CN109810906B - 一株植物内生真菌及其在发酵制备酚酸类化合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株植物内生真菌及其在发酵制备酚酸类化合物中的应用。具体的，本发明公开了从柽柳中分离筛选出的一株植物内生真菌糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3，其具有发酵生产酚酸类化合物3‑(3‑羟基苯基)‑3‑羟基丙酸的能力，采用本发明提供的糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3，其发酵、分离和纯化方法简单，产率高，易于实现工业化生产。

Description

一株植物内生真菌及其在发酵制备酚酸类化合物中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物内生真菌及其在发酵制备酚酸类化合物中的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

植物内生真菌(plant endophytic fungi)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌，被感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在症状，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。它是植物微生物系统中的天然组成成分,在进化过程中与植物寄主建立了和谐的共生关系，有报道指出植物内生菌的次生代谢产物十分丰富，如生物碱类、萜类、甾体、异香豆素、蒽醌类、环肽类、苯丙素及木质素类等。

酚酸类化合物是酚类物质的一种，一般含有一个羧基官能团。维基百科将其定义为一类含酚环的有机酸。其存在形式复杂，极少量为游离态，主要以酯键、糖苷键、醚键等与其它物质相结合的方式存在。近年来，因其具有特定的生物活性因而受到研究人员的关注。有报道指出，酚酸类化合物不仅具有清除自由基，抗氧化，抗肿瘤，抑菌等作用，同时还具有抑制肥胖、提高免疫力，改善情绪等其他生物活性。发明人发现，由于动物和人不能自身合成酚酸，目前，酚酸的主要是通过水果、蔬菜、谷类、豆类等中获得。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明从柽柳中分离筛选出一株植物内生真菌糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3，其具有发酵生产酚酸类化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的能力，采用本发明提供的糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3，其发酵、分离和纯化方法简单，产率高，易于实现工业化生产。

本发明的目的之一是提供一株植物内生真菌糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3。

本发明的目的之二是提供上述植物内生真菌糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3在发酵生产酚酸类化合物中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种酚酸类化合物的微生物发酵制备方法。

为实现上述发明目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一株植物内生真菌糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3，该菌株已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCC NO.5552。

本发明的第二个方面，提供上述植物内生真菌糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3在发酵生产酚酸类化合物的应用。

其中，所述酚酸类化合物优选为化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸，其结构式如下：

本发明的第三个方面，提供一种酚酸类化合物的微生物发酵制备方法，所述方法包括：

--将活化后的糠生赤壳菌G3接种于发酵培养基中进行发酵培养，经有机溶剂提取，得粗提物；所述有机溶剂为乙酸乙酯。

--将粗提物用乙酸乙酯-甲醇体系进行硅胶柱层析，收集洗脱液；

--将洗脱液通过凝胶柱层析进行分离，所得固体纯化后即制备得到化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸。

进一步的，糠生赤壳菌G3活化的方法为：将糠生赤壳菌G3接种于麦芽汁液体培养基中，28℃培养7天，得到菌悬液。

所述麦芽汁液体培养基的组成为：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽汁10g，1000ml水，pH自然。

发酵培养中，发酵培养基的组成为：大米80g，海水120ml，pH自然。

发酵培养的条件为：28℃培养14天。

进一步的，将乙酸乙酯-甲醇体积比为9：1梯度的洗脱液通过Sephdex-LH 20凝胶柱层析进行分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：1，所得固体经过重结晶，即制备得到化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸。

本发明的有益效果：

以本发明的保藏号为CGMCC NO.5552的糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3作为发酵菌株，经微生物发酵制备得到酚酸化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸，本发明的微生物发酵制备方法的产率高，发酵、分离、纯化方法简单，易于实现工业化生产。

附图说明

图1为实施例1制备得到化合物的核磁共振氢谱图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；在本发明没有特别限定，均可通过商业途径购买得到。

正如背景技术所介绍的，现有技术中对于酚酸化合物往往从植物中获得，为了解决如上的技术问题，本申请提出了利用糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3发酵生产酚酸类化合物的方法。

本申请首先于东营孤岛区盐碱地区域采集柽柳，从中分离得到一株植物内生菌，经ITS序列分析以及生化特性鉴定，确定其为糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)，并将其于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏号为CGMCCNO.5552。该菌株不同于其他分离来源的真菌，本申请的糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3特别适合于作为发酵菌株制备酚酸化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸，发酵培养条件简单，分离、纯化方法易于实施，目标化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的产率较高。

在本申请的一种实施方式中，提供了一种利用上述糠生赤壳菌(Bionectriapityrodes)G3发酵制备化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸的方法，步骤如下：

(1)将3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸接种于液体麦芽汁培养基中进行活化，28℃摇瓶培养7天，得到菌悬液；将菌悬液接种于发酵培养基中进行在28℃发酵培养14天，经乙酸乙酯提取，得粗提物；

(2)将粗提物用乙酸乙酯-甲醇体系(V：V＝9:1)进行硅胶柱层析，收集洗脱液；

(3)将步骤(2)洗脱液通过Sephdex-LH 20凝胶柱层析进行分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：1(体积比)，所得固体经过重结晶，即制备得到酚酸化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸。采用上述发酵制备方法，发酵制备过程简单，无需复杂设备，也无需人工调节pH，且发酵产率较高，发酵周期较短，易于工业化生产应用。

其中，麦芽汁液体培养基的组成为：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽汁10g，1000ml水，pH自然。

发酵培养基的组成为：大米80g，海水120ml，pH自然。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1

(1)糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3的活化：

麦芽汁培养基：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽汁10g，1000ml水，制成液体培养基，挑取菌丝接种，28℃摇瓶培养7天，得到菌悬液；

(2)糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3的发酵培养：

大米培养基，制备过程为：将80g大米和120mL海水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5mL接种于大米培养基上，28℃培养14天；

(3)待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物1.24g；

(4)将粗提物用乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；

(5)将减压硅胶柱层析所得组分：乙酸乙酯：甲醇＝9：1，通过Sephdex-LH20分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：1，所得固体经过重结晶后得到目标化合物1.01mg。

分离得到的该化合物经测定，其分子式为C₉H₁₀O₄，分子量：182，经核磁共振氢谱等确定为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸，其结构式如下：

实施例2

(1)糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3的活化：

麦芽汁培养基：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽汁10g，1000ml水，制成液体培养基，挑取菌丝接种，28℃摇瓶培养7天，得到菌悬液；

(2)糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3的发酵培养：

大米培养基，制备过程为：将80g大米和120mL海水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5mL接种于大米培养基上，28℃培养14天；

(3)待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物1.28g；

(4)将粗提物用乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；

(5)将减压硅胶柱层析所得组分：乙酸乙酯：甲醇＝9：1，通过Sephdex-LH20分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：1，所得固体经过重结晶后得到目标化合物1.06mg。

实施例3

(1)糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3的活化：

麦芽汁培养基：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽汁10g，1000ml水，制成液体培养基，挑取菌丝接种，28℃摇瓶培养7天，得到菌悬液；

(2)糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3的发酵培养：

大米培养基，制备过程为：将80g大米和120mL海水加入500mL三角瓶中，浸泡过夜，灭菌冷却待用；取制备好的菌悬液5mL接种于大米培养基上，28℃培养14天；

(3)待发酵完毕，将乙酸乙酯加入三角瓶中提取三次，减压蒸干有机溶剂，得到粗提物1.32g；

(4)将粗提物用乙酸乙酯-甲醇体系进行减压硅胶柱层析；

(5)将减压硅胶柱层析所得组分：乙酸乙酯：甲醇＝9：1，通过Sephdex-LH20分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：1，所得固体经过重结晶后得到目标化合物1.12mg。

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一株糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3，该菌株已于2011年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5552。

2.权利要求1所述的糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3在发酵生产酚酸类化合物中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述酚酸类化合物为3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸。

4.一种酚酸类化合物的微生物发酵制备方法，其特征在于，步骤如下：

--将活化后的权利要求1所述的糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3接种于发酵培养基中进行发酵培养，经有机溶剂提取，得粗提物；

--将粗提物用乙酸乙酯-甲醇体系进行硅胶柱层析，收集洗脱液；

--洗脱液通过凝胶柱层析进行分离，所得固体纯化后即制备得到化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸。

5.根据权利要求4所述的微生物发酵制备方法，其特征在于，糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3活化的方法为：将糠生赤壳菌(Bionectria pityrodes)G3接种于麦芽汁液体培养基中，28℃培养7天，得到菌悬液。

6.根据权利要求5所述的微生物发酵制备方法，其特征在于，所述麦芽汁液体培养基的组成为：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽汁10g，1000ml水，pH自然。

7.根据权利要求4所述的微生物发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：大米80g，海水120ml，pH自然。

8.根据权利要求4所述的微生物发酵制备方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：28℃培养14天。

9.根据权利要求4所述的微生物发酵制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

10.根据权利要求4所述的微生物发酵制备方法，其特征在于，将乙酸乙酯-甲醇体积比为9：1梯度的洗脱液通过Sephdex-LH 20凝胶柱层析进行分离，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1：1，所得固体经过重结晶，即制备得到化合物3-(3-羟基苯基)-3-羟基丙酸。

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