CN110699263A - 黑曲霉yh-6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黑曲霉YH‑6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量。淫羊藿中的淫羊藿素含量提高幅度大，最高可达26.3倍，含量由原来的0.273mg/g提高到7.44mg/g。相比于酸水解法，具有专一性好，产物得率高；相比于纯酶法转化，生物催化剂的成本低，且可使淫羊藿中多种糖苷转化为淫羊藿素，其含量提高幅度大。本发明实现了淫羊藿中药效成分原位转化，经处理的淫羊藿作为淫羊藿素提取的原料，提取产率大幅度提高。

Description

黑曲霉YH-6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种采用生物转化法提高淫羊藿中淫羊藿素含量的方法。
(二)背景技术
淫羊藿素(icaritin)，又称脱水淫羊藿素(anhydroicaritin)、淫羊藿苷元，CAS号为118525-40-9，分子式为C21H20O6，分子量为368.4，属于黄酮类化合物。目前研究已表明，淫羊藿素有雌激素样、免疫调节、抗炎、促进心肌细胞再生和分化、促骨质保护、促进神经细胞分化、抗肝损伤及延缓肝纤维化、抗肿瘤、贫血治疗及降低血糖等作用，而且未发现淫羊藿素对正常细胞有明显的毒副作用，说明其具有较高的安全性。作为一种低毒和高效的药物，淫羊藿素具有广阔的应用前景。
淫羊藿素天然存在于小檗科淫羊藿属(Epimedium)植物中，如淫羊藿(Epimediumbrevicomu)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)或朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum)等，但在这些植物中的含量很低，如在中药材淫羊藿(Epimedii Folium)中含量仅为0.06–0.10mg/g；而它的糖苷，包括淫羊藿苷(icariine,CAS:489-32-7)、宝藿苷I(baohuoside I,CAS:113558-15-9)、箭藿苷A(sagittatoside A,CAS:118525-35-2)、箭藿苷B(sagittatoside B,CAS:118525-36-3)、朝藿定A(epimedinA)、朝藿定B(epimedin B,CAS:110623-73-9)和朝藿定C(epimedin C,CAS:110642-44-9)等的含量较高，如在淫羊藿中，淫羊藿苷的含量可以高达9.99mg/g，朝藿定C的含量达到7.52mg/g[黄弥娜,周燕妮,柳强,等.HPLC法测定不同产地淫羊藿中7种主要黄酮类成分的含量.第二军医大学学报,2015,36(12):1352–1355]。所以，淫羊藿素的生产方法一般是通过水解淫羊藿苷获得。
目前，由淫羊藿苷为原料水解制备淫羊藿素的方法，已有一些研究报道和专利申请，都是以淫羊藿苷为原料，用酶解法、酸解法或酸酶结合法水解。酶解法采用蜗牛酶和柚苷酶，其优点是转化率高，但存在酶的成本高，酶解反应时间长的缺点；酸解法具有成本低的优势，但水解过程容易产生次生苷，致使转化率偏低，所以目前仍然缺乏经济有效的淫羊藿素生产方法。
如果采用微生物发酵的含糖苷酶的粗酶液处理淫羊藿，因含多种类型的糖苷酶，可以将淫羊藿苷及其他几种苷，都转化为淫羊藿素(化学反应式见图1)，其含量可大幅度提高，而且微生物产生的多糖水解酶对植物组织结构的纤维素和半纤维素水解，使淫羊藿质地疏松，从而有利于淫羊藿素的释放。经过转化处理的淫羊藿作为淫羊藿素提取的原料，提取率将大幅度提高，从而降低其生产成本。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—黑曲霉(Aspergillus niger)YH-6，及其在提高淫羊藿中淫羊藿素含量中的应用。经转化处理的淫羊藿中，淫羊藿素的含量显著提高，工艺具有成本低、流程简单、转化效率高等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—黑曲霉(Aspergillus niger)YH-6，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60793，保藏日期2019年9月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
本发明所述黑曲霉YH-6，是从中药材淫羊藿的富集培养物，经过筛选得到的优良菌株。所述黑曲霉YH-6的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为白色绒毛状，1天后变成灰色，菌丝上层布满黑色孢子头，背面略带黄褐色。光学显微镜下可以观察到分生孢子头黑褐色放射状，顶囊球形，顶囊周围着生双层分生孢子小梗，长短不一，小梗上产生分生孢子，分生孢子褐色球形。
本发明还提供一种所述黑曲霉YH-6在提高淫羊藿中淫羊藿素含量中的应用，所述应用的方法为：将黑曲霉YH-6经发酵培养的发酵液过滤，取滤液，加入淫羊藿，在30–35℃、150–200r/min的振荡条下转化24–36h(优选30℃、36h)，过滤除去粗酶液，滤饼烘干，即得富含淫羊藿素的淫羊藿。
进一步，所述淫羊藿的加入量以滤液体积计为20–50g/L，所述淫羊藿在加入前需在85℃干燥并粉碎过80目筛。
进一步，所述滤液制备方法为：将黑曲霉YH-6接种于产酶培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养2–3d，发酵液过滤，滤液即为糖苷酶粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷1–2g/L，蔗糖10–15g/L，酵母浸粉5–10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO40.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
进一步，优选所述产酶培养基组成为：淫羊藿苷2g/L，蔗糖15g/L，酵母浸粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH为6.0。
进一步，所述滤饼烘干条件为85℃、5–8h。
本发明所述黑曲霉YH-6在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液以体积浓度5％的量接入产酶培养基进行产酶培养，所述黑曲霉YH-6发酵培养方法为：
(1)活化培养：将黑曲霉YH-6接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d，获得黑曲霉YH-6孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子接种至种子培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养1–2d(优选30℃、200r/min、2d)，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10–15g/L，酵母浸粉5–10g/L，KH2PO42g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。优选的种子培养基组成为：蔗糖10g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0；
(3)产酶培养：用步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积分数3–5％(优选5％)的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养2–3d(优选30℃、200r/min、3d)，获得发酵液；所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷1–2g/L，蔗糖10–15g/L，酵母浸粉5–10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。优选的产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷2g/L，蔗糖15g/L，酵母浸粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH为6.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)淫羊藿中的淫羊藿素含量提高幅度大，最高可达26.3倍，含量由原来的0.273mg/g提高到7.44mg/g；(2)相比于酸水解法，具有专一性好，产物得率高；相比于纯酶法转化，生物催化剂的成本低，且可使淫羊藿中多种糖苷转化为淫羊藿素，其含量提高幅度大：(3)实现淫羊藿中药效成分原位转化，经处理的淫羊藿作为淫羊藿素提取的原料，提取产率大幅度提高。
(四)附图说明
图1淫羊藿糖苷转化为淫羊藿素的化学反应式。
图2HPLC法分析淫羊藿中淫羊藿素含量的标准曲线。
图3黑曲霉YH-6在PDA平板上生长3天的菌落照片。
图4标准品淫羊藿素的HPLC分析图谱(溶于甲醇，浓度0.06g/L)。
图5未转化处理的淫羊藿甲醇提取液HPLC分析图谱。
图6黑曲霉YH-6糖苷酶转化处理的淫羊藿甲醇提取液HPLC分析图谱。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述的淫羊藿为植物淫羊藿(Epimedium brevicornu Maxim)干燥的叶，购自亳州药材市场，产地甘肃。植物淫羊藿属于被子植物门(Angiospermae)、双子叶植物纲(Dicotyledoneae)、毛茛目(Ranunculales)、小檗科(Berberidaceae)、淫羊藿属(Epimedium)。
实施例1
250-mL三角瓶中加入约20g经85℃干燥并粉碎过80目筛的淫羊藿，再加入少量无菌水润湿，于28℃恒温培养5d。将长满霉菌的富集物用无菌水稀释1×106倍后涂布于PDA平板培养基上，于28℃恒温培养3d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株8株，分别予以编号YH-1到YH-8，保藏于4℃冰箱中备用。
所述的平板培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌15min后倒入无菌培养皿，冷却后备用。
用接种环挑取上述各个菌株平板培养基上孢子，接入100mL产酶培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养3d后，100mL发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。取50mL粗酶液于250-mL三角瓶中，再加入1g淫羊藿粉，于30℃、200r/min振荡24h后过滤，滤饼85℃烘干5h，HPLC分析淫羊藿素含量。同样条件下，用50mL的未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做阴性对照；用50mL的2mol/L的盐酸水溶液代替粗酶液做盐酸水解对照。
HPLC分析经不同菌株发酵的粗酶液转化的淫羊藿中淫羊藿素含量，结果见表1。8个菌株中，编号为YH-6的粗酶液转化处理淫羊藿后，淫羊藿素含量提高的幅度最高，由未转化时的0.273mg/g提高到3.66mg/g，提高了12.4倍；相比之下，用2mol/L盐酸水溶液处理淫羊藿，淫羊藿素的含量提高了6.73倍，远不如YH-6菌株粗酶液转化后提高的幅度。
表1不同菌株来源的粗酶液转化提高淫羊藿中淫羊藿素含量
所述的产酶培养基按如下组成和方法配制：淫羊藿苷1g/L，蔗糖10g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0，250-mL三角瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌15min。
所述的淫羊藿素HPLC分析方法为：1g淫羊藿于20mL的甲醇中，于室温、40KHz、100W条件下超声提取30min；过滤得甲醇提取液，依据提取液中淫羊藿素含量的高低，用甲醇作适当倍数稀释后，经0.45μm微孔滤膜过滤后HPLC法分析。
HPLC分析条件为：LC–20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm，广州菲罗门科学仪器有限公司)，柱温为室温；流动相：甲醇与水体积比82:18，流速1.0mL/min，检测波长270nm，进样量20μL。由相同分析条件下的标准品淫羊藿素浓度—峰面积标准曲线(图2)，计算出淫羊藿中的淫羊藿素的含量。
将菌株YH-6接种在PDA平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为白色绒毛状，1d后变成灰色，菌丝上层布满黑色孢子囊，背面略带黄褐色。光学显微镜下可以观察到分生孢子头黑褐色放射状，顶囊球形，顶囊周围着生双层分生孢子小梗，长短不一，小梗上产生分生孢子，分生孢子褐色球形。菌株YH-6在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图3。
将菌株YH-6交由生工生物工程(上海)有限公司鉴定，测得其核糖体ITS区rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，根据菌株YH-6菌落特征和核糖体ITS区rDNA核苷酸序列比对，确定菌株YH-6为一株黑曲霉(Aspergillus niger)，即为黑曲霉(Aspergillus niger)YH-6，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60793，保藏日期2019年9月27日。
实施例2：
以实施例1筛选获得的黑曲霉YH-6菌株为转化菌种，经种子扩大培养，发酵制备粗酶液转化处理淫羊藿，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉YH-6斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃生化培养箱中培养3d。所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子2环至种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养2d，得到种子液。所述的种子培养基组成和制备方法为：蔗糖10g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0；250-mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液按体积浓度5％(5mL)的接种量接入100mL产酶培养基，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为4.41g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液。所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷1g/L，蔗糖10g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH6.0。250-mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)淫羊藿85℃烘干，粉碎后过80目筛(淫羊藿粉粒径0.2mm左右)，1g加入到50mL步骤(3)制备的糖苷酶粗酶液中，30℃、200r/min振荡24h后，过滤，滤饼85℃烘干5h，即得富含淫羊藿素的淫羊藿。
HPLC分析表明，按本实施例方法，经黑曲霉YH-6转化处理的淫羊藿中，淫羊藿素的含量为3.85mg/g，是未转化时0.273mg/g的13.1倍。含量提高的倍数略高于实施例1，重复3批次实验结果无显著性差异，表明黑曲霉YH-6用于转化处理淫羊藿以提高淫羊藿素含量的产酶性能稳定。
实施例3
以黑曲霉YH-6为转化菌种，在实施例2的基础上，优化了发酵培养基组成，提高了淫羊藿投料浓度，延长了转化时间，得到优选的转化工艺，淫羊藿中的淫羊藿素含量得以大幅度提高，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉YH-6斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃生化培养箱中培养3d。所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子2环至种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养2d，得到种子液。所述的种子培养基组成和制备方法为：蔗糖10g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0；250-mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液按体积分数5％(5mL)的接种量接入100mL产酶培养基，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为5.53g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液。所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷2g/L，蔗糖15g/L，酵母浸粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH6.0。250-mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)淫羊藿85℃烘干，粉碎后过80目筛(淫羊藿粉粒径0.2mm左右)，2.5g加入到50mL步骤(3)制备的黑曲霉YH-6制备的粗酶液中，30℃、200r/min振荡36h后，过滤，滤饼85℃烘干8h，即得富含淫羊藿素的淫羊藿。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉YH-6转化处理的淫羊藿中，淫羊藿素的含量为7.44mg/g，是未转化时0.273mg/g的26.3倍。
实施例4
以黑曲霉YH-6为转化菌种，在实施例3的基础上，产酶发酵体系放大到300mL，转化体系放大到200mL，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的黑曲霉YH-6斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃生化培养箱中培养3d。所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子2环至种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养2d，得到种子液。所述的种子培养基组成和制备方法为：蔗糖10g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0；250-mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液按体积浓度5％(15mL)的接种量接入300mL产酶培养基，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为5.48g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液。所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷2g/L，蔗糖15g/L，酵母浸粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH6.0。1L的三角瓶装300mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)淫羊藿85℃烘干，粉碎后过80目筛(淫羊藿粉粒径0.2mm左右)，10g加入到200mL步骤(3)制备的黑曲霉YH-6制备的粗酶液中，30℃、200r/min振荡36h后，过滤，滤饼85℃烘干，即得富含淫羊藿素的淫羊藿。
HPLC分析表明，按本实施例方法，黑曲霉YH-6转化处理的淫羊藿中，淫羊藿素的含量为7.36mg/g，是未转化时0.273mg/g的26.0倍。
标准品淫羊藿素的HPLC分析图谱(溶于甲醇，浓度0.06g/L)见图4；未转化处理的淫羊藿甲醇提取液HPLC分析图谱见图5；本实施例中，经黑曲霉YH-6糖苷酶转化处理的淫羊藿甲醇提取液HPLC分析图谱见图6。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 黑曲霉YH-6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 556
<212> DNA
<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)
<400> 1
aggaaacatt actgagtgcg ggtctttggg ccacctccca tccgtgtcta ttataccctg 60
ttgcttcggc gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg cgccttttcc ccccgggccc 120
gtgcccgccg gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc gtgcagtctg agttgattga 180
atgcaatcag ttaaaacttt caacaatgga tctcttggtt ccggcatcga tgaagaacgc 240
agcgaaatgc gataactaat gtgaattgca gaattcagtg aatcatcgag tctttgaacg 300
cacattgcgc cccctggtat tccggggggc atgcctgtcc gagcgtcatt gctgccctca 360
agcccggctt gtgtgttggg tcgccgtccc cctctccggg gggacgggcc cgaaaggcag 420
cggcggcacc gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg tcacatgctc tgtaggattg 480
gccggcgcct gtcgacgttt tcaaacattt tttccaggtt gtcctcggat cagataggga 540
taccgcgatg aattaa 556

Claims (8)

1.黑曲霉(Aspergillus niger)YH-6，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60793，保藏日期2019年9月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
2.一种利用权利要求1所述黑曲霉YH-6提高淫羊藿中淫羊藿素含量的应用，其特征在于所述方法为：将黑曲霉YH-6经发酵培养的发酵液过滤，取滤液，加入淫羊藿，在30–35℃、150–200r/min的振荡条下转化24–36h，过滤除去粗酶液，滤饼烘干，即得富含淫羊藿素的淫羊藿。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述淫羊藿的加入量以滤液体积计为20–50g/L。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述淫羊藿在加入前需在85℃干燥并粉碎过80目筛。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述滤液制备方法为：将黑曲霉YH-6接种于产酶培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养2–3d，发酵液过滤，滤液即为糖苷酶粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷1–2g/L，蔗糖10–15g/L，酵母浸粉5–10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述产酶培养基组成为：淫羊藿苷2g/L，蔗糖15g/L，酵母浸粉10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH为6.0。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述滤饼烘干条件为85℃、5–8h。
8.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述黑曲霉YH-6在发酵前，先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液以体积浓度5％的量接入产酶培养基进行产酶培养，所述黑曲霉YH-6发酵培养方法为：
(1)活化培养：将黑曲霉YH-6接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d，获得黑曲霉YH-6孢子；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子接种至种子培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养1–2d，得种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10–15g/L，酵母浸粉5–10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH6.0；
(3)产酶培养：用步骤(1)活化培养后黑曲霉YH-6孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度3–5％的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡条件下培养2–3d，获得发酵液；所述产酶培养基终浓度组成为：淫羊藿苷1–2g/L，蔗糖10–15g/L，酵母浸粉5–10g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，CaCl2 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
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