CN114196578B - 棘孢曲霉nm-11-6及其在柠檬精油提取中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种棘孢曲霉NM‑11‑6及其在柠檬精油提取中的应用，将棘孢曲霉NM‑11‑6孢子接种在含水柠檬果皮中，于28–30℃发酵48–60h，获得柠檬果皮发酵物，柠檬果皮发酵物经水蒸气蒸馏法提取，获得柠檬精油。在从柠檬果皮中提取精油前，增加了微生物发酵预处理，所用的黑根霉NM‑11‑6，是针对能够水解柠檬果皮植物组织而有目的筛选得到，它在柠檬果皮中适度生长，产生多种糖苷酶，能够协同水解柠檬中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使得其结构组织疏松，有助于柠檬精油溶出，从而能够显著提高精油的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，柠檬精油的提取得率可以提高25％以上。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株棘孢曲霉NM-11-6及其在柠檬精油提取中的应用。
(二)背景技术
柠檬是芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)乔木柠檬树(Citrus limon)的果实，它含有柠檬酸、柠檬烯、类黄酮、维生素C、维生素A以及多种微量元素，属于一种营养和药用价值较高的水果。柠檬树的花、果、枝、叶均含有特殊芳香油，即柠檬精油，它含有几十种烯、醇、醛、酯类等化合物，其中柠檬烯是主要成分，含量高达50％以上。柠檬精油不仅气味芬芳，且具有抗氧化、调节神经元伤害和疼痛反应等功效，在食品、医药、化妆品等行业的应用越来越广泛。
近年来，我国柠檬种植面积不断增加，特别是在四川、广西和云南等省份。柠檬的酸度较大，基本不能作为水果直接食用，所以只有少数柠檬作为鲜果销售，更多的是用作产品的深加工，如柠檬片、柠檬饮、柠檬果醋和柠檬果酒等。柠檬果皮占整个柠檬的20％以上，是其加工过程中的主要副产物，目前多是作为垃圾处理。柠檬果皮中精油含量较高，从中提取精油，可提高柠檬资源利用率，对柠檬产区的经济发展和环境保护都起到积极作用。
目前，植物精油提取传统的方法有水蒸气蒸馏法、直接压榨法和有机溶剂浸提法等。水蒸气蒸馏法应用最为广泛，设备要求低，精油品质好，但存在热分解的问题；直接压榨法可避免精油受热可能导致的成分改变和挥发损失，但提取得率非常低；有机溶剂浸提法具有提取得率高的优点，但精油的品质不高，往往还提取了植物的脂类和蜡质等。植物精油提取现代的方法有超临界CO2萃取法、分子蒸馏法和离子液体萃取法等，这些方法提取的产品纯度较高，但得率低，而且设备成本较高、产能低，在生产实践中应用还有一定局限性。目前有较多关于柠檬精油提取的研究报道，多数方法是采用超声波辅助水蒸气蒸馏法或溶剂浸提法。超声波辅助水蒸气蒸馏法提取柠檬精油的得率稍低，一般在2.0％左右；超声波辅助溶剂浸提法的精油得率较高，如薛山的研究，采用超声辅助丙酮浸提法，柠檬精油的提取得率达到2.83％。
为了提高柠檬精油的提取得率，有报道采用纤维素酶预处理柠檬果皮，柠檬精油提取得率提高了7.07％(1.98％提高到2.12％)，提取时间可以显著缩短[辜雪冬,肖娟,周康,等.纤维素酶辅助水蒸气蒸馏提取柠檬精油工艺优化.食品与机械,2018,34(8):145-152]。柠檬果皮不像植物的根茎叶(如虎杖、黄芪、土茯苓和杜仲叶等)，它的纤维素含量并不高，而果胶和半纤维素的含量很高，所以单纯用纤维素酶预处理柠檬果皮，对植物组织的水解能力有限，因而对提高精油提取得率的效果自然不会显著。
很多微生物在生长过程中可以产生多种多糖水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等，如果用微生物直接发酵预处理柠檬果皮，其产生的多种糖苷酶协同水解柠檬果皮细胞壁成分，更有利于细胞中的精油释放出来，精油提取得率得以提高。本发明采用微生物发酵预处理柠檬果皮，可使柠檬精油的提取得率大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株微生物新菌株—棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)NM-11-6及其在柠檬精油提取中的应用，柠檬果皮经该菌株发酵后，精油的提取得率可以显著提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株微生物新菌株—棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)NM-11-6，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62073，保藏日期2021年11月17日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述棘孢曲霉NM-11-6，是从柠檬果皮的微生物富集培养物中分离，经过筛选获得的优良菌株。所述棘孢曲霉NM-11-6的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，如单点接种，28℃培养24h后长出灰白色菌丝，菌落呈放射状，48h后，菌落中心产生黑褐色分生孢子，边缘仍是灰白色菌丝；如划线接种，28℃培养24h后，接种线两侧长出灰白色菌丝，48h后，菌落表面产生大量分生孢子；分生孢子梗直立或稍弯曲，分生孢子头呈球形或近球形，单层小梗；分生孢子近似球形或椭圆形，表面有放射状小刺，直径4–5μm。棘孢曲霉NM-11-6在PDA平板培养基上划线接种后，28℃培养48h的菌落照片见图1。
所述的棘孢曲霉NM-11-6的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述棘孢曲霉NM-11-6在柠檬精油提取中的应用，所述应用的方法为：将棘孢曲霉NM-11-6孢子接种于含水柠檬果皮中，于28–30℃发酵48–60h，获得柠檬果皮发酵物，柠檬果皮发酵物经水蒸气蒸馏法提取，获得柠檬精油。
进一步，所述含水柠檬果皮，可以是新鲜的柠檬果皮，切成边长为2–4mm的小块；也可以是干燥的柠檬果皮，经粉碎过20目筛，在接种棘孢曲霉NM-11-6孢子前加入无菌水，无菌水的加量是以柠檬果皮干重计为1.0–1.2mL/g。因柠檬果皮干燥后，精油会损失，所以，本发明优选的柠檬果皮是未经干燥的新鲜柠檬果皮。
进一步，所述的棘孢曲霉NM-11-6孢子接种量以新鲜柠檬果皮重量计为2×106–5×106个/g，或以干柠檬果皮重量计为1×107–3×107个/g。
进一步，所述棘孢曲霉NM-11-6孢子接种于含水柠檬果皮中，是以孢子液的形式加入。所述孢子液的制备方法为：低温保藏的棘孢曲霉NM-11-6接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板培养基，于28–30℃恒温培养48–60h后，加无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为1×108–5×108个/mL。所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5左右)。
进一步，所述的从柠檬果皮发酵物中提取精油的方法为：将柠檬果皮发酵物中加入去离子水和玻璃珠，采用水蒸气蒸馏，冷凝回流提取获得柠檬精油。具体方法为：柠檬果皮发酵物置于圆底烧瓶中，加入去离子水和少许玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止；接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内沸腾，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3–5h)，停止加热，放置1h以上；开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出精油。所述的去离子水体积加入量以新鲜柠檬果皮重量计为2–3mL/g，或以干柠檬果皮重量计为8–10mL/g；所述玻璃珠加入目的是防止加热爆沸；所述的挥发油提取器，也称挥发油测定器，结构见附图2。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在从柠檬果皮中提取精油前，增加了微生物发酵预处理，所用的棘孢曲霉NM-11-6，是针对能够水解柠檬果皮植物组织而有目的筛选得到，它在柠檬果皮中适度生长，产生多种糖苷酶，能够协同水解柠檬中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使得其结构组织疏松，有助于柠檬精油溶出，从而能够显著提高精油的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，柠檬精油的提取得率可以提高25％以上。
(四)附图说明
图1为棘孢曲霉NM-11-6的菌落照片。
图2为挥发油提取器实物照片。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所述的柠檬，是芸香科(Rutaceae)植物柠檬(Citrus limon)的成熟果实，所述的柠檬果皮是成熟的柠檬的外皮。本发明实施例使用的柠檬产自四川省安岳县，品种为尤力克，单果重量为150–200g。
实施例1发酵菌株的筛选
为了筛选到一株适用于柠檬果皮发酵，以提高精油提取得率的菌株，本发明采用下述方法筛选：
(1)经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，加入40g切成边长2–4mm小块的新鲜柠檬果皮，8层纱布扎口，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养60h，得纯培养菌株14株，各菌株的编号见表1。
(2)14个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度在2×108–5×108个/mL，即为各菌株的孢子液。
(3)100g(干重21.9g)新鲜柠檬果皮，切碎成边长为2–4mm的小块，加入到经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中(14瓶)，再分别接种1mL步骤(2)制备的各霉菌孢子液，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养60h，获得柠檬果皮发酵物。
(4)参照《中国药典》2020版四部中的“2204挥发油测定”，将步骤(3)获得的全部柠檬果皮发酵物转移到1-L的圆底烧瓶中，加入300mL的去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管(图2)，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(3h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出柠檬精油，称重。
经不同菌株发酵的柠檬果皮，以及未经发酵的阴性对照，水蒸气蒸馏法提取精油的得率见表1。
表1经不同菌株发酵的新鲜柠檬果皮(干重21.9g)精油提取得率
由表1数据可以看出，柠檬果皮经菌株NM-11发酵预处理后，精油的提取得率为2.01％，较未经发酵预处理的阴性对照相比，得率提高的幅度最大，为15.5％，本发明选定该菌株作为柠檬精油提取的发酵菌株。
所述的平板培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入葡萄糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL，冷却后备用。
所述的柠檬精油提取得率按以下公式计算：
实施例2柠檬果皮发酵菌株NM-11的二次分离纯化
对菌株NM-11进行二次单孢子分离纯化，筛选用于发酵预处理柠檬果皮而提高精油提取得率的优良菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株NM-11经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗垫2层擦镜纸)。用无菌生理盐水稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别移取不同稀释度的孢子液0.1mL涂布PDA平板培养基，培养皿倒置于28℃培养48h。挑取PDA平板上的单菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得11个菌株，各菌株编号见表2。
(2)按实施例1方法，不同菌株发酵预处理100g新鲜柠檬果皮，用水蒸气蒸馏法测定经发酵预处理的柠檬精油提取得率，结果见表2。
表2二次纯化菌株发酵的新鲜柠檬果皮(干重21.9g)精油提取得率
由表2数据可以看出，从NM-11菌株单孢子分离纯化获得的11株菌株中，NM-11-6菌株发酵预处理新鲜柠檬果皮后，精油的提取得率最高，为2.20％，较NM-11菌株提高了9.45％，较未经发酵的阴性对照的得率提高了26.4％，以本发明选定该菌株作为发酵菌种，用于发酵预处理柠檬果皮以提高精油提取得率。
实施例3菌株NM-11-6的分类鉴定
菌株NM-11-6接种在PDA平板培养基上，如单点接种，28℃培养24h后长出灰白色菌丝，菌落呈放射状，48h后，菌落中心产生黑褐色分生孢子，边缘仍是灰白色菌丝；如划线接种，28℃培养24h后，接种线两侧长出灰白色菌丝，48h后，菌落表面产生大量分生孢子；分生孢子梗直立或稍弯曲，分生孢子头呈球形或近球形，单层小梗；分生孢子近似球形或椭圆形，表面有放射状小刺，直径4–5μm。菌株NM-11-6在PDA平板培养基上划线接种后，28℃培养48h的菌落照片见图1。
测得菌株NM-11-6的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与4株棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)典型菌株有大于99％的同源性。根据菌株NM-11-6菌落的典型特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株NM-11-6的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，曲霉属(Aspergillus)，棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)。
ITS区rDNA序列为：
ACCTCCCACCCGTGCTTACCGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTTCGGGCGGCCCGGGGCCTGCCCCCGGGACCGCGCCCGCCGGAGACCCCAATGGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGATACCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTCCCCTCCAGCCCCGCTGGTTGTTGGGCCGCGCCCCCCCGGGGGCGGGCCTCGAGAGAAACGGCGGCACCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACCCGCTCTATGGGCCCGGCCGGGGCTTGCCTCGACCCCCAATCTTCTCAGATTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTT。
综上，从柠檬果皮的微生物富集培养物中分离的菌株NM-11，经过二次单孢子分离纯化后，筛选获得了菌株NM-11-6，即棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)NM-11-6，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62073，保藏日期2021年11月17日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4棘孢曲霉NM-11-6应用于从新鲜柠檬果皮中提取精油
(1)冷冻干燥保藏的棘孢曲霉NM-11-6菌粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养60h，加5mL的无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为2.54×108个/mL。
(2)200g(干重43.8g)鲜柠檬果皮，切碎成边长为2–4mm的小块，置于到经160℃、2h干热灭菌的500-mL三角瓶中，再接种1mL步骤(1)制备的孢子液(新鲜柠檬果皮孢子接种浓度为2.54×106个/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养60h，获得柠檬果皮发酵物。
(3)步骤(2)获得的全部柠檬果皮发酵物转移到1-L的圆底烧瓶中，加入400mL的去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(5h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出柠檬精油，称重。
按上述步骤，从200g新鲜柠檬果皮中提取得到柠檬精油0.957g，提取得率为2.18％(按柠檬果皮干重43.8g计)，较实施例1中未经微生物发酵的常规提取的得率(1.74％)提高了25.3％。
实施例5棘孢曲霉NM-11-6应用于从干燥的柠檬果皮中精油的提取
(1)4℃保藏的棘孢曲霉NM-11-6菌株平板培养的孢子接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养48h，加5mL的无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为5.76×108个/mL。
(2)经55℃干燥的柠檬果皮50g，粉碎后过20目筛，置于到经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，加50mL无菌水，再接种2mL步骤(1)制备的孢子液(干柠檬果皮孢子接种浓度为2.30×107个/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养48h，获得柠檬果皮发酵物。
(3)步骤(2)获得的全部柠檬果皮发酵物转移到1-L的圆底烧瓶中，加入500mL的去离子水和50粒玻璃珠，振荡摇匀后，圆底烧瓶置于电热套中，连接挥发油提取器和回流冷凝管，从冷凝管上端加水至挥发油提取器的刻度部分，并溢流入烧瓶为止。接通冷凝管冷却水，开启电热套加热至圆底烧瓶内水沸腾后，调低电热套功率保持烧瓶内微沸，蒸馏至挥发油提取器中油量不再增加时(5h)，停止加热，放置1h以上，开启挥发油提取器下端活塞，先缓慢将水全部放出，再放出柠檬精油，称重。
按上述步骤，从50g干柠檬果皮中提取得到柠檬精油1.03g，提取得率为2.06％。
如干柠檬果皮不经本实施例步骤(1)至步骤(2)的发酵预处理，50g干柠檬果皮直接按步骤(3)提取柠檬精油，得到精油0.811g，提取得率为1.62％。可见，在干柠檬果皮提取精油前，增加棘孢曲霉NM-11-6的发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规方法相比，柠檬精油的提取得率可以提高27.2％。
序列表
<110> 梅婕
<120> 棘孢曲霉NM-11-6及其在柠檬精油提取中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 497
<212> DNA
<213> 棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)
<400> 1
acctcccacc cgtgcttacc gtaccctgtt gcttcggcgg gcccgccttc gggcggcccg 60
gggcctgccc ccgggaccgc gcccgccgga gaccccaatg gaacactgtc tgaaagcgtg 120
cagtctgagt tgattgatac caatcagtta aaactttcaa caatggatct cttggttccg 180
gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aactaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat 240
catcgagtct ttgaacgcac attgcgcccc ctggtattcc ggggggcatg cctgtccgag 300
cgtcatttct cccctccagc cccgctggtt gttgggccgc gcccccccgg gggcgggcct 360
cgagagaaac ggcggcaccg tccggtcctc gagcgtatgg ggctctgtca cccgctctat 420
gggcccggcc ggggcttgcc tcgaccccca atcttctcag attgacctcg gatcaggtag 480
ggatacccgc tgaactt 497
Claims (8)
1.棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)NM-11-6，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62073，保藏日期2021年11月17日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述棘孢曲霉NM-11-6在柠檬精油提取中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将棘孢曲霉NM-11-6孢子接种在含水柠檬果皮中，于28–30℃发酵48–60h，获得柠檬果皮发酵物，柠檬果皮发酵物经水蒸气蒸馏法提取，获得柠檬精油。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述含水柠檬果皮是新鲜的柠檬果皮切块；或者将干燥的柠檬果皮粉碎加入无菌水；所述无菌水的加量以柠檬果皮干重计为1.0–1.2mL/g。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的棘孢曲霉NM-11-6孢子接种量以新鲜柠檬果皮重量计为2×106–5×106个/g，或以干柠檬果皮重量计为1×107–3×107个/g。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述棘孢曲霉NM-11-6孢子以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的棘孢曲霉NM-11-6接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养48–60h后，加无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于从柠檬果皮发酵物中提取精油的方法为：将柠檬果皮发酵物中加入去离子水和玻璃珠，采用水蒸气蒸馏，冷凝回流提取获得柠檬精油。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的去离子水体积加入量以新鲜柠檬果皮重量计为2–3mL/g，或以干柠檬果皮重量计为8–10mL/g。
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