CN116024096A

CN116024096A - 泡盛曲霉sr3-28及其在从朱砂七提取大黄素中的应用

Info

Publication number: CN116024096A
Application number: CN202210854264.8A
Authority: CN
Inventors: 陈虹; 雷超; 张建芬; 柯薇; 陆胤
Original assignee: Zhejiang Shuren University
Current assignee: Zhejiang Shuren University
Priority date: 2022-07-14
Filing date: 2022-07-14
Publication date: 2023-04-28

Abstract

本发明公开了一株泡盛曲霉SR3‑28及其在从朱砂七提取大黄素中的应用，将泡盛曲霉SR3‑28培养获得的发酵液过滤，收集滤液即为含糖苷酶的粗酶液；将粗酶液与朱砂七粉混合，于30–35℃条件酶解8–10h，过滤除去粗酶液，80℃烘干后得到朱砂七酶解物；朱砂七酶解物中加入乙醇水溶液超声提取，抽滤，得大黄素提取液；大黄素提取液经减压蒸干，甲醇溶解，真空干燥，得大黄素提取物。本发明提供的朱砂七微生物酶解预处理方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从朱砂七中提取大黄素的得率由1.78％提高到3.41％，提高了91.6％。

Description

泡盛曲霉SR3-28及其在从朱砂七提取大黄素中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一株泡盛曲霉SR3-28及其在从朱砂七提取大黄素中的应用。

(二)背景技术

大黄素(emodin)，化学名1,3,8-三羟基-6-甲基蒽醌，CAS号518-82-1，是一种天然蒽醌类物质，主要存在于大黄(Rheum palmatum)、虎杖(Polygonum cuspidatum)、毛脉蓼(Polygonum ciliinerve)、何首乌(Polygonum multiflorum)和芦荟(Aloe barbadensis)等植物的根茎中。现代药理学研究表明，大黄素具有抗炎、抗氧化、保肝护肾、抗肿瘤、利尿利胆和提高免疫力等活性，目前，已有将其作为临床药物应用于肠道疾病、肾病、心血管疾病、胰腺炎、糖尿病等病症的治疗。

虽然早在1923年就有大黄素全化学合成的研究报道，但到目前，人们开发的各种合成路线仍然存在产率低、路线复杂等缺点，经济环保的合成路线仍有待开发。所以，目前大黄素仍是从其含量相对较高的植物中提取，但提取得率偏低，如从虎杖中提取大黄素得率目前最高的研究报道为2.04％[骆航,李华生,孙兴力,等.虎杖中白藜芦醇及大黄素超声综合提取工艺.兰州工业学院学报,2020,27(5):81-86]，多数研究报道的提取得率小于1％，所以，大黄素的生产仍然缺乏经济有效的方法。

毛脉蓼的块根，即中药材朱砂七，又名朱砂莲、红药子和血三七等，主产于秦岭和大巴山区，为“太白七药”之一，作为中药使用已有悠久的历史。朱砂七中大黄素含量也相对较高，如任慧的分析结果表明：采收自陕西西安的朱砂七中，大黄素的含量高达3.707％[任慧,雷琨,崔小敏,等.高效液相色谱法同时测定朱砂七中5种成分的含量.中南药学,2020,18(5):822-824]，所以朱砂七也是提取大黄素较好的原料。此外，朱砂七中还含有大黄素的葡萄糖苷，即大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷(CAS号23313-21-5)，其含量接近甚至高于大黄素的含量，如任慧的分析结果表明，采收自陕西西安的朱砂七中，大黄素葡萄糖苷的含量为2.649％；采收自陕西宝鸡的朱砂七中，虽然大黄素含量仅为1.074％，但大黄素葡萄糖苷的含量高达8.629％。如果在提取时将大黄素葡萄糖苷水解为大黄素，提取得率则可以大幅度提高。

目前有不少关于从朱砂七中提取大黄素的研究报道，常用的方法是有机溶剂萃取法，所用的有机溶剂主要是乙醇，在此基础上，有采用超声波和酶解辅助乙醇提取，大黄素的提取得率可以显著提高，如李春燕的研究中，采用纤维素酶辅助乙醇提取，大黄素的提取得率提高了37.2％；采用超声波辅助乙醇提取，大黄素的提取得率提高了62.2％；采用超声–酶辅助乙醇提取，大黄素的提取得率提高了86.9％[李春燕,韩莉萍,周天娇,等.不同提取方法对朱砂七总大黄素含量的影响.海峡药学,2018,30(8):23-25]。

近年来，酶解辅助植物有效成分的提取有较多的应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等预处理植物原料，可使原料的组织成分(纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等)水解，破坏细胞壁结构，有利于有效成分在提取时释放，从而提高产物的提取得率。用纯酶预处理植物原料，酶的使用量往往较大，其成本不容忽视，而且，植物细胞壁由多种成分构成，用单一某种酶水解难以取得非常理想的效果。很多微生物可以产生多种多糖水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶和木质素酶等，如果用微生物发酵制备的粗酶液酶解植物原料，因其含有的多种糖苷酶，可以协同水解细胞壁成分，更有利于细胞中的有效成分释放出来，从而能显著提高有效成分的提取得率。

因此，本发明提出利用一种微生物发酵制备的粗酶液酶解朱砂七，一方面有利于游离的大黄素释放；另一方面，朱砂七中的大黄素葡萄糖苷在β-葡萄糖苷酶的作用下，被水解成大黄素(酶解反应见图1)。从经过酶解处理的朱砂七中提取大黄素，得率可以大幅度提高。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株新的微生物菌株—泡盛曲霉(Aspergillus awamori)SR3-28，及其在从朱砂七提取大黄素中的应用，朱砂七经酶解预处理后，大黄素的提取得率可以大幅度提高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新的微生物菌株—泡盛曲霉(Aspergillus awamori)SR3-28，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62499，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

本发明所述泡盛曲霉SR3-28，是从朱砂七的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述的泡盛曲霉SR3-28的菌落形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃培养24h，长出浅黄色的菌丝，有较浅的辐射状沟纹，菌丝稀疏；培养48h后，菌落表面有大量黑色小颗粒状物，背面黄褐色。分生孢子梗发生于基质；顶囊球形或近球形，大小不一，有的呈稍长形；分生孢子梗双层，分生孢子球形或近球形，稍大，3.5–4.0×5.0–6.0μm，壁平滑或稍粗糙。泡盛曲霉SR3-28在PDA平板培养基上28℃培养48h的菌落照片见图2。

所述的泡盛曲霉SR3-28的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供一种所述的泡盛曲霉SR3-28在从朱砂七提取大黄素中的应用，所述应用的方法为：将泡盛曲霉SR3-28培养获得的发酵液过滤，收集滤液即为含糖苷酶的粗酶液；将粗酶液与朱砂七粉混合，于30–35℃条件酶解8–10h，过滤除去粗酶液，滤饼80℃烘干后得到朱砂七酶解物；朱砂七酶解物中加入乙醇水溶液超声提取，抽滤，取滤液得大黄素提取液；大黄素提取液经减压蒸干，甲醇溶解，真空干燥，得大黄素提取物。

进一步，所述粗酶液体积用量以朱砂七粉质量计为4–6mL/g，所述朱砂七粉在加入前需自然晾干或80℃烘干并粉碎过40目筛。

进一步，所述粗酶液制备方法为：将泡盛曲霉SR3-28接种于产酶培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡培养48–60h，发酵液过滤，滤液即为含糖苷酶的粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：麸皮20–40g/L，(NH₄)₂SO₄ 4–5g/L，KH₂PO₄ 3–5g/L，MgSO₄ 0.5–1.0g/L，CaCl₂ 0.2–0.3g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。

进一步，优选所述产酶培养基组成为：麸皮30g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.3g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

本发明所述泡盛曲霉SR3-28在产酶培养前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子液，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后将孢子液或种子液以体积百分数2％–5％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：

(1)活化培养：将低温保存的泡盛曲霉SR3-28接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于28–30℃恒温培养36–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得泡盛曲霉SR3-28孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成小块，加水煮沸20min，去渣留汁)、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)。

(2)种子扩大培养：步骤(1)活化培养后的泡盛曲霉SR3-28孢子液按体积百分数2％–4％的接种量接种至种子培养基中，于28–30℃、100–150r/min恒温振荡培养36–40h，得种子液(优选干菌体浓度为3.15–3.27g/L)；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10–15g/L，蛋白胨3–5g/L，KH₂PO₄ 2–3g/L，MgSO₄ 0.3–0.5g/L，CaCl₂ 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH6.0-6.5。优选所述的种子培养基组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

(3)产酶培养：用步骤(1)活化培养后泡盛曲霉SR3-28孢子液，或步骤(2)制备的种子液按体积百分数2％–5％的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡培养48–60h，获得发酵液(优选干菌体浓度为6.86–7.54g/L、β-葡萄糖苷酶活力为49.6–55.2U/mL)。

进一步，所述大黄素提取液的制备方法为：所述的朱砂七酶解物中，加入体积百分数65％–70％乙醇水溶液，搅拌均匀后置于60–65℃水浴中浸提1–2h，再转入60–65℃、100–200W的超声波清洗机中提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，或滤渣按上述提取步骤重复提取一次，合并2次提取的滤液，得大黄素提取液。所述乙醇水溶液体积加入量以原料朱砂七粉质量计为10–20mL/g。

进一步，从大黄素提取液中回收大黄素提取物的方法为：大黄素提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，再加入甲醇溶解残留物；甲醇溶液经8000r/min离心5min除去沉淀后，于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥，得大黄素提取物；所述甲醇体积加入量以原料朱砂七粉质量计为0.4–0.5mL/g。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在朱砂七乙醇超声提取大黄素前，增加了微生物发酵制备的糖苷酶粗酶液预处理步骤。所用的微生物泡盛曲霉SR3-28，是以能够产酶用于提高朱砂七大黄素提取得率为目标而筛选得到，它在麸皮为主要碳源的培养基中生长，产生多种水解酶，能够协同水解朱砂七中的纤维素、半纤维素和蛋白质等物质，使细胞壁破碎，有助于大黄素溶出，而且朱砂七中的大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷也被水解成大黄素，使大黄素的提取得率显著提高。本发明提供的朱砂七微生物酶解预处理方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从朱砂七中提取大黄素的得率由1.78％提高到3.41％，提高了91.6％。

(四)附图说明

图1为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷酶解为大黄素的反应式。

图2为泡盛曲霉SR3-28在PDA上28℃培养48h的菌落照片。

图3为HPLC测定大黄素的标准曲线。

图4为对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述的朱砂七为蓼科(Polygonaceae)植物毛脉蓼(Polygonumcillinerve)的块根，洗净切片后自然晒干或80℃烘干，朱砂七粉是干燥的朱砂七经粉碎后过40目筛的细粉。

实施例1：发酵菌株的分离和筛选

发酵产酶预处理朱砂七的微生物菌种，按如下步骤分离和筛选获得：

(1)250-mL三角烧瓶中加入10g的朱砂七粉，再加入5mL无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养60h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养60h，得纯培养菌株8株，各菌株的编号见表1。

(2)8个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。

(3)用步骤(2)制备各菌株的孢子液1.0mL，分别接种50mL产酶培养基中(接种量为2％的体积百分数)，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养60h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为糖苷酶粗酶液。

(4)8只100-mL三角烧瓶中加入5g朱砂七粉，再加入步骤(3)制备的各菌株的粗酶液30mL，搅拌均匀后于30℃酶解10h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液，滤饼于80℃烘干，得朱砂七酶解物。

(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液预处理的全部朱砂七酶解物分别于10只250-mL三角烧瓶中，分别加入100mL的体积百分数为65％乙醇水溶液，摇匀后置于60℃水浴中浸提1h，然后转入60℃的超声波清洗机中，100W超声提取30min，趁热布氏漏斗抽滤，收集滤液，得大黄素提取液。

(6)步骤(5)制备的大黄素提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加2mL甲醇充分振荡，甲醇溶液经8000r/min离心5min后，上清液经0.22μm滤膜过滤，高效液相色谱(HPLC)测定滤液中大黄素含量。

同样条件下，用30mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解对照；用30mL含质量浓度1％纤维素酶(活力100000U/g)的磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶预处理对照。

表1 不同菌株发酵制备的粗酶液酶解朱砂七后的大黄素提取得率

由表1数据可以看出，朱砂七经SR3菌株发酵制备的粗酶液酶解后，大黄素提取得率为2.12％，较未经酶解的对照1.47％相比，大黄素提取得率提高了44.2％。用纤维素酶预处理朱砂七，也能显著提高大黄素的提取得率，较未经酶解的对照提高了27.9％，但远不如SR3菌株发酵制备的粗酶液。朱砂七经过有些微生物菌株的粗酶液酶解后，大黄素的提取得率不仅没有提高，反而显著下降，特别是SR4菌株，可能这些菌株产生了降解大黄素的酶。以上结果说明用于酶解朱砂七以提高大黄素提取得率的微生物菌株有选择性，不仅要求能产酶水解朱砂七细胞壁成分，还要求能产生糖苷酶转化大黄素葡萄糖苷为大黄素，而且还要求不能产酶降解大黄素。本发明选定SR3菌株作为提高朱砂七中大黄素提取得率的产酶菌种。

所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂溶化后分装于三角烧瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：麸皮30g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.3g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的HPLC测定大黄素含量的方法为：LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为岛津Shim-pack VP-ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温为室温(25–30℃)；体积比80:15的甲醇和双蒸水(含0.1％体积百分数的磷酸)混合液为流动相，流速1.0mL/min，检测波长254nm，进样量20μL。待测样品用甲醇溶解并经适当倍数稀释至大黄素的含量在20–100mg/L进样，由相同分析条件下的标准品大黄素浓度—峰面积标准曲线(图3)，计算出测定样品中的大黄素的浓度。

所述的从朱砂七中提取大黄素得率按以下公式计算：

实施例2：SR3菌株的诱变选育

对SR3菌株进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：

(1)孢子液的制备：SR3菌株经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，振荡15min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.22×10⁷个/mL。

(2)诱变：在红光照明下，分别取1.0mL上述孢子悬液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养36h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。

(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，28℃培养48h，获得43个菌株。各个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液1mL，接入50mL产酶培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡培养60h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的菌株10株，再按实施例1方法，用这10个菌株发酵的粗酶液酶解朱砂七，再乙醇超声提取大黄素。复筛的突变菌株发酵制备的粗酶液酶解朱砂七后的大黄素提取得率见表2。

表2 复筛突变菌株发酵制备的粗酶液酶解朱砂七后的大黄素提取得率

从表2数据可以看出，在复筛的10个菌株中，编号为SR3-28的菌株，发酵产β-葡萄糖苷酶的活力为53.7U/mL，较野生菌株SR-3的35.1U/mL提高了53.0％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解朱砂七后，大黄素提取得率为2.75％，较野生菌株SR3的2.12％提高了29.7％，较未经酶解的对照1.47％提高了87.1％。所以，本发明选定SR3-28菌株作为提高朱砂七中大黄素提取得率的产酶菌株。

所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8mL、5mmol/L的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(β-pNPG)0.2mL(pH 6.0、0.2mol/L的磷酸缓冲液配制)，于35℃下反应15min后，加入2mL的1mol/L Na₂CO₃溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于400nm波长下测定吸光度(A₄₀₀)。由对硝基苯酚(pNP)质量浓度—A₄₀₀标准曲线(图4)计算出反应体系中pNP浓度。

β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：35℃下、pH 6.0缓冲体系中，lmin内水解β-pNPG生成1μmol pNP的酶量为1个酶活单位。

酶活按以下公式(1)计算。

式(1)中，V₁：反应体系总体积；V₂：粗酶液体积；C₁：pNP浓度；T：反应时间。

对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线的制作：用蒸馏水配制浓度为1mmol/L的pNP标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL至l0mL容量瓶中，用l mol/L Na₂CO₃溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度为10、20、30、40、50μmol/L。以蒸馏水为空白，测定在400nm波长处的吸光值，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A₄₀₀为纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—A₄₀₀标准曲线。

实施例3：SR3-28菌株的分类鉴定

SR3-28菌株划线接种于PDA平板培养基上，28℃培养24h，长出浅黄色的菌丝，有辐射状沟纹，菌丝稀疏；培养48h后，菌落表面有大量黑色小颗粒状物，背面黄褐色。分生孢子梗发生于基质；顶囊球形或近球形，大小不一，有的呈稍长形；分生孢子梗双层，分生孢子球形或近球形，稍大，3.5–4.0×5.0–6.0μm，壁平滑或稍粗糙。SR3-28菌株在PDA平板培养基上28℃培养48h的菌落照片见图2。

测得SR3-28菌株的rDNA-ITS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行BLAST比对，结果表明SR3-28菌株与NCBI中的10个菌株的ITS序列有大于99％的同源性，依据rDNA-ITS序列，绘制的SR3-28菌株与这些菌株系统发育树，表明其与泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的亲缘关系最高，SR3-28菌株的菌落形态特征符合文献(Mycobank，http://www.mycobank.org)对泡盛曲霉的描述，可以确定SR3-28菌株的生物学分类位置为：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，曲霉属(Aspergillus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。

所述的ITS区rDNA序列为：

CTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAA。

综上，从朱砂七粉的微生物富集物中分离的SR3菌株，经紫外线诱变后，筛选获得了SR3-28菌株，即泡盛曲霉(Aspergillus awamori)SR3-28，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62499，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

实施例4：泡盛曲霉SR3-28应用于从朱砂七中提取大黄素

泡盛曲霉SR3-28应用于从朱砂七中提取大黄素，可以按以下步骤操作：

(1)冻干管保存的泡盛曲霉SR3-28孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养60h，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得泡盛曲霉SR3-28的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液2mL接种50mL产酶培养基(接种量为4％的体积百分数)，于28℃、200r/min恒温振荡条件下培养60h，得干菌体浓度为6.86g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为49.6U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：麸皮30g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂ 0.3g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)10g朱砂七粉于250-mL三角烧瓶中，再加入步骤(2)制备的粗酶液50mL，搅拌均匀后于30℃酶解10h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液，滤饼于80℃烘干，得朱砂七酶解物。

(4)步骤(3)全部朱砂七酶解物于250-mL三角烧瓶中，加入100mL的体积百分数为65％乙醇水溶液，摇匀后置于60℃水浴中浸提1h，然后转入60℃的超声波清洗机中，功率100W超声提取30min，布氏漏斗抽滤，滤渣按上述提取步骤重复提取一次，合并2次提取的滤液，得大黄素提取液。

(5)步骤(4)制备的大黄素提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加5mL甲醇充分振荡，甲醇溶液经8000r/min离心5min除去沉淀后，于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重，研磨成细粉，得大黄素提取物。

按上述步骤，得大黄素提取物0.763g，大黄素含量为41.8％，即得到大黄素0.319g，提取得率为3.19％，产品为红棕色粉状物。

实施例5：泡盛曲霉SR3-28应用于从朱砂七中提取大黄素

(1)4℃保存的泡盛曲霉SR3-28PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养48h，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得泡盛曲霉SR3-28的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)取步骤(1)制备的孢子液1mL接入50mL种子培养基中(接种量为2％的体积百分数)，于30℃、100r/min恒温振荡条件下培养40h，得干菌体浓度为3.27g/L的种子液。所述的种子培养基终浓度组成和配制方法为：葡萄糖15g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄ 3g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂ 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL的三角烧瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)用步骤(2)制备的种子液5mL(接种量为5％的体积百分数)接种100mL产酶培养基，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养48h，得干菌体浓度为7.54g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为55.2U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4，500-mL的三角烧瓶装100mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(4)25g朱砂七粉于250-mL三角烧瓶中，再加入步骤(3)制备的粗酶液100mL，搅拌均匀后于35℃酶解8h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液，滤饼于80℃烘干，得朱砂七酶解物。

(5)步骤(4)全部朱砂七酶解物于1-L三角烧瓶中，加入250mL的体积百分数为70％乙醇水溶液，摇匀后置于65℃水浴中浸提1.5h，然后转入65℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取45min，布氏漏斗抽滤，滤渣按上述提取步骤重复提取一次，合并2次提取的滤液，得大黄素提取液。

(6)步骤(5)制备的大黄素提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL甲醇充分振荡，甲醇溶液经8000r/min离心5min除去沉淀后，于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重，研磨成细粉，得大黄素提取物。

按上述步骤，得大黄素提取物1.97g，大黄素含量为43.1％，即得到大黄素0.849，提取得率为3.40％，产品为红棕色粉状物。

实施例6：泡盛曲霉SR3-28应用于从朱砂七中提取大黄素

(1)4℃保存的泡盛曲霉SR3-28PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养36h，加5mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，得泡盛曲霉SR3-28的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)取步骤(1)制备的孢子液2mL接入50mL种子培养基中(接种量为4％的体积百分数)，于30℃、150r/min恒温振荡条件下产酶培养36h，得干菌体浓度为3.15g/L的种子液，所述的种子培养基终浓度组成和配制方法同实施例5。

(3)用步骤(2)制备的种子液5mL接种100mL产酶培养基(接种量为5％的体积百分数)，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养48h，得干菌体浓度为7.48g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的β-葡萄糖苷酶活力为52.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例5。

(4)50g朱砂七粉于500-mL三角烧瓶中，再加入步骤(3)制备的粗酶液200mL，搅拌均匀后于35℃酶解8h，布氏漏斗抽滤除去粗酶液，滤饼于80℃烘干，得朱砂七酶解物。

(5)步骤(4)的全部朱砂七酶解物于1-L三角烧瓶中，加入500mL的体积百分数为70％乙醇水溶液，摇匀后置于65℃水浴中浸提2h，然后转入65℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，滤渣按上述提取步骤重复提取一次，合并2次提取的滤液，得大黄素提取液。

(6)步骤(5)制备的大黄素提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加20mL甲醇充分振荡，甲醇溶液经8000r/min离心5min除去沉淀后，于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重，研磨成细粉，得大黄素提取物。

按上述步骤，得大黄素提取物3.85g，大黄素含量为44.3％，即得到大黄素1.71g，提取得率为3.41％，产品为红棕色粉状物。

对比例1：常规超声乙醇法提取朱砂七中的大黄素

(1)50g朱砂七粉于1-L三角烧瓶中，加入500mL的体积百分数为70％乙醇水溶液，摇匀后置于65℃水浴中浸提2h，然后转入65℃的超声波清洗机中，功率200W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，滤渣按上述提取步骤重复提取一次，合并2次提取的滤液，得大黄素提取液。

(2)步骤(2)制备的大黄素提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加20mL甲醇充分振荡，甲醇溶液经8000r/min离心5min除去沉淀后，于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥至恒重，研磨成细粉，得大黄素提取物。

按上述步骤，得大黄素提取物2.38g，大黄素含量为37.4％，即得到大黄素0.890g，提取得率为1.78％。

比较实施例6和对比例1的结果可以看出：在从朱砂七中乙醇超声提取大黄素前，增加了泡盛曲霉SR3-28的发酵制备的粗酶液酶解预处理，大黄素的提取得率由1.78％提高到3.41％，较不采用酶解预处理的常规方法相比，提取得率可以提高了91.6％。

Claims

1.泡盛曲霉(Aspergillus awamori)SR3-28，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62499，保藏日期2022年5月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

2.一种权利要求1所述的泡盛曲霉SR3-28在从朱砂七提取大黄素中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：将泡盛曲霉SR3-28培养获得的发酵液过滤，收集滤液即为含糖苷酶的粗酶液；将粗酶液与朱砂七粉混合，于30–35℃条件酶解8–10h，过滤除去粗酶液，滤饼80℃烘干后得到朱砂七酶解物；朱砂七酶解物中加入乙醇水溶液超声提取，抽滤，取滤液得大黄素提取液；大黄素提取液经减压蒸干，甲醇溶解，真空干燥，得大黄素提取物。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述粗酶液体积用量以朱砂七粉质量计为4–6mL/g，所述朱砂七粉在加入前需自然晾干或80℃烘干并粉碎过40目筛。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述粗酶液制备方法为：将泡盛曲霉SR3-28接种于产酶培养基中，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡培养48–60h，发酵液过滤，滤液即为含糖苷酶的粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：麸皮20–40g/L，(NH₄)₂SO₄4–5g/L，KH₂PO₄ 3–5g/L，MgSO₄ 0.5–1.0g/L，CaCl₂ 0.2–0.3g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述产酶培养基组成为：麸皮30g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，CaCl₂ 0.3g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下步骤制备：

(1)活化培养：将低温保存的泡盛曲霉SR3-28接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养36–60h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得泡盛曲霉SR3-28孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然；

(2)种子扩大培养：步骤(1)活化培养后的泡盛曲霉SR3-28孢子液按体积百分数2％–4％的接种量接种至种子培养基中，于28–30℃、100–150r/min恒温振荡培养36–40h，得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖10–15g/L，蛋白胨3–5g/L，KH₂PO₄ 2–3g/L，MgSO₄0.3–0.5g/L，CaCl₂ 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0-6.5；

(3)产酶培养：用步骤(1)活化培养后泡盛曲霉SR3-28孢子液，或步骤(2)制备的种子液按体积百分数2％–5％的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、200–250r/min恒温振荡培养48–60h，获得发酵液。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述大黄素提取液的制备方法为：朱砂七酶解物中加入体积百分数65％–70％乙醇水溶液，搅拌均匀后置于60–65℃水浴中浸提1–2h，再转入60–65℃、100–200W的超声波清洗机中提取30–60min；超声醇提结束后，趁热抽滤，或滤渣按上述提取步骤重复提取一次，合并2次提取的滤液，得大黄素提取液；所述乙醇水溶液体积加入量以原料朱砂七粉质量计为10–20mL/g。

9.如权利要求3所述的应用，其特征在于，从大黄素提取液中回收大黄素提取物的方法为：大黄素提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，再加入甲醇溶解残留物；甲醇溶液经8000r/min离心5min除去沉淀后，于50℃、–0.1MPa条件下真空干燥，得大黄素提取物；所述甲醇体积加入量以原料朱砂七粉质量计为0.4–0.5mL/g。