩＭＴの単離及び精製 至適評価条件を使用することにより７２時間培養の菌糸
細胞はＤＩＭＴ活性に関して機能を有する調製物を提供
した。この活性を含有する画分は硫酸アンモニウム沈
殿、ＤＥＡＥ−セファロース、分取及び分析用モノＱ、
クロマトフォーカシング及びスパロース−１２カラム・
クロマトグラフを含む一連の精製工程後に高純度で単離
された。分取用モノＱ、分析用モノＱ、クロマトフォー
カシングＰ及びスパロース−１２カラムからの画分の溶
出特性及びＤＩＭＴ活性が測定された。ＤＩＭＴは一貫
して比活性を増加させながら単一ピークで溶出された。
ＤＩＭＴの高純度は最終的にスパロース−１２カラムか
らの高純度画分を未変性ＰＡＧＥにかけた時に達成され
た。電気泳動後に未変性ポリアクリルアミドゲルから溶
出された画分は酵素的に活性があり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
（図４参照）及び等電点集束ゲルで単一バンドを示し
た。

【００１１】分子量及び等電点 精製されたＤＩＭＴの等電点はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びス
パロース−１２カラム・クロマトグラフにより測定され
た。精製されたＤＩＭＴは検量線をとったＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥからは約３２，０００のみかけの分子量を持つ単一
な均質バンドを示した（図４参照）。この調製物はまた
標準炭酸脱水酵素（分子量＝３１，０００）と同一の溶
出量で校正済スパロース−１２カラムから対称形で溶出
され、それ故、未変性酵素に対して３１，０００のみか
けの分子量を示している。精製されたＤＩＭＴの等電点
はクロマトフォーカシング及び校正済等電点集束−ＰＡ
ＧＥの２法により評価された。両法とも未変性酵素に対
してpH４．４の等電点を示した。

【００１２】Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡ
Ｍ）依存性及びマグネシウム・イオン要求性 ＤＩＭＴはその活性にＳＡＭ及びＭｇ⁺⁺を要求する。Ｅ
ＤＴＡ、サイニファンゲン(sinefungin)及びＳ−アデノ
シル−ホモシステイン（ＳＡＨ）によってもＤＩＭＴ活
性の主要な阻害が起ることが見出されこの酵素に対する
ＳＡＭ及びＭｇ⁺⁺の要求が再確認される。ＤＩＭＴのｐＨ及び温度依存性 ＤＩＭＴの至適活性はpH８．５及び温度３５℃で見られ
た。 反応速度論研究： 確立されたインキュベーション条件
を使用すると酵素反応速度は約６０μｇの量までは蛋白
質量に直接比例した。同様な条件下で２５μｇの蛋白質
を異なる時間でインキュベートすると初速度は３０分間
維持された。初速度を測定する条件下でＤＩＭＴのみか
けのＫｍ及びＶｍａｘが３１−Ｏ−デスメチルイムノマ
イシン及びＳＡＭを使用して測定された。３１−Ｏ−デ
スメチルイムノマイシンの速度論的利用性は４０μＭ・
ＳＡＭ存在下で測定し、１方、ＳＡＭの速度論的利用性
は共存基質として２５μＭの３１−Ｏ−デスメチルイム
ノマイシンを使用して測定した。３１−Ｏ−デスメチル
イムノマイシン及びＳＡＭに対するＤＩＭＴのみかけの
Ｋｍ及びＶｍａｘはラインウイーバー・バーク(Linewea
ver・Burk) 逆数プロットから決定された。グラフから得
られた反応速度パラメーターは、基質の３１−Ｏ−デス
メチルイムノマイシンの量を変えて測定した時にみかけ
のＶｍａｘ及びＫｍとして４５．５ｎｍｏｌ／時間／ｍ
ｇ及び１１μＭという値を示している。同様に、ＳＡＭ
の量を変化させて基質として用いた時にはＶｍａｘ及び
Ｋｍとして１００ｎｍｏｌ／時間／ｍｇ及び１２．５μ
Ｍという値が得られた。

【００１３】実施例２ １３、３１−ビスデスメチル環転位ＦＫ−９００５２０
（Ｌ−６８３，７５６）−構造III の合成 デキストリン１０．０、デキストロース１．０、ビーフ
・エキス３．０、アルダミンＰＨ（イースト・プロダク
ツ社(Yeast Prodcts,Inc.)) ５．０、Ｎ−Ｚアミン・タ
イプＥ５．０、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５、ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ０．３７、及びＣａＣＯ₃ ０．５（ｇ／Ｌの
単位）からなる５０ｍｌのオートクレーブ処理した（滅
菌した）種菌培地を含有する２５０ｍｌ容の隔壁付き振
盪フラスコに凍結乾燥した菌株（ＭＡ６５５９）ＡＴＣ
Ｃ Ｎｏ．５３７７１を接種した。種菌培地のpHはオー
トクレーブ処理前に７．１に調節した。種菌を２２０ｒ
ｐｍで運転する回転式振盪器上で２７℃で２４時間、種
菌培地中で培養した。別法として、凍結栄養菌糸又は斜
面培養菌を使用する時は菌株を種菌培地中で２２０ｒｐ
ｍで２７℃で２４時間培養する。得られた種菌培地の
２．５ｍｌ部分を５０ｍｌのオートクレーブ処理した
（滅菌した）変換培地Ｂを含有する２５０ｍｌの隔壁付
き振盪フラスコの接種用に使用した。ＦＫ−９００５２
０は最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ濃度となるようにジメ
チルスルホオキシドの溶液として加えた。次に振盪フラ
スコの内容物は２２０ｒｐｍで運転している回転式振盪
器上で２７℃で２４時間培養し、下記の手順に従って抽
出した。

【００１４】各ブロスの分離及び精製 変換培地Ｂの全ブロス（１００ｍｌ）を塩化メチレンで
３回（３×１００ｍｌ）抽出した。塩化メチレン抽出液
を合し、硫酸ナトリウム上で乾燥して、真空下でオイル
状の残渣物まで濃縮した。残渣物をアセトニトリルに溶
解し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）精製処理に
かけた。ＨＰＬＣはワットマン・パーティシル(Whatman
Partisil)１０ ＯＤＳ−３、９．４ｍｍ×２５ｃｍカ
ラムを用いて行い、６０℃で２０５ｎｍ及び２２５ｎｍ
で監視した。カラムは０．１％Ｈ₃ ＰＯ₄ 水溶液−ＣＨ
₃ ＣＮ４５：５５から０．１％Ｈ₃ ＰＯ₄ 水溶液−ＣＨ
₃ ＣＮ２０：８０までの直線勾配を用いて３ｍｌ／分の
流速で４０分間展開した。上述の抽出物を繰り返し注入
して化合物を集めた。保持時間１１．５分の画分をまと
め、pH６．５に調製し、アセトニトリルを除去するため
に蒸発させた。さらにＣ₁₈セプ−パック(Sep-Pac) （ウ
ォータース社(Waters Associates) 及びアセトニトリル
−水・溶出溶媒を使用して精製し、１．２ｍｇを得た。
本化合物をＬ−６８２，９９２と命名した。もしＬ−６
８２，９９３が存在すれば、それはモノ脱メチル化さ
れ、そのために極性が低下しているのでＬ−６８２，９
９２よりも滞留時間が長くなっているはずである。確認 Ｌ−６８３，７５６はＮＭＲ分光測定法により確認され
た。指定された分子構造は構造III として示されてい
る。

【００１５】実施例３ １５，３１−ビスデスメチル・ＦＫ−９００５２０（Ｌ
−６８６，２９２）構造ＩＶの合成 微生物及び培養菌の条件 凍結した栄養菌糸（ＭＡ６５５９）ＡＴＣＣ Ｎｏ．５
３７７１を解凍し、デキストリン１０．０、デキストロ
ース１．０、ビーフ・エキス３．０、アルダミンＰＨ
（イースト・プロダクツ社）５．０、Ｎ−Ｚアミン・タ
イプＥ５．０、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５、ＫＨ
₂ ＰＯ₄ ０．３７、及びＣａＣＯ₃ ０．５（単位ｇ
／Ｌ）からなる種菌培地５０ｍｌのオートクレーブ処理
した（滅菌した）種菌培地Ａを含有する２５０ｍｌの隔
壁付き振盪フラスコに接種した。種菌培地のpHはオート
クレーブ処理前に７．１に調節した。種菌を２２０ｒｐ
ｍで運転する回転式振盪器上で２７℃で２４時間、種菌
培地中で培養した。できた種菌培地の２．５ｍｌ部分を
次のような、あらかじめオートクレーブ処理した（滅菌
した）５０ｍｌの変換培地Ｂを含有する２５０ｍｌ容の
隔壁付き振盪フラスコに接種した。Ｌ−６８３，５９０
は最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌ濃度となるようにジメチ
ルスルホオキシドの溶液として加えた。その後、振盪フ
ラスコの内容物は２２０ｒｐｍで運転している回転式振
盪器上で２７℃で２４時間培養した。１、変換培地Ｂは
（ｇ／Ｌの単位で）グルコース１０．０；ハイケース
ＳＦ２．０；ビーフ・エキス１．０；コーン・スチープ
・リカー３．０；から構成され、pHはオートクレーブ処
理前に７．０に調整した。ブロス用の分離及び精製手順 変換培地Ｂの全ブロス（５００ｍｌ）を塩化メチレンで
３回（３×１００ｍｌ）抽出した。塩化メチレン抽出液
を合し、硫酸ナトリウム上で乾燥して、真空下でオイル
状の残渣物まで濃縮した。残渣物をアセトニトリルに溶
解し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）精製処理に
かけた。ＨＰＬＣはワットマン・パーティシル １０
ＯＤＳ−３、９．４ｍｍ×２５ｃｍカラムを用いて６０
℃で行い、２０５ｎｍ及び２２５ｎｍで監視した。カラ
ムは０．１％Ｈ₃ ＰＯ₄ 水溶液−ＣＨ₃ ＣＮ５５：４５
から０．１％ Ｈ₃ ＰＯ₄ 水溶液−ＣＨ₃ ＣＮ２０：８
０までの直線勾配を用いて３ｍｌ／分の流速で６０分間
展開した。上述の抽出物を繰り返し注入して化合物を集
めた。保持時間２５分の画分をまとめ、pH６．５に調整
し、アセトニトリルを除去するために蒸発させた。さら
にＣ₁₈セプ−パック（ウォータース社）及びアセトニト
リル−水・溶出溶媒を使用して精製し、１．２ｍｇの製
造物を得て、本化合物をＬ−６８２，２９２と命名し
た。確認 Ｌ−６８６，２９２は構造IVの指定された分子構造を確
認するＮＭＲ分光測定法により確認された。

【００１６】実施例４ １３、１５、３１−トリスデスメチル環転位・ＦＫ−９
００５２０（Ｌ−６８７，７９５）構造Ｖの合成 微生物及び培養菌の条件 凍結した栄養菌糸体（１．０ｍ．）（ＭＡ６５５９）Ａ
ＴＣＣ Ｎｏ．５３７７１を解凍し、（ｇ／Ｌの単位
で）デキストリン１０．０、デキストロース１．０、ビ
ーフ・エキス３．０、アルダミンＰＨ（イースト・プロ
ダクツ社）５．０、Ｎ−Ｚアミン・タイプＥ５．０、Ｍ
ｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．０５％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．
３７、及びＣａＣＯ₃ ０．５（単位ｇ／Ｌ）から形成
された５０ｍｌのオートクレーブ処理した（滅菌した）
種菌培地Ａを含有する２５０ｍｌ容の隔壁付き振盪フラ
スコへ接種した。種菌培地のpHはオートクレーブ処理前
に７．１に調節した。種菌は２２０ｒｐｍで運転する回
転式振盪器上で２７℃で２４時間、種菌培地中で培養し
た。できた種菌培地の２．５ｍｌを次のような、あらか
じめオートクレーブ処理した（滅菌した）５０ｍｌの変
換培地Ｂを含有する２５０ｍｌの隔壁付き振盪フラスコ
に接種した。Ｌ−６８３，５９０は最終濃度が０．１ｍ
ｇ／ｍｌ濃度となるようにジメチルスルホオキシドの溶
液として加えた。その後、振盪フラスコの内容物は２２
０ｒｐｍで運転している回転式振盪器上で２７℃で２４
時間培養した。１、変換培地Ｂは（ｇ／Ｌの単位で）グ
ルコース１０．０；ハイケース ＳＦ２．０；ビーフ・
エキス１．０；コーン・スチープ・リカー３．０；から
構成され、pHはオートクレーブ処理前に７．０に調整し
た。ブロス用の分離及び精製手順 変換培地Ｂの全ブロス（５００ｍｌ）を塩化メチレンで
３回（３×１００ｍｌ）抽出した。塩化メチレン抽出液
を合し、硫酸ナトリウム上で乾燥して、真空下でオイル
状の残渣物まで濃縮した。残渣物をアセトニトリルに溶
解し、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）精製処理に
かけた。ＨＰＬＣはワットマン・パーティシル １０
ＯＤＳ−３、９．４ｍｍ×２５ｃｍカラムを用いて６０
℃で行い、２０５ｎｍ及び２２５ｎｍで監視した。カラ
ムは０．１％Ｈ₃ ＰＯ₄ 水溶液−ＣＨ₃ ＣＮ５５：４５
から０．１％ Ｈ₃ ＰＯ₄ 水溶液−ＣＨ₃ ＣＮ２０：８
０までの直線勾配を用いて３ｍｌ／分の流速で６０分間
展開した。上述の抽出物の繰り返し注入中に化合物を集
めた。保持時間１２．５分の画分をまとめ、pH６．５に
調整し、アセトニトリルを除去するために蒸発させた。
さらにＣ₁₈セプ−パック（ウォータース社）及びアセト
ニトリル−水・溶出溶媒を使用して精製し、２．５ｍｇ
の製造物を得て、本化合物をＬ−６８７，７９５と命名
した。確認 Ｌ−６８７，７９５は構造Ｖの指定された分子構造を確
認するＮＭＲ分光測定法により確認された。

【００１７】実施例５ イムノマイシン（ＦＫ−５２０）に関連する新規な化合
物の製造における３１−Ｏ−デスメチルイムノマイシン
Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＤＩＭＴ） の基質特異性及び生合成能力 ストレプトミセス・ハイグロスコピクス（ＭＡ６６７８
−１６２ｘｐ１６）から分離された３１−Ｏ−デスメチ
ルイムノマイシン Ｏ−メチルトランスフェラーゼの高
純度標品の基質特異性は、¹⁴Ｃ−ＳＡＭ（Ｓ−アデノシ
ル−Ｌ−〔メチル−¹⁴Ｃ〕 メチオニンをメチル・ドナーとする標準評価条件下で、
基質として１３−Ｏ−モノ−：１３，３１−ビス−；１
５，３１−ビス−；及び１３，１５，３１−トリデスメ
チルイムノマイシンを使用することにより検査した。続
いて放射能を測定し、酵素反応生成物をＴＬＣ及びＨＰ
ＬＣの両方により分析した。１３−デスメチルイムノマ
イシンを除けば各々の場合に単一画分が存在し、これは
ＴＬＣ板のＲｆ値及びカラムからの溶出時間に基づいて
考えると各基質の３１−Ｏ−位置での特異的メチル化が
示唆される。１３−Ｏ−デスメチルイムノマイシンを基
質として使用した際に何の反応も生じなかった。より多
くの酵素反応製造物を得て化学的確認及び生物化学的活
性測定を行うために大スケールの酵素アッセイ法が開発
され、各基質に対して最適化された。そして各々の場合
に生成物は次のように分離、確認された。

【００１８】１５−Ｏ−デスメチルイムノマイシン−構
造VII の生合成 １５，３１−ビス−デスメチルイムノマイシン（構造I
V）はＨＰＬＣ精製後の基質として使用された。大規模酵素アッセイ 。 反応混合物は５０ｍＭのリン酸
塩緩衝液を用いて総量１０ｍｌとした中に、部分的に精
製した画分の３５ｍｇの蛋白質；２ｍＭの硫酸マグネシ
ウム；６．２５μＭの基質；６０μＭのＳＡＭを含む
（pH７．３０）。反応は前述のようなインキュベーショ
ン条件下でＳＡＭを添加することにより開始された。反
応混合物を酢酸エチルで抽出し、終了後にクロロホル
ム：メタノール（９：１）を溶媒として使用するＴＬＣ
システムにかけた。¹⁴Ｃ−ＳＡＭを使用する対応する実
験で放射能の分離から確認されたＲｆ値を持つＴＬＣプ
レート部分からのシリカゲルを削りとり、酢酸エチルを
用いて徹底的に溶出した。次に酢酸エチル抽出物を逆相
ＨＰＬＣによる精製用に調整した。逆相ＨＰＬＣシステ
ムは水：アセトニトリル：リン酸（４５：５５：０．
１）からなる溶媒系中で６０℃で行われた。¹⁴Ｃ−ＳＡ
Ｍを使用した酵素アッセイの生成物について既に確立さ
れた溶出時間に相当する時点で溶出する画分を集めて、
まとめた。次にまとめた画分を更に生物学的試験及び化
学的確認のために精製した。高速原子衝撃（ＦＡＢ）マス及びＮＭＲ分光分析 上記
のように分離した酵素反応生成物をＦＡＢにより検査
し、７７７の分子量を持ち、１５−デスメチルイムノマ
イシンである、構造VII を確認した。

【００１９】１３，１５−ビス−デスメチルイムノマイ
シン（構造VIII）の生合成 一連の実験で１３，１５，３１−トリデスメチルイムノ
マイシン（構造Ｖ）は、１５−Ｏ−デスメチルイムノマ
イシンの生合成のために行われた方法と同様の酵素反応
の基質として使用された。この酵素反応生成物は同様に
ＴＬＣ及びＨＰＬＣ溶出特性に基づいた構造VIIIとして
分離された。１３（１４）−ＯＨ−イムノマイシン（構造VI）の生合
成 上と同様な実験で１３（１４），３１−ビスデスメチル
イムノマイシン（構造III ）を酵素反応の基質として用
い、生成物が分離された。分離された生成物はＴＬＣ及
び逆相ＨＰＬＣにおけるＲｆ値及び溶出時間がそれぞれ
標準品の１３−（１４）−ＯＨ−イムノマイシン構造VI
と一致した。 １５−Ｏ−（構造VII ）；及び１３，１５−ビス−デス
メチルイムノマイシン（構造VIII）の生物学的活性 酵素により製造された１５−Ｏ−デスメチルイムノマイ
シン及び１３，１５−ビスデスメチルイムノマイシンの
ＨＰＬＣ精製サンプルを生物学的活性について検査し
た。結果は下記の表１に示されている。

【００２０】実施例６ Ｔ−細胞増殖アッセイ １、サンプルの調製 上記のＨＰＬＣで調製されたＬ−６８６，７９５（構造
Ｖ）、構造VIII、Ｌ−６１６，２９２（構造IV）及び構
造VII の精製されたサンプルはそれぞれ１０ｍｇ／ｍｌ
で無水アルコールに溶解した。 ２、アッセイ Ｃ５７Ｂ１／６マウスから脾臓を滅菌条件下で採取し、
１０％熱不活性化牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ、グランド・
アイランド、ニューヨーク）で補強した氷冷ＲＰＭＩ１
６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ）中で徐々に解離させた。
細胞を１５００ｒｐｍで８分間遠心分離することにより
ペレット化した。ペレットを塩化アンモニウム溶解緩衝
液（ＧＩＢＣＯ）を使用して４℃で２分間処理すること
により混入した赤血球を除去した。冷培地を加えて細胞
を再度１５００ｒｐｍで８分間遠心分離した。次に下記
のようにナイロンウールカラム上で細胞懸濁液を分離す
ることによりＴ−リンパ球を単離した：約４ｇの洗浄し
て乾燥したナイロンウールを２０ｍｌのプラスチック製
注射筒に充填することによりナイロンウールカラムを調
製した。カラムは１１５℃でオートクレーブして滅菌し
た。ナイロンウールカラムを温（３７℃）培養培地を用
いて湿らせ、同じ培地で洗浄した。温培地に再懸濁した
洗浄済み脾臓細胞をゆっくりとナイロンウールに移し
た。次にカラムを直立状態で３７℃で１時間インキュベ
ートした。非付着性Ｔ−リンパ球は温培地と共にカラム
から溶出され、細胞懸濁液は上記のように保持される。
精製したＴ−リンパ球を１０％熱−不活性化牛胎児血
清、１０ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウ
ム、２×１０^-5Ｍ・２−メルカプトエタノール及び５０
ｍｇ／ｍｌゲンタマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地
から成る完全培養培地に２．５×１０⁵ 細胞／ｍｌで懸
濁した。イオノマイシンは２５０ｍｇ／ｍｌで加え、Ｐ
ＭＡは１０ｎｇ／ｍｌで加えた。細胞懸濁液を直ちに２
００μｌ／ウェルずつ９６穴平底ミクロ培養プレート
（コースター）中に分注した。次に試薬を含まない培地
であるコントロール及び試験すべき種々の下記のサンプ
ル希釈液（上述のIV、Ｖ、VII 、VIIIの精製サンプル）
を２０μｌずつ３連でウェルに加えた。次に培養プレー
トを５％ＣＯ₂ −９５％空気の加湿環境中で４４時間培
養した。Ｔ−リンパ球の増殖はトリチウム化チミジンの
取り込みを測定することにより評価した。４４時間の培
養後、培養細胞をトリチウム化チミジン（ＮＥＮ、ケン
ブリッジ市、マサチューセッツ州）を２μＣｉ／ウェル
で使用してパルスラベルした。更に４時間の培養後、培
養細胞をマルチサンプルハーベンスターを使用してガラ
ス繊維フィルター上に採取した。個々のウェルに対応す
るフィルター・ディスクの放射能を標準液体シンチレー
ション計測法（ベータカウンター）により測定した。く
りかえしのウェルの１分間当りの平均値を計算し、次の
ように結果をトリチウム化チミジンの取り込み（増殖）
抑制％として表した： テスト・サンプルの種々の濃度での抑制％の結果は次の
表１に示した。ここで構造IVは純粋な拮抗剤であり、構
造VII は割合低い投与量では拮抗剤であるがより高投与
量及び極めて低い投与量では作用剤／拮抗剤の混合型で
あることが示されている。

【表３】 表１ イオノマイシン＋ＰＭＡで刺激されたＴ細胞の増殖反応における１５−デスメチ ル５９０及び１５，３１−デスメチル−５９０の影響 ──────────────────────────────────── サンプル 濃 度 ％抑制 （ｎｇ／ｍｌ） ＦＫ−５０６ ＋ＦＫ−５０６ なし （０．６ｎＭ） ──────────────────────────────────── 培地（コントロール） ０ ９８ １５−デスメチル １０００ １００ ９９ （VII ） ５００ ７４ ７０ ２５０ ５６ ６０ １２５ ４２ ４７ ６２ ４１ ４９ ３１ ４３ ８１ １６ ９ ８８ ８ ５ ９６ １５，３１−デスメチル １０００ ６ ４０ ５００ ０ ３６ ２５０ ０ ４５ １２５ ０ ６８ ６２ ０ ７７ ３１ ０ ９８ ──────────────────────────────────── イオノマイシン＋ＰＭＡ活性化Ｔ細胞の増殖反応はＭＴ
Ｔ比色分析により測定された。これらのデータにより：
１５−デスメチル−５９０（VII ）は作用剤／拮抗剤の
混合型であり、１５，３１−デスメチル−５９０（IV）
は純粋な拮抗剤である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＤＣｌ₃ 中のＬ−６８３，５９０（イムノマ
イシン又はＦＫ−９００５２０又はＦＲ−９００５２
０）の４００ＭＨｚにてとった１^H ＮＭＲスペクトル及
びその分子構造を示す図である。

【図２】１５−３１−ビスデスメチルイムノマイシンの
４００ＭＨｚにてとった１^H ＮＭＲスペクトル及びその
分子構造を示す図である。

【図３】１５−デスメチルイムノマイシンの４００ＭＨ
ｚにてとった１^H ＮＭＲスペクトル及びその分子構造を
示す図である。

【図４】ＤＩＭＴのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラム図
であり、この方法により約３２、０００の分子量を示す
ものである。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成４年１２月１７日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】 ここで置換基の各隣接した１組：Ｒ¹ 及びＲ² ；Ｒ³ 及
びＲ⁴ ；Ｒ⁵ 及びＲ⁶はそれぞれ： ａ）２つの隣接する水素原子を表す、又は ｂ）上記置換基がついている隣接炭素原子間に第２の結
合を形成する；上に示した意味に加えて、Ｒ² はＣ₁ −
Ｃ₁₀アルキル基を表してもよい；Ｒ⁷ はＨ、ＯＨ、又は
Ｏ−Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、又はＲ¹ と一緒になって＝Ｏ
を表す；Ｒ⁸ 及びＲ⁹ は独立にＨ又はＯＨを表す；Ｒ¹⁰
はＨ；Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、ここでいわゆるアルキルは
１個又はそれ以上のヒドロキシル基で置換してもよい；
１個又はそれ以上のヒドロキシル基で置換してもよいＣ
₁ −Ｃ₁₀アルケニル、又は＝Ｏにより置換されたＣ₁ −
Ｃ₁₀アルキルを表す；ＸはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、（Ｈ、
Ｈ）又は−ＣＨ₂ Ｏ−を表す；ＹはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、
（Ｈ、Ｈ）、Ｎ−ＮＲ¹¹Ｒ¹²又はＮ−ＯＲ¹³を表す。こ
こで、Ｒ¹¹及びＲ¹²はそれぞれＨ、 Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、 アリール又はトシルを表す、及びＲ¹³、Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ
¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²²及びＲ²³は独立にＨ又はＣ
₁ −Ｃ₁₀アルキルを表す；ｎは１、２、又は３である；
上に示したものに加えて、Ｙ、Ｒ¹⁰及びＲ²³はそれらが
ついている炭素原子と一緒に５個又は６個の部分からな
るＮ−、Ｓ−、Ｏ−含有ヘテロサイクリック環を表して
もよく、この環は飽和又は不飽和であり、Ｃ₁ −Ｃ₁₀ア
ルキル、ヒドロキシル、１個又はそれ以上のヒドロキシ
ル基により置換されたＣ₁ −Ｃ₁₀アルキル、Ｏ−Ｃ₁ −
Ｃ₁₀アルキル、ベンジル及び−ＣＨ₂ Ｓｅ（Ｃ₆ Ｈ₅ ）
から選択される１個又はそれ以上の基により置換しても
よい。もしＸ及びＹが共にＯを表す場合には；Ｒ⁹ はＯ
Ｈを表す；Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹及びＲ
²²は各々メチルを表す；Ｒ⁸ 及びＲ²³は各々Ｈを表す；
〔Ｒ³ 及びＲ⁴ 〕及び〔Ｒ⁵及びＲ⁶ 〕は各々炭素−炭
素結合を表す。

【化２】 ここで：ＷはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、（Ｈ、Ｈ）である；Ｒ
はＨ、ＣＨ₃ である；Ｒ² は水素、ヒドロキシ又は低級
アルカノイルオキシである、Ｒ³ はメチル、エチル、プ
ロピル及びアリルである、ｎは１又は２の整数であり、
線及び点線の記号は一重結合又は二重結合である。

【化３】

【化４】

【化５】

【化６】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:55） (72)発明者 ルイス カプラン アメリカ合衆国，10956 ニューヨーク, ニューシティ，レキシントン ロード ７ (72)発明者 フランシス デュモン アメリカ合衆国，07065 ニュージャーシ ィ，ローウェイ，ウエスト チェリー ス トリート 54 (72)発明者 ローレンス エフ．コルウェル，ジュニア アメリカ合衆国，07724 ニュージャーシ ィ，イートンタウン，プリンセス レーン ５ (72)発明者 バイロン エッチ．アリソン アメリカ合衆国，07060 ニュージャーシ ィ，ウォッチュング，センチュリー レー ン 88

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量
   が約３２キロダルトンであり、等電点（ＰＩ）が４．４
   であって、Ｃ−３１ヒドロキシ基を含むＦＫ−５０６型
   分子のＣ−３１・Ｏ−メチル化を、Ｍｇ⁺²イオンを補足
   した場合にメチル転移試薬の存在下で触媒することがで
   きる精製酵素ＤＩＭＴを含む組成物。
2. 【請求項２】 Ｃ−３１ヒドロキシ基含有ＦＫ−５０６
   型分子のＣ−３１ヒドロキシ基をメチル化するための方
   法であって、ＦＫ−５０６型分子を請求項１に記載した
   ＤＩＭＴ酵素の存在下で、Ｍｇ⁺²イオンを補足し、その
   ための水溶液中で反応を行わせることによりメチル転移
   試薬であるＳアデノシルメチオニンと接触させる工程を
   含む方法。
3. 【請求項３】 pHが７−９で行われる請求項２の方法
4. 【請求項４】 温度範囲が２５−４０℃で行われる請求
   項２の方法
5. 【請求項５】 いわゆるＦＫ−５０６型分子が次式およ
   び、存在するアミン基の酸付加塩を含めた医薬的に許容
   されるその塩である請求項２の方法： 【化１】 ここで置換基の各隣接した１組：Ｒ¹ 及びＲ² ；Ｒ³ 及
   びＲ⁴ ；Ｒ⁵ 及びＲ⁶はそれぞれ： ａ）２つの隣接する水素原子を表す、又は ｂ）上記置換基がついている隣接炭素原子間に第２の結
   合を形成する；上に示した意味に加えて、Ｒ² はＣ₁ −
   Ｃ₁₀アルキル基を表してもよい；Ｒ⁷ はＨ、ＯＨ、又は
   Ｏ−Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、又はＲ¹ と一緒になって＝Ｏ
   を表す；Ｒ⁸ 及びＲ⁹ は独立にＨ又はＯＨを表す；Ｒ¹⁰
   はＨ；Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、ここでいわゆるアルキルは
   １個又はそれ以上のヒドロキシル基で置換してもよい；
   １個又はそれ以上のヒドロキシル基で置換してもよいＣ
   ₁ −Ｃ₁₀アルケニル、又は＝Ｏにより置換されたＣ₁ −
   Ｃ₁₀アルキルを表す；ＸはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、（Ｈ、
   Ｈ）又は−ＣＨ₂ Ｏ−を表す；ＹはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、
   （Ｈ、Ｈ）、Ｎ−ＮＲ¹¹Ｒ¹²又はＮ−ＯＲ¹³を表す。こ
   こで、Ｒ¹¹及びＲ¹²はそれぞれＨ、 Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、 Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル又はトシルを表す、及びＲ¹³、
   Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹、Ｒ²²及びＲ²³は
   独立にＨ又はＣ₁ −Ｃ₁₀アルキルを表す；ｎは１、２、
   又は３である；上に示したものに加えて、Ｙ、Ｒ¹⁰及び
   Ｒ²³はそれらがついている炭素原子と一緒に５個又は６
   個の部分からなるＮ−、Ｓ−、Ｏ−含有ヘテロサイクリ
   ック環を表してもよく、この環は飽和又は不飽和であ
   り、Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、ヒドロキシル、１個又はそれ
   以上のヒドロキシル基により置換されたＣ₁ −Ｃ₁₀アル
   キル、Ｏ−Ｃ₁ −Ｃ₁₀アルキル、ベンジル及び−ＣＨ₂
   Ｓｅ（Ｃ₆ Ｈ₅ ）から選択される１個又はそれ以上の基
   により置換してもよい。もしＸ及びＹが共にＯを表す場
   合には；Ｒ⁹ はＯＨを表す；Ｒ¹⁴、Ｒ¹⁵、Ｒ¹⁶、Ｒ¹⁷、
   Ｒ¹⁸、Ｒ¹⁹及びＲ²²は各々メチルを表す；Ｒ⁸ 及びＲ²³
   は各々Ｈを表す；〔Ｒ³ 及びＲ⁴ 〕及び〔Ｒ⁵及びＲ
   ⁶ 〕は各々炭素−炭素結合を表す。
6. 【請求項６】 いわゆるＦＫ−５０６型化合物が次式お
   よびその医薬的に許容される塩基性塩である請求項５の
   方法 【化２】 ここで：ＷはＯ、（Ｈ、ＯＨ）、（Ｈ、Ｈ）である；Ｒ
   はＨ、ＣＨ₃ である；Ｒ² は水素、ヒドロキシ又は低級
   アルカノイルオキシである、Ｒ³ はメチル、エチル、プ
   ロピル及びアリルである、ｎは１又は２の整数であり、
   線及び点線の記号は一重結合又は二重結合である。
7. 【請求項７】 該ＦＫ−５０６型化合物が式Ａの化合物
   であって式中：Ｒ¹ はＣＨ₃ である；Ｒ² はヒドロキシ
   である；Ｒ³ はエチルである；ｎは２である、請求項６
   記載の方法。
8. 【請求項８】 該ＦＫ−５０６型化合物が式Ａの化合物
   であって式中：ＲはＨである；Ｒ² はヒドロキシであ
   る；Ｒ³ はエチルである；ｎは２である、請求項６記載
   の方法。
9. 【請求項９】 該ＦＫ−５０６型化合物が次式のもので
   ある請求項７の方法： 【化３】
10. 【請求項１０】 該ＦＫ−５０６型化合物が次式のもの
    である請求項５の方法： 【化４】
11. 【請求項１１】 次式の化合物 【化５】
12. 【請求項１２】 次式の化合物 【化６】