CN102408435B - 一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法 - Google Patents
一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102408435B CN102408435B CN201110200242.1A CN201110200242A CN102408435B CN 102408435 B CN102408435 B CN 102408435B CN 201110200242 A CN201110200242 A CN 201110200242A CN 102408435 B CN102408435 B CN 102408435B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ascosin
- organic solvent
- ethyl acetate
- liquid
- volume ratio
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- ZDQSOHOQTUFQEM-XCXYXIJFSA-N ascomycin Natural products CC[C@H]1C=C(C)C[C@@H](C)C[C@@H](OC)[C@H]2O[C@@](O)([C@@H](C)C[C@H]2OC)C(=O)C(=O)N3CCCC[C@@H]3C(=O)O[C@H]([C@H](C)[C@@H](O)CC1=O)C(=C[C@@H]4CC[C@@H](O)[C@H](C4)OC)C ZDQSOHOQTUFQEM-XCXYXIJFSA-N 0.000 title abstract description 4
- ZDQSOHOQTUFQEM-PKUCKEGBSA-N ascomycin Chemical compound C/C([C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@]2(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)[C@@H](OC)C[C@@H](C)C\C(C)=C/[C@H](C(C[C@H](O)[C@H]1C)=O)CC)=C\[C@@H]1CC[C@@H](O)[C@H](OC)C1 ZDQSOHOQTUFQEM-PKUCKEGBSA-N 0.000 title abstract 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 title abstract 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 20
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims abstract description 19
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims abstract description 19
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000010898 silica gel chromatography Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims abstract description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 72
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 61
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 40
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 31
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 20
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 claims description 19
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 15
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims description 11
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 10
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 claims description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 239000013078 crystal Substances 0.000 claims description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 claims description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 5
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 5
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 claims description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 claims description 5
- 241000208340 Araliaceae Species 0.000 claims description 4
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims description 4
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 claims description 4
- SWXVUIWOUIDPGS-UHFFFAOYSA-N diacetone alcohol Natural products CC(=O)CC(C)(C)O SWXVUIWOUIDPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 4
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 claims description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N Cyclohexane Chemical group C1CCCCC1 XDTMQSROBMDMFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 2
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 abstract 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 6
- ZDQSOHOQTUFQEM-NURRSENYSA-N ascomycin Chemical compound C/C([C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@]2(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)[C@@H](OC)C[C@@H](C)C/C(C)=C/[C@H](C(C[C@H](O)[C@H]1C)=O)CC)=C\[C@@H]1CC[C@@H](O)[C@H](OC)C1 ZDQSOHOQTUFQEM-NURRSENYSA-N 0.000 description 6
- UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;methanol Chemical compound OC.CCOC(C)=O UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N Tacrolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1\C=C(/C)[C@@H]1[C@H](C)[C@@H](O)CC(=O)[C@H](CC=C)/C=C(C)/C[C@H](C)C[C@H](OC)[C@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)O[C@@]2(O)C(=O)C(=O)N2CCCC[C@H]2C(=O)O1 QJJXYPPXXYFBGM-LFZNUXCKSA-N 0.000 description 4
- 229960001967 tacrolimus Drugs 0.000 description 4
- QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N tacrolimus Natural products CO[C@H]1C[C@H](CC[C@@H]1O)C=C(C)[C@H]2OC(=O)[C@H]3CCCCN3C(=O)C(=O)[C@@]4(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]4C)OC)[C@@H](C[C@H](C)CC(=C[C@@H](CC=C)C(=O)C[C@H](O)[C@H]2C)C)OC QJJXYPPXXYFBGM-SHYZHZOCSA-N 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000345998 Calamus manan Species 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- KASDHRXLYQOAKZ-ZPSXYTITSA-N pimecrolimus Chemical compound C/C([C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@]2(O)O[C@@H]([C@H](C[C@H]2C)OC)[C@@H](OC)C[C@@H](C)C/C(C)=C/[C@H](C(C[C@H](O)[C@H]1C)=O)CC)=C\[C@@H]1CC[C@@H](Cl)[C@H](OC)C1 KASDHRXLYQOAKZ-ZPSXYTITSA-N 0.000 description 3
- 229960005330 pimecrolimus Drugs 0.000 description 3
- 235000012950 rattan cane Nutrition 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 241001132350 Streptomyces sp. NJYH2618 Species 0.000 description 1
- 241000218527 Streptomyces tubercidicus Species 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000012225 czapek media Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000011486 lichen planus Diseases 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000003120 macrolide antibiotic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041033 macrolides Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法，属于生物工程领域。采用发酵液过滤、菌丝体超声破碎、大孔树脂吸附、硅胶柱层析及结晶技术得到子囊霉素纯品。本发明采用超声破碎大幅度提高提取效率，操作方便、工艺简单、成本低、效率高，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从发酵液中提纯子囊霉素的工艺，属于生物工程领域，具体涉及生物制药，发酵产物的提取、分离和纯化方法，特别涉及一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法。
背景技术
子囊霉素(Ascomycin，Immunomycin，FK-520)为二十三碳的大环内酯类化合物，是免疫抑制剂FK-506(他克莫司，tacrolimus)乙基类似物，40多年前日本藤泽制药公司从含有吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的土壤中分离得到。自从其结构类似物他克莫司的免疫抑制活性被发现后，迅速推动了子囊霉素及其衍生物的免疫抑制活性研究。研究发现子囊霉素具有很强的免疫抑制剂作用，目前子囊霉素已被用作生产半合成API(如吡美莫司)的中间体。吡美莫司是第一个被设计用于皮肤病的子囊霉素衍生物，由子囊霉素经缩环反应而形成。吡美莫司主要应用于特应性皮炎(AD)、变应性接触性皮炎、银屑病，红斑狼疮，扁平苔藓，白癜风，Nethenton综合症，移植物抗宿主病等自身免疫疾病的治疗。
近年来国内外主要选用以吸水链霉菌为代表的微生物发酵法来生产子囊霉素。1962年，日本藤泽制药公司首次从壤中分离的吸水链霉菌Streptomyceshygroscopicus No.KK317的发酵液中提取得到子囊霉素。特别是二十世纪八十年代末，Fujisawa及Abbott公司从吸水链霉菌变种的发酵液中发现了FR-900520和ATCC14891，它们在光谱、色谱、化学结构上与子囊霉素相同。2008年，匈牙利科学家Attila Kónya等从土壤中筛选到一株子囊霉素产生菌Streptomycestubercidicus DSMZ42761，证实了非吸水链霉菌也能产生子囊霉素的事实。
国内对子囊霉素的研究尚处于起步阶段，中国专利CN101036649公开了子囊霉素作为免疫抑制剂在制备治疗自身免疫性糖尿病和皮肤抑制排斥反应的药物中的用途。昆明理工大学穆云龙通过对子囊霉素菌种选育及发酵条件的的初步研究，发酵培养96小时，发酵效价最高可达131.7mg/L。但对于如何分离提取产物并为具体说明。1988年日本藤泽制药公司报道提取子囊霉素的方法。由于发酵液中会存在多种子囊霉素类似物且由于子囊霉素在水相中存在异构现象，而提取分离方法中多含有水相，这就使得从发酵液中提纯子囊霉素主要技术研究存在较大技术难度。
目前对于子囊霉素的大部分研究工作集中在子囊霉素发酵、子囊霉素衍生物的开发、抗菌活性及临床应用等方面。现阶段子囊霉素分离提取的主要问题是子囊霉素的收率不高，分离成本高等问题。另外，由于子囊霉素在水相中存在异构现象，目前提取分离方法中多含有水相，产品中含有子囊霉素结构类似物，影响产品纯度及产品形态。而我国目前还未有子囊霉素工业化生产报道，其市场基本被日本和美国等国外公司占领。因此，本领域迫切需要提供一种生产成本低廉、适合于工业化生产的提纯子囊霉素的生产方法。
发明内容
本发明的目的是为了改进现有技术中存在的缺陷或不足，而提供了一种采用从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法，操作方便、工艺简单、降低了成本、提高了效率，适合工业化生产。
本发明的技术方案如下：一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法，其特征在于采用发酵液过滤、菌丝体超声破碎提取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析和结晶技术得到子囊霉素纯品。其具体步骤如下：
1)将链霉菌发酵液过滤，分别收集滤液及菌丝体；菌丝体采用超声波辅助提取3～5次，控制体系pH值，收集提取液，与滤液合并，得合并液；
2)将步骤1)中得到的合并液，经微滤膜过滤后，微滤透过液进入超滤膜过滤，得滤液，转移到装有大孔树脂的床层进行吸附；并用4～5倍大孔树脂柱床体积的有机溶剂进行冲洗，1～3倍的大孔树脂柱床体积的有机溶剂进行解吸，控制柱床温度，收集解吸液；
3)将步骤2)收集的解吸液真空浓缩，旋干，得油状物；
4)将步骤3)中得到的油状物用有机溶剂溶解，油状物质量与有机溶剂体积比1∶20～1∶30g/ml，上样层析硅胶柱，上样液进入层析硅胶后用4～6倍硅胶体积的洗脱剂洗脱，收集含子囊霉素的活性组分；
5)将步骤4)收集的含子囊霉素的活性组分经真空浓缩旋干，并用其质量体积比为1∶10～1∶20g/ml的有机溶剂溶解，将温度降低到0～10℃，保温使子囊霉素结晶析出；冷冻离心，得到子囊霉素一次结晶；
6)将步骤5)得到的子囊霉素晶体用有机溶剂搅拌溶解后，加入该溶解液5～10倍体积的结晶溶剂静置，结晶得到子囊霉素。
优选步骤1)中超声波辅助提取中所用有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯或乙醇；菌丝体与有机溶剂质量体积比为1∶10～1∶15g/ml；超声频率为25～50KHz；功率为100～200W；超声提取时间为10～45分钟；控制体系PH值为6～9。
优选所述的步骤2)中冲洗时，有机溶剂为体积浓度50％～60％乙醇水溶液或50％～60％甲醇水溶液；解吸时，有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮或甲醇；控制柱床温度为20～35℃。
优选步骤4)中有机溶剂与洗脱剂均为体积比10∶1～15∶1的乙酸乙酯和甲醇混合溶液。
优选步骤5)中有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮或甲醇；降温速率为10～20℃/h；结晶时间为10～20小时。
优选步骤6)中搅拌溶解的有机溶剂为丙酮、甲醇或乙酸乙酯；晶体与有机溶剂质量体积比为1∶25～1∶45g/ml；搅拌温度为25～35℃；结晶溶剂为环己烷或正己烷；结晶溶剂的加入时间为5～20分钟；结晶温度为15～25℃；结晶时间为3～10小时。
优选步骤3)和步骤5)中真空浓缩的温度为30～40℃。
本发明所述链霉菌发酵液中的链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Streptomyces sp.，参据的微生物：NJYH2618，保藏日期是2008年5月26日，保藏中心登记入册编号是CGMCC NO.2519。
上述链霉菌Streptomyces sp.，参据的微生物(株)：NJYH2618是由本实验室从南京中山陵地区的土壤中，初筛得到31株能抑制假丝酵母生长的放线菌；经摇瓶复筛，用HPLC(高效液相色谱)检测获得一株子囊霉素产生菌，通过生理生化特性实验和16S rDNA序列相似性分析，分类鉴定命名为链霉菌，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.2519，保藏日期是：2008年5月26日。以此菌种作为生产菌株。
CGMCC No.2519菌株具有下述性质：
1、形态特征：
菌株在高氏一号培养基上生长中度，气生菌丝生长中度，孢子丝呈波曲状，孢子成链状排列，在电子显微镜下孢子成椭圆形。
2、培养特征：
28℃培养7-14天，观察菌株在下列各种培养基上的特征。
表1CGMCC No.2519菌株的培养特征
| 培养基 | 气生菌丝 | 基内菌丝 | 可溶性色素 |
| 高氏合成一号 | 灰蓝色 | 褐白色 | 无 |
| 克氏合成一号 | 灰白色 | 白色 | 无 |
| 察氏琼脂培养基 | 灰白色 | 褐白色 | 无 |
| 马铃薯浸汁琼脂 | 灰蓝色 | 褐黄色 | 无 |
| 肉汤培养基 | 灰白色 | 褐黄色 | 无 |
| 燕麦琼脂培养基 | 灰蓝色 | 褐黄色 | 无 |
3、生理生化性质：
表2CGMCC No.2519菌株的生理生化性质
+：为可利用；-：为不可利用
4、16S rDNA序列分析
用溶菌酶法从新鲜菌体提取基因组DNA，采用链霉菌通用引物进行16SrDNA扩增，PCR产物经检测、纯化后交由TAKARA公司进行测序。所测的16SrDNA序列经校对、拼接后与GenBank数据库中相关种属的序列进行BLAST比较得知，菌种Streptomyces sp.NJYH2618(CGMCC No.2519)属于链霉菌
测得16S rDNA大部分序列1433bp，具体如下：
5`-CATGCAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATAACACTTCCACTCTCCTGGGTGGAGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGGTGTGAAAGACCGGGGCTTAACCCCGGTTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTTGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCAGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCTGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGTCGTAACAA-3`
有益效果：
采用本发明提纯子囊霉素，通过对子囊霉素发酵液采用发酵液过滤、超声辅助提取、微滤、超滤、大孔树脂吸附、硅胶柱层析、结晶得到子囊霉素纯品且晶形较为理想，纯度＞98.5％，收率81％～91％。本发明较已报道方法大幅度缩短提取时间，提高了效率，且较少使用水相溶剂，减少了子囊霉素结构类似物，具有操作方便、工艺简单和成本低等特点，易于工业化生产，为子囊霉素的生产提供了可行的提取工艺。
保藏信息
上述链霉菌Streptomyces sp.，参据的微生物(株)：NJYH2618是由本实验室选育并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区大屯路甲3号，中国科学院微生物研究所)，其简称为CGMCC，登记入册的编号是CGMCC No.2519，保藏日期是：2008年5月26日
具体实施方式
以下结合实例来进一步解释本发明，但实施案例并不对本发明做任何形式的限定。
实施例1
1)将链霉菌CGMCC No.2519发酵液过滤，分别收集滤液及菌丝体。菌丝体采用超声波辅助提取3次，超声波辅助提取中所用有机溶剂为甲醇，菌丝体与甲醇质量体积比(g/ml)为1∶15，超声频率为45KHz，功率为120W，超声提取时间为30分钟，体系pH6.5，收集提取液，与滤液合并，得合并液；
2)将步骤1)中得到的合并液，经微滤膜过滤后，微滤透过液进入超滤膜过滤，得滤液，转移到装有SP207大孔树脂的床层进行吸附；并用4倍大孔树脂柱床体积的60％乙醇进行冲洗，1倍大孔树脂柱床体积的乙酸乙酯进行解吸，柱床温度25℃，收集解吸液；
3)将步骤2)收集的解吸液在30℃下真空浓缩，旋干，得油状物；
4)将步骤3)中得到的油状物用与其质量体积比(g/ml)为1∶20的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯∶甲醇＝15∶1，V/V)混合溶液溶解，上样层析硅胶柱，上样液进入层析硅胶后用4倍硅胶体积的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，V/V)洗脱，收集含子囊霉素的活性组分；
5)将步骤4)收集的含子囊霉素的活性组分经30℃真空浓缩旋干，并用其质量体积比(g/ml)为1∶10的丙酮溶解，以20℃/h将温度降低到5℃，保温10h使子囊霉素结晶析出；冷冻离心，得到子囊霉素一次结晶；
6)将步骤5)得到的子囊霉素晶体在25℃下用与其质量体积比(g/ml)为1∶30的丙酮搅拌至溶解，在10分钟内加入该溶解液6倍体积的环己烷，在15℃下静置4h，得到子囊霉素，纯度99.5％，收率86％。
实施例2
1)将链霉菌CGMCC No.2519发酵液过滤，分别收集滤液及菌丝体。菌丝体采用超声波辅助提取4次，超声波辅助提取中所用有机溶剂为乙酸乙酯，菌丝体与乙酸乙酯质量体积比(g/ml)为1∶10，超声频率为35KHz，功率为180W，超声提取时间为15分钟，体系pH7，收集提取液，与滤液合并，得合并液；
2)将步骤1)中得到的合并液，经微滤膜过滤后，微滤透过液进入超滤膜过滤，得滤液，转移到装有SP825大孔树脂的床层进行吸附；并用4倍大孔树脂柱床体积的55％甲醇进行冲洗，2倍大孔树脂柱床体积的丙酮进行解吸，柱床温度25℃，收集解吸液；
3)将步骤2)收集的解吸液在30℃下真空浓缩，旋干，得油状物；
4)将步骤3)中得到的油状物用与其质量体积比(g/ml)为1∶25的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，V/V)混合溶液溶解，上样层析硅胶柱，上样液进入层析硅胶后用5倍硅胶体积的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯∶甲醇＝15∶1，V/V)洗脱，收集含子囊霉素的活性组分；
5)将步骤4)收集的含子囊霉素的活性组分经30℃真空浓缩旋干，并用其质量体积比(g/ml)为1∶20的乙酸乙酯溶解，以15℃/h将温度降低到0℃，保温15h使子囊霉素结晶析出；冷冻离心，得到子囊霉素一次结晶；
6)将步骤5)得到的子囊霉素晶体在30℃下用与其质量体积比(g/ml)为1∶35的甲醇搅拌至溶解，在15分钟内加入该溶解液10倍体积环己烷，在20℃下静置6h，得到子囊霉素，纯度98.7％，收率90％。
实施例3
1)将链霉菌CGMCC No.2519发酵液过滤，分别收集滤液及菌丝体。菌丝体采用超声波辅助提取5次，超声波辅助提取中所用有机溶剂为乙醇，菌丝体与乙醇质量体积比(g/ml)为1∶12，超声频率为30KHz，功率为150W，超声提取时间为45分钟，体系pH7.5，收集提取液，与滤液合并，得合并液；
2)将步骤1)中得到合并液，经微滤膜过滤后，微滤透过液进入超滤膜过滤，得滤液，转移到装有D101大孔树脂的床层进行吸附；并用5倍大孔树脂柱床体积的50％乙醇进行冲洗，3倍大孔树脂柱床体积的甲醇进行解吸，柱床温度30℃，收集解吸液；
3)将步骤2)收集的解吸液在35℃下真空浓缩，旋干，得油状物；
4)将步骤3)中得到的油状物用与其质量体积比(g/ml)为1∶30的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，V/V)混合溶液溶解，上样层析硅胶柱，上样液进入层析硅胶后用6倍硅胶体积的乙酸乙酯-甲醇(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，V/V)洗脱，收集含子囊霉素的活性组分；
5)将步骤4)收集的含子囊霉素的活性组分经35℃真空浓缩，并用其质量体积比(g/ml)为1∶15的甲醇溶解，以10℃/h将温度降低到10℃，保温20h使子囊霉素结晶析出；冷冻离心，得到子囊霉素一次结晶；
6)将步骤5)得到的子囊霉素晶体在35℃下用与其质量体积比(g/ml)为1∶40的乙酸乙酯搅拌至溶解，在5分钟内加入该溶解液8倍体积正己烷，在25℃下静置10h，得到子囊霉素，纯度99.2％，收率83％。
Claims (5)
1.一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法，其特征在于采用发酵液过滤、菌丝体超声破碎提取、大孔树脂吸附、硅胶柱层析和结晶技术得到子囊霉素纯品；其具体步骤如下：
1)将链霉菌发酵液过滤，分别收集滤液及菌丝体；菌丝体采用超声波辅助提取3～5次，控制体系pH值为6～9，收集提取液，与滤液合并，得合并液；其中所述链霉菌发酵液中的链霉菌，其分类命名为链霉菌，菌种的拉丁学名是Streptomyces sp.，参据的微生物：NJYH2618，保藏日期是2008年5月26日，保藏中心登记入册编号是CGMCC NO.2519；
2)将步骤1）中得到的合并液，经微滤膜过滤后，微滤透过液进入超滤膜过滤，得滤液，转移到装有大孔树脂的床层进行吸附；并用4～5倍大孔树脂柱床体积的有机溶剂进行冲洗，1～3倍的大孔树脂柱床体积的有机溶剂进行解吸，控制柱床温度，收集解吸液；其中冲洗时，有机溶剂为体积浓度50%～60%乙醇水溶液或50%～60%甲醇水溶液；解吸时，有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮或甲醇；控制柱床温度为20～35℃；
3)将步骤2）收集的解吸液真空浓缩，旋干，得油状物；
4)将步骤3）中得到的油状物用有机溶剂溶解，油状物质量与有机溶剂体积比1:20～1:30g/ml，上样层析硅胶柱，上样液进入层析硅胶后用4～6倍硅胶体积的洗脱剂洗脱，收集含子囊霉素的活性组分；其中有机溶剂与洗脱剂均为体积比10:1～15:1的乙酸乙酯和甲醇混合溶液；
5)将步骤4）收集的含子囊霉素的活性组分经真空浓缩旋干，并用其质量体积比为1：10～1：20g/ml的有机溶剂溶解，将温度降低到0～10℃，保温使子囊霉素结晶析出；冷冻离心，得到子囊霉素一次结晶；
6)将步骤5）得到的子囊霉素晶体用有机溶剂搅拌溶解后，加入该溶解液5～10倍体积的结晶溶剂静置，结晶得到子囊霉素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的步骤1）中超声波辅助提取中所用有机溶剂为甲醇、乙酸乙酯或乙醇；菌丝体与有机溶剂质量体积比为1:10～1:15g/ml；超声频率为25～50KHz；功率为100～200W；超声提取时间为10～45分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤5）中有机溶剂为乙酸乙酯、丙酮或甲醇；降温速率为10～20℃/h；结晶时间为10～20小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤6）中搅拌溶解的有机溶剂为丙酮、甲醇或乙酸乙酯；晶体与有机溶剂质量体积比为1:25～1：45g/ml；搅拌温度为25～35℃；结晶溶剂为环己烷或正己烷；结晶溶剂的加入时间为5～20分钟；结晶温度为15～25℃；结晶时间为3～10小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3）和步骤5）中真空浓缩的温度为30～40℃。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110200242.1A CN102408435B (zh) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | 一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110200242.1A CN102408435B (zh) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | 一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102408435A CN102408435A (zh) | 2012-04-11 |
| CN102408435B true CN102408435B (zh) | 2013-12-25 |
Family
ID=45910820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110200242.1A Expired - Fee Related CN102408435B (zh) | 2011-07-18 | 2011-07-18 | 一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102408435B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106008553B (zh) * | 2016-06-24 | 2018-02-13 | 福建省微生物研究所 | 子囊霉素的纯化方法 |
| CN106749329A (zh) * | 2016-11-28 | 2017-05-31 | 无锡福祈制药有限公司 | 一种从链霉菌发酵液中分离纯化子囊霉素的方法 |
| CN112694486A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-23 | 苏州营力医药科技有限公司 | 一种他克莫司发酵液固液分离方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0528452A1 (en) * | 1991-06-19 | 1993-02-24 | Merck & Co. Inc. | Immunomycin enzymatic and/or microbial methylation products |
| CN101481715A (zh) * | 2009-01-20 | 2009-07-15 | 南京工业大学 | 一种生物发酵提纯他克莫司的方法 |
| CN101597578A (zh) * | 2009-07-01 | 2009-12-09 | 南京工业大学 | 一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2054128A1 (en) * | 1990-10-29 | 1992-04-30 | Kevin M. Byrne | Process for the production of analogues of immunomycin |
| AU2003269473A1 (en) * | 2003-08-26 | 2005-03-10 | Biocon Limited | A process for the recovery of substantially pure tricyclic macrolide |
| KR100891313B1 (ko) * | 2007-08-17 | 2009-03-31 | (주) 제노텍 | 담체로 작용하는 흡착성 수지의 제공에 의한 트리사이클로화합물의 생산 및 추출 방법 |
-
2011
- 2011-07-18 CN CN201110200242.1A patent/CN102408435B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0528452A1 (en) * | 1991-06-19 | 1993-02-24 | Merck & Co. Inc. | Immunomycin enzymatic and/or microbial methylation products |
| CN101481715A (zh) * | 2009-01-20 | 2009-07-15 | 南京工业大学 | 一种生物发酵提纯他克莫司的方法 |
| CN101597578A (zh) * | 2009-07-01 | 2009-12-09 | 南京工业大学 | 一种安来霉素产生菌及利用大孔树脂提取的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102408435A (zh) | 2012-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101481715B (zh) | 一种生物发酵提纯他克莫司的方法 | |
| CN102433364B (zh) | 一种微生物发酵法制取雷帕霉素的工艺 | |
| CN113481106B (zh) | 一种深海来源蕈青霉及获得化合物 | |
| CN102408435B (zh) | 一种从链霉菌发酵液中提纯子囊霉素的方法 | |
| CN106010980A (zh) | 一种内生真菌巴西类壳小圆孢菌株及其应用 | |
| CN105154382A (zh) | 基因工程菌株筑波链霉菌l20及其应用 | |
| CN110982700B (zh) | 一种抗幽门螺旋杆菌活性的聚酮化合物及其制备方法和应用 | |
| CN110540556B (zh) | 一种分离和提纯天维菌素的方法 | |
| CN101100682B (zh) | 绿僵菌发酵提纯苦马豆素的工艺 | |
| CN115109023B (zh) | 大环内酯类化合物fwyz52-a、其发酵菌株、发酵方法及应用 | |
| CN106282077A (zh) | 一株高效转化植物甾醇的菌株及其应用 | |
| CN110872338B (zh) | 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途 | |
| CN108441427B (zh) | 一种节菱孢属真菌及其生产的吡啶酮生物碱类化合物 | |
| CN102337308A (zh) | 利用青霉菌转化岩白菜素为一种特殊含氮衍生物的方法 | |
| CN102329829B (zh) | 利用青霉菌转化大豆苷元为8-羟基大豆苷元的方法 | |
| CN109810906B (zh) | 一株植物内生真菌及其在发酵制备酚酸类化合物中的应用 | |
| CN116179400B (zh) | 一株产重排甾体化合物的黏细菌及其应用 | |
| CN116874417B (zh) | 一种吡啶类生物碱及其在抗肿瘤药物制备中的应用 | |
| CN108218884B (zh) | 一种石杉碱乙衍生物及其制备方法 | |
| RU2495937C1 (ru) | Способ получения такролимуса методом микробиологического синтеза | |
| CN111979137B (zh) | 一种来源于海洋链霉菌的碳磷化合物及其制备方法与应用 | |
| CN115895916B (zh) | 一种积累麦角新碱的菌株及其构建方法和应用 | |
| CN111285828B (zh) | 化合物proximicin及其制备方法和应用 | |
| CN102559510B (zh) | 一种嗜盐曲霉菌f1及其应用 | |
| CN110904160B (zh) | 一种提高β-苯乙醇单位产量的发酵方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20131225 |