CN110551636B - 一种紫红曲霉my-21菌株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种紫红曲霉MY‑21菌株及其应用，利用该MY‑21菌株通过发酵，能够获得Monacolin K含量较高的功能性红曲产品，从而能够应用于生产降脂药物如血脂康和保健功能性产品。本发明的紫红曲霉(Monascus purpureus)MY‑21菌株，其菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18110，保藏日期为：2019年7月19日。
Description
发明领域
本发明涉及一种微生物及应用，更具体地说涉及一种紫红曲霉MY-21菌株及其应用。
背景技术
红曲是以不黏性大米为原料，红曲菌经固态发酵而成的红曲米。主要产于福建，故又称福曲、丹曲等。红曲米在中国至少已有两千年以上药食两用的历史。红曲在国内主要用于酿酒、酿醋、腐乳、食品色素以及作为中药。在1979年，日本学者远藤章从红曲菌培养液中发现并提取出对胆固醇合成抑制作用的活性物质Monacolin K(莫纳可林K)，红曲的降脂功能成为现代红曲研究是主要方向。除此以外发酵红曲还含有色素、胆碱、黄酮、DHA等次级代谢产物，具有降血压、降血糖、天然抗氧化等功效。
近年来，随着生活水平的不断提高，由高胆固醇所引起的冠心病、高血脂、脑血栓、前列腺癌等疾病已威胁着人类的健康，降脂类产品的需求日益增多，由红曲菌天然发酵的以降胆固醇物质Monacolin K为主要成分的功能性红曲渐渐走进人们的视野。研究表明，与从其它菌类提取或人工合成的Monacolin K相比，红曲产品中的Monacolin K结晶少、溶解度高，因而疗效更显著，毒副作用更小。随着国内红曲市场以及欧美日本对我国红曲产品的需求的日益增大，如何有效提高功能性红曲固态发酵Monacolin K的产量已成为红曲发酵产业发展中必须解决的重要问题。选育高产洛伐他汀的红曲菌种则是提高Monacolin K产量最直接有效的一种方法。
发明内容
本发明解决现有技术存在的不足，提供一种紫红曲霉MY-21菌株及其应用，利用该菌株通过发酵，能够获得Monacolin K含量较高的功能性红曲产品，从而能够应用于生产降脂药物如血脂康和保健功能性产品。
同时本发明还提供用该紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法，工艺简单。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明的紫红曲霉(Monascus purpureus)MY-21菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.18110，分类命名：紫红曲霉(拉丁文名称：Monascus purpureus)保藏日期为：2019年7月19日。
本发明的紫红曲霉MY-21菌株的形态特征如下：PDA培养基上的菌落呈膜状蔓延生长，表面有褶皱和气生菌丝，初期菌丝体为白色，后变为红色，老后为紫红色，背面紫红色；菌丝具横隔，多核，分枝甚繁不规律，细胞内有颗粒；分生孢子球形或梨形，着生于菌丝及其分枝的顶端；闭囊壳球形，橙红色；子囊球形，成熟后消失；子囊孢子卵圆形。ITS序列分析结果表明，与紫红曲霉的相似度高达99％。
本发明的上述紫红曲霉MY-21菌株在制备降脂药物及保健功能性食品中的应用；进一步的技术方案是在红曲发酵中的应用；更进一步的技术方案是在提高功能性红曲固态发酵时Monacolin K含量中的应用。
本发明的上述紫红曲霉MY-21菌株在提高功能性红曲固态发酵时Monacolin K含量中的应用，其再进一步的技术方案是发酵制备红曲产品的方法包括以下步骤：
A、制备种子液:将紫红曲霉MY-21菌株接种于PDA培养基上，30～32℃培养7d活化；用无菌水将培养基上的孢子洗脱下来，摇匀打散孢子团粒，获得孢子悬液；将孢子悬液接种到液体种子培养基中，培养得到紫红曲霉菌株种子液；
B、固态发酵：在无菌条件下向培养基质中接入紫红曲霉菌株种子液，封口后移入培养室发酵培养，获得Monacolin K含量高的红曲产品。
本发明的上述的紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法，其再进一步的技术方案是步骤A中所述的孢子悬液按培养基体积百分比5％的接种量接到液体种子培养基中，在30～32℃、180r/min条件下振荡培养48h；所述的液体种子培养基组分为：葡萄糖60g/L，蛋白胨25g/L，玉米粉10g/L，NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O1g/L，调节pH5.0～6.0。更进一步的技术方案是所述的孢子悬液的浓度为106cfu/mL。
本发明的上述的紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法，其再进一步的技术方案还可以是步骤B中所述固的态发酵包括常温发酵和低温发酵两个阶段，先进行常温发酵，后进行低温发酵，所述的常温发酵阶段培养条件为：30～32℃条件下培养2～3d；所述的低温发酵阶段培养条件为：18～22℃条件下培养18～20d，湿度均为60％～75％。更进一步的技术方案是所述的固态发酵结束后，将培养基质于45～55℃条件下烘干，再经打碎后过40目筛，即得最终功能性红曲成品。
本发明的上述的紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法，其再进一步的技术方案还可以是步骤B中所述的发酵培养基质的制备方法为：将大米浸泡1～2h，沥干水分，蒸熟，加入2.5％～7.5％甘油、1％～5％大豆粉，121℃灭菌20min，以上均为总质量的质量百分比。
本发明的有益效果是：
本发明采用从多种红曲产品中分离纯化，经低温培养筛选出的特殊优良的紫红曲霉作为生产菌株，通过科学合理的发酵工艺，发酵出Monacolin K含量较高的功能性红曲。本发明所得的功能性红曲经检测其Monacolin K含量远高于《中华人民共和国轻工业行业标准》、《保健食品检验与评价技术规范》以及《中国药典》中红曲的质量标准，所以能够作为中成药血脂康的原料药和保健功能性食品，且本发明的工艺科学简单，Monacolin K产量高，具有显著的经济效益与学术研究价值。同时应用本发明的紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品时发酵工艺简单，生产成本低廉。
附图说明
图1为基于ITS序列建立的紫红曲霉菌属系统发育树示意图
图2为HPLC检测酸式Monacolin K标准曲线
图3为HPLC检测内酯式Monacolin K标准曲线
图4为实施例2Monacolin K HPLC色谱图，注：保留时间13.285min处为酸式Monacolin K，峰面积为2919.18mAU*s；保留时间24.365min处为内酯式Monacolin K，峰面积为2092.48mAU*s
图5为实施例3Monacolin K HPLC色谱图，注：保留时间13.294min处为酸式Monacolin K，峰面积为310.78mAU*s；保留时间24.372min处为内酯式Monacolin K，峰面积为4593.61mAU*s
图6为实施例4Monacolin K HPLC色谱图，注：保留时间13.291min处为酸式Monacolin K，峰面积为3381.76mAU*s；保留时间24.361min处为内酯式Monacolin K，峰面积为3592.17mAU*s
具体实施方式
本发明的紫红曲霉MY-21菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18110。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂及原料，如无特殊说明，均为常规途径购买获得；下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1
紫红曲霉MY-21菌株的分离、筛选及鉴定
1.1培养基
①PDA培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，琼脂粉2％，水，自然pH。用于紫红曲霉菌株的分离纯化和鉴定。
②PD培养基：马铃薯20％，葡萄糖2％，牛肉膏0.5％，水，自然pH。用于高产洛伐他汀的紫红曲霉菌株的筛选。
1.2紫红曲霉菌株的分离纯化
从多种红曲制品中提取自然发酵样品表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，32℃培养48h，待白色绒毛状菌丝长出后，挑取少许菌丝转接于另一PDA平板上继续培养，培养3d后重复上述分离纯化操作，经三次纯化后即可得到性状均一的紫红曲霉菌株。将分离纯化获得的紫红曲霉菌株编号保存于25％甘油中，置于4℃冰箱备用。
1.3高产洛伐他汀紫红曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法(HPLC)检测各紫红曲霉菌株发酵液中Monacolin K的产量进行筛选。紫红曲霉菌株各保存菌株32℃ PDA平板培养3d后，用打孔器取1菌饼(直径0.8mm)转接于PD培养液中，32℃、180r/min摇床培养48h后，22℃、180r/min摇床培养5d。取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过筛，利用HPLC法检测Monacolin K产量，筛选获一株高产Monacolin K的紫红曲霉菌株，编号为MY-21菌株。色谱条件为：C18液相色谱柱，检测波长λ＝238nm。
1.4菌株的鉴定
MY-21菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落呈膜状蔓延生长，表面有褶皱和气生菌丝，初期菌丝体为白色，后变为红色，老后为紫红色，背面紫红色；菌丝具横隔，多核，分枝甚繁不规律，细胞内有颗粒；分生孢子球形或梨形，着生于菌丝及其分枝的顶端；闭囊壳球形，橙红色；子囊球形，成熟后消失；子囊孢子卵圆形。ITS序列分析结果表明，与紫红曲霉的相似度高达99％(见图1)。根据菌株形态特征、显微特征、ITS序列，该菌株经南京工业大学、中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定为曲菌科红曲霉属真菌紫红曲霉Monascus purpureus，命名为紫红曲霉MY-21菌株，保藏编号为：CGMCC No.18110，保藏地为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，南京工业大学。
实施例2：紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法
利用紫红曲霉MY-21菌株进行功能性红曲的发酵制备，主要方法步骤如下：
1)菌株活化液的制备
将紫红曲霉MY-21菌株接种于PDA培养基上，32℃培养7d活化。用无菌水将培养基上的孢子洗脱下来，打散摇匀，制成浓度为106cfu/mL的孢子悬液。将孢子悬液按5％的接种量接种到液体种子培养基中，在32℃，180r/min条件下，振荡培养48h，即制得紫红曲霉菌株活化液。
液体种子培养基组分为：葡萄糖60g/L，蛋白胨25g/L，玉米粉10g/L，NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O1g/L，自然pH，121℃灭菌20min。
2)发酵培养基质的制备
将大米浸泡1.5h，沥干水分，蒸熟，称取150g放入500mL三角瓶中，121℃灭菌20min。
3)接种
在无菌条件下，向每个三角瓶中的固态发酵基质中接入15％的紫红曲霉菌株活化液，封口后放入培养箱培养。
4)固态发酵
固态发酵包括常温发酵和低温发酵两个阶段，先进行常温发酵，后进行低温发酵，所述的常温发酵阶段培养条件为：32℃条件下培养3d。所述的低温发酵阶段培养条件为：18℃条件下培养20d，湿度均为60％～75％。固态发酵结束后，将培养基质于50℃条件下烘干，再经打碎后过40目筛，即得最终功能性红曲成品。
经高效液相色谱法(HPLC)检测，Monacolin K产量最高可达5.916mg/g，其中酸式Monacolin K含量为2.337mg/g，内酯式Monacolin K含量为3.578mg/g(见图4)。
实施例3：紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法
利用紫红曲霉MY-21菌株进行功能性红曲的发酵制备，主要方法步骤如下：
1)菌株活化液的制备
将紫红曲霉MY-21菌株接种于PDA培养基上，32℃培养7d活化。用无菌水将培养基上的孢子洗脱下来，打散摇匀，制成浓度为106cfu/mL的孢子悬液。将孢子悬液按5％的接种量接种到液体种子培养基中，在32℃，180r/min条件下，振荡培养48h，即制得紫红曲霉菌株活化液。
液体种子培养基组分为：葡萄糖60g/L，蛋白胨25g/L，玉米粉10g/L，NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O1g/L，自然pH，121℃灭菌20min。
2)发酵培养基质的制备
将大米浸泡2h，沥干水分，蒸熟，称取150g放入500mL三角瓶中，分别加入2.5％、5％、7.5％甘油，121℃灭菌20min。
3)接种
在无菌条件下，向每个三角瓶中的固态发酵基质中接入17.5％的紫红曲霉菌株活化液，封口后放入培养箱培养。
5)固态发酵
固态发酵包括常温发酵和低温发酵两个阶段，先进行常温发酵，后进行低温发酵，所述的常温发酵阶段培养条件为：32℃条件下培养3d。所述的低温发酵阶段培养条件为：20℃条件下培养19d，湿度均为60％～75％。固态发酵结束后，将培养基质于45℃条件下烘干，再经打碎后过40目筛，即得最终功能性红曲成品。
经高效液相色谱法(HPLC)检测，甘油添加量为5％时Monacolin K产量最高可达7.839mg/g，其中酸式Monacolin K含量为0.354mg/g，内酯式Monacolin K含量为7.485mg/g(见图5)。
实施例4：紫红曲霉MY-21菌株发酵制备红曲产品的方法
利用紫红曲霉MY-21菌株进行功能性红曲的发酵制备，主要方法步骤如下：
1)菌株活化液的制备
将紫红曲霉MY-21菌株接种于PDA培养基上，32℃培养7d活化。用无菌水将培养基上的孢子洗脱下来，打散摇匀，制成浓度为106cfu/mL的孢子悬液。将孢子悬液按5％的接种量接种到液体种子培养基中，在32℃，180r/min条件下，振荡培养48h，即制得紫红曲霉菌株活化液。
液体种子培养基组分为：葡萄糖60g/L，蛋白胨25g/L，玉米粉10g/L，NaNO32g/L，K2HPO41g/L，MgSO4.7H2O1g/L，自然pH，121℃灭菌20min。
2)发酵培养基质的制备
将大米浸泡1h，沥干水分，蒸熟，称取150g放入500mL三角瓶中，分别加入1％、2.5％、5％大豆粉，121℃灭菌20min。
3)接种
在无菌条件下，向每个三角瓶中的固态发酵基质中接入20％的紫红曲霉菌株活化液，封口后放入培养箱培养。
4)固态发酵
固态发酵包括常温发酵和低温发酵两个阶段，先进行常温发酵，后进行低温发酵，所述的常温发酵阶段培养条件为：32℃条件下培养3d。所述的低温发酵阶段培养条件为：22℃条件下培养18d，湿度均为60％～75％。固态发酵结束后，将培养基质于55℃条件下烘干，再经打碎后过40目筛，即得最终功能性红曲成品。
经高效液相色谱法(HPLC)检测，大豆粉添加量为2.5％时Monacolin K产量最高可达8.61mg/g，其中酸式Monacolin K含量为2.689mg/g，内酯式Monacolin K含量为5.921mg/g(见图6)。
Claims (6)
1.一种紫红曲霉(Monascus purpureus)MY-21菌株，该菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.18110。
2.一种如权利要求1所述的紫红曲霉MY-21菌株在提高功能性红曲固态发酵时Monacolin K含量中的应用，其发酵制备红曲产品的方法步骤如下：
A、制备种子液:将紫红曲霉MY-21菌株接种于PDA培养基上，30～32℃、180r/min条件下振荡培养7～8d活化；用无菌水将培养基上的孢子洗脱下来，摇匀打散孢子团粒，获得孢子悬液；将孢子悬液接种到液体种子培养基中，培养得到紫红曲霉菌株种子液；
B、固态发酵：在无菌条件下向培养基质中接入紫红曲霉菌株种子液，封口后移入培养室发酵培养，获得Monacolin K含量高的红曲产品；其中所述的发酵培养基质的制备方法为：将大米浸泡1～2h，沥干水分，蒸熟，加入2.5％～7.5％甘油、1％～5％大豆粉，121℃灭菌20min，以上均为总质量的质量百分比。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤A中所述的孢子悬液按培养基体积百分比5％的接种量接到液体种子培养基中，在30～32℃、180r/min条件下振荡培养48h；所述的液体种子培养基组分为：葡萄糖60g/L，蛋白胨25g/L，玉米粉10g/L，NaNO3 2g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，调节pH5.0～6.0。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的孢子悬液的浓度为106cfu/mL。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤B中所述固的态发酵包括常温发酵和低温发酵两个阶段，先进行常温发酵，后进行低温发酵，所述的常温发酵阶段培养条件为：30～32℃条件下培养2～3d；所述的低温发酵阶段培养条件为：18～22℃条件下培养18～20d，湿度均为60％～75％。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的固态发酵结束后，将培养基质于45～55℃条件下烘干，再经打碎后过40目筛，即得最终功能性红曲成品。
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