CN115838444B

CN115838444B - 一种利用微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法

Info

Publication number: CN115838444B
Application number: CN202211716803.8A
Authority: CN
Inventors: 梅建凤; 范紫雨; 蒋凯莉; 淘乐祥; 吴泽栋; 晋可嘉
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2024-03-26
Anticipated expiration: 2042-12-29
Also published as: CN115838444A

Abstract

本发明公开了一种利用微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法，在从艾叶热水超声提取多糖前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解预处理。所用的产酶微生物禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2‑19，是针对能够水解艾叶细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。经产酶培养的禾谷镰刀菌AY2‑19发酵液中含有多种水解酶，能够协同水解艾叶中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使细胞壁破损，有助于艾叶可溶性多糖在提取时溶出，其提取得率可以显著提高。本发明提供的微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法，较直接采用超声水提法相比，艾叶多糖的提取得率可以提高41.4％。

Description

一种利用微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法

(一)技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种微生物酶解辅助法在提取艾叶多糖中的应用。

(二)背景技术

艾叶是菊科蒿属植物艾草(Artemisia argyi Levl.et Vant.)的叶片，是我国常用中药材，在历版中国药典中均有收载(中药材名为Artemisiae Argyi Folium)，其性味辛、苦，温，有小毒；归肝、脾、肾经；具温经止血，散寒止痛，外用祛湿止痒之功效；用于吐血，衄血，崩漏，月经过多，胎漏下血，少腹冷痛，经寒不调，宫冷不孕；外治皮肤瘙痒；醋艾炭温经止血，用于虚寒性出血治疗。现代药理学研究表明，艾叶及其提取物具有抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利胆、止血及抗凝血、抗炎、抗过敏、免疫调节、抗癌等多种药理作用。艾叶中含有多种生理活性成分，包括挥发油、黄酮、多糖、三萜、倍半萜、桉树烷等。多糖是艾叶的主要活性成分之一，具有抗氧化、增强免疫、抗肿瘤、降血糖、降血脂等多种功效，因此开发与应用艾叶多糖有较高的经济和社会价值。

目前，有不少关于艾叶多糖提取方法的研究报道，基本的方法都是热水提取乙醇沉淀法(简称为“水提醇沉法”)，在此基础之上，有用微波、超声波、高压和酶解等辅助提取。不同提取方法有各自的优缺点，如常规的水提醇沉法操作简单，但存在提取得率低、耗时长等缺点；微波辅助提取法提取时间短、效率高，但多糖的活性有所下降；超声辅助提取法设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够显著；高压辅助提取法具有提取得率、时间短的优点，但是也存在多糖分解的问题；酶解辅助提取法能够显著提高提取得率，而且条件温和，提取的多糖活性好，缺点是增加了酶的使用成本。

近年来，酶解技术在植物活性成分的提取中有广泛应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等，在适宜的条件下水解植物原料，植物的细胞壁被水解，从而有利于胞内活性成分在提取时溶出。酶解技术应用于艾叶多糖的提取也有报道，如熊曼萍等利用纤维素酶酶解艾叶后，再用热水超声提取艾叶多糖，多糖提取得率比单纯的超声波法提高了56.75％[熊曼萍.超声波-酶法提取艾叶多糖的条件研究.食品工业科技,2012,33(9):330-331,435]。目前应用在植物活性成分提取中最多的酶是纤维素酶，植物的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，单一使用纤维素酶，对提高产物提取得率非常有限。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶。使用复合酶虽然可以有效地提高产物提取得率，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。

微生物产酶能力非常强大，尤其是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。因此，如果利用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中就含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分在提取时释放，能显著提高提取率；相比于使用纯酶，使用未经分离纯化的粗酶液，成本也相对较低。

为了提高艾叶多糖的提取得率，本发明用微生物发酵制备的粗酶液酶解艾叶，可使艾叶多糖的提取得率大幅度提高。

(三)发明内容

本发明目的是将微生物酶解技术应用于艾叶多糖的提取中，艾叶经微生物发酵制备的粗酶液酶解后，多糖的提取得率可以大幅度提高。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法，所述方法为：(1)微生物菌株禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2-19经产酶培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；所述的禾谷镰刀菌AY2-19，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63062，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)将粗酶液与艾叶粉混合，于26–30℃条件下酶解4–6h，得艾叶酶解物；(3)艾叶酶解物中补充去离子水，经85–90℃下超声提取，滤液浓缩后，获得艾叶水提浓缩液；(4)向艾叶水提浓缩液加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得艾叶多糖提取物。

进一步，步骤(1)所述粗酶液制备方法为：将禾谷镰刀菌AY2-19孢子接种于产酶培养基中，于30℃、180–200r/min振荡培养64–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮40–50g/L，蛋白胨8–10g/L，NaNO₃ 5–6g/L，KH₂PO₄1–2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25–0.5g/L，CaCl₂ 0.4–0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。

进一步，优选所述产酶培养基组成为：小麦麸皮50g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 5g/L，KH₂PO₄2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂ 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

本发明所述禾谷镰刀菌AY2-19在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得禾谷镰刀菌AY2-19孢子液，按体积分数3％–5％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：

①孢子液制备：将禾谷镰刀菌AY2-19接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于28℃培养64–72h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得禾谷镰刀菌AY2-19孢子液；所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌20min。

②产酶培养：用步骤①制备的禾谷镰刀菌AY2-19孢子液，按体积分数3％–5％的接种量，接入产酶培养基，于30℃、180–200r/min振荡培养64–72h，获得干菌体浓度为3.64–3.77g/L、纤维素酶活力为34.8–36.3U/mL的发酵液。

进一步，步骤(2)所述粗酶液体积用量以艾叶粉质量计为4–10mL/g[即料酶比为1:4–1:10(g:mL)]；所述艾叶粉是新鲜艾叶经自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。

进一步，步骤(3)所述艾叶水提浓缩液的制备方法为：往艾叶酶解物中补充去离子水，使提取体系的料液比为1:30–1:40(g:mL)，搅拌均匀后于水温85–90℃的超声波清洗机中，150W超声提取60–90min，布氏漏斗抽滤，滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至原体积的1/25–1/20，获得艾叶水提浓缩液。

进一步，步骤(4)所述艾叶多糖提取物的制备方法为：向艾叶水提浓缩液中加入无水乙醇，使溶液的乙醇体积分数达到75％–80％，4℃条件下静置12–16h后，8000r/min离心5–10min，弃去上清液，加入原料艾叶粉质量计0.6–2mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得艾叶多糖提取物。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明在艾叶热水超声提取多糖前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解预处理。所用的产酶微生物禾谷镰刀菌AY2-19，是针对能够水解艾叶细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。经产酶培养的禾谷镰刀菌AY2-19发酵液中含有多种水解酶，能够协同水解艾叶中的纤维素、半纤维素和果胶等物质，使细胞壁破损，有助于艾叶可溶性多糖在提取时溶出，其提取得率可以显著提高。本发明提供的微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法，较直接采用超声水提法相比，艾叶多糖的提取得率可以提高41.4％。

(四)附图说明

图1为禾谷镰刀菌AY2-19在PDA上28℃培养3d的菌落照片。

图2为苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。

图3为DNS法测定葡萄糖的标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述的艾叶为菊科蒿属植物艾草((Artemisia argyi)的新鲜叶片，经自来水洗净后85℃烘干，产地河南安阳市；艾叶粉是干燥的艾叶经粉碎后过40目筛的细粉。

实施例1：发酵艾叶微生物菌株的分离和筛选

发酵产酶酶解艾叶的微生物菌种，按如下步骤分离和筛选获得：

(1)250-mL三角烧瓶中加入5g艾叶粉，加入7.5mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃培养72h，得纯培养菌株8株，各菌株编号见表1。

(2)8个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。

(3)取步骤(2)制备各菌株的孢子液1.5mL接入50mL产酶培养基中(接种量为3％的体积分数)，于30℃、180r/min振荡条件下产酶培养72h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。

(4)8只50-mL离心管中分别加入0.5g艾叶粉，加入步骤(3)制备的各菌株粗酶液5mL[即料酶比为1:10(g:mL)]，搅拌均匀后于30℃水浴中酶解4h，得艾叶酶解物。

(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液酶解的全部艾叶酶解物中，分别补充15mL去离子水[提取体系含水20mL，料液比为1:40(g:mL)]，振荡均匀于85℃的超声波清洗机中，150W超声提取60min，布氏漏斗抽滤。取1mL滤液于试管中，再加入4mL的无水乙醇(溶液的乙醇体积分数为80％)，充分振荡后于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入5mL无水乙醇洗涤一次后再次离心，沉淀物用5mL去离子水溶解，采用苯酚-硫酸法测定溶液中可溶性多糖含量。

从步骤(4)开始，用5mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解的对照；用5mL活力为2000U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)代替粗酶液做纤维素酶酶解的对照。经不同菌株发酵制备的粗酶液酶解的艾叶及对照的多糖提取得率见表1。

表1经不同菌株发酵制备的粗酶液酶解的艾叶及对照的多糖提取得率

由表1数据可以看出，艾叶经AY2菌株发酵制备的粗酶液酶解后，多糖得率为2.57％，较未酶解的对照2.23％相比，多糖提取得率提高了15.2％。用纤维素酶酶解艾叶，也能显著提高多糖的提取得率，较未经酶解的对照提高了6.73％，但远不如AY2菌株发酵制备的粗酶液。艾叶经过有些微生物菌株的粗酶液酶解后，多糖的提取得率并未提高，甚至有所下降，如AY4和AY7菌株。以上结果说明用于酶解艾叶以提高多糖提取得率的微生物菌株有选择性，不仅要求能产酶水解艾叶细胞壁成分，还要求不能产酶降解多糖。本发明选定AY2菌株作为提高艾叶多糖提取得率的产酶菌种。

所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm无菌培养皿，每皿15–20mL。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：小麦麸皮50g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 5g/L，KH₂PO₄2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂ 0.5g/L，溶剂为自来水，pH6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的艾叶多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：艾叶多糖液体样品用去离子水做适当倍数稀释(测定的A₄₉₀在0.2–0.8之间)，作为待测样品溶液；若多糖提取物为固体样品则用去离子水配制成浓度0.1mg/mL的水溶液，作为待测样品溶液。吸取待测样品溶液1mL于试管中，加1mL的体积分数5％苯酚水溶液，搅拌均匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，搅拌均匀后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以1mL去离子水作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A₄₉₀)。以相同方法测定不同葡萄糖浓度样品的A₄₉₀，绘制葡萄糖浓度—A₄₉₀标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定多糖样品中多糖含量。

所述的艾叶多糖提取得率按公式(1)计算：

实施例2：发酵菌株AY5的诱变选育

对菌株AY2进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：

(1)孢子液的制备：菌株AY2经PDA平板培养基28℃活化培养64h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团蓬松的脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.32×10⁷个/mL。

(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于6只直径6cm的培养皿中，培养皿分别于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。

(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得40个菌株。各个菌株经28℃培养72h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液1.5mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的10个菌株，按实施例1方法，用这10个菌株发酵的粗酶液酶解艾叶，超声水提醇沉法提取多糖。突变菌株发酵制备的粗酶液酶解艾叶后的多糖提取得率见表2。

表2突变菌株发酵制备的粗酶液酶解艾叶后的多糖提取得率

从表2数据可以看出，在复筛的10个菌株中，编号为AY2-19的菌株，发酵产纤维素酶的活力为35.4U/mL，较野生菌株AY2的26.7U/mL提高了32.6％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解艾叶后，多糖提取得率为3.15％，较野生菌株AY2的2.57％提高了17.4％，较未经酶解的对照2.23％提高了41.3％。所以，本发明选定AY2-19菌株作为提高艾叶多糖提取得率的产酶菌株。

所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。

所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，搅拌均匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A₅₄₀)，由葡萄糖标准曲线(图3)计算样品中的葡萄糖浓度，再而计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力按公式(2)计算。

公式(2)中，C：由标准曲线计算得到的葡萄糖浓度(mg/mL)；V₁：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V₂：粗酶液体积，即0.5mL。

葡萄糖标准曲线的绘制：7支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，搅拌均匀，于分光光度计测定A₅₄₀，以葡萄糖浓度为横坐标，A₅₄₀为纵坐标绘制标准曲线(图3)。

DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。

实施例3：菌株AY2-19的分类鉴定

菌株AY2-19划线接种在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养，初期菌落呈白色，3d后菌落颜色略有加深，菌丝层较厚，絮状，表面无孢子粉，背面无色素扩散。光学显微镜下可以观察到有大型分生孢子和小型分生孢子两种。大型分生孢子呈镰刀型或月牙形，3–5个隔膜，大小4–5×25–40μm；小型分生孢子较少，呈卵圆形或椭圆形，大小2.5–4×4.5–10μm。禾谷镰刀菌AY2-19划线接种在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。

测得菌株AY2-19的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与77个Sporidiobolus(锁掷酵母)和Sporobolomyces(掷孢酵母)菌株有大于99％的同源性，显然，菌株AY2-19不是一株酵母菌，其菌落和分生孢子形态符合镰刀菌的特征，它的rDNA-ITS与一株禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，Accession No.ON705448)的rDNA-ITS序列有99.45％的同源性，所以可以确定菌株AY2-19的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，盘菌亚门(Pezizomycotina)，粪壳菌纲(Sordariomycetes)，肉座菌亚纲(Hypocreomycetidae)，肉座菌目(Hypocreales)，丛赤壳科(Nectriaceae)，镰刀菌属(Fusarium)，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。

所述菌株AY2-19的rDNA-ITS核苷酸序列为：

GTACATTTAACTTGGAACCCAAACTTCTCAATTCTAACTTTGTGCATCTGTATTAATGGCGAGCAACTTCGGTTGTGAGCCTTCACTTACAAAACACTAGTCTATGAATGTAAAATTTTTATAACAAATAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCATCTTGCGCTCTCTGGTATTCCGGAGAGCATGTCTGTTTGAGTGTCATGAATTCTTCAACCCAATCTTTTCTTGTAATCGATTGGTGTTTGGATTCTGAGCGTTGCTGGCGTTTGCCTAGCTCGTTCGTAATACATTAGCATCCCTAATACAAGTTTGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTAAGGATTCGGTGGAAACATCGAGCCAACTTCATTAAGGAAGCTCCTAATTTAAAAGTCTACCTTTTGATTAGATCTCAAATCAGGCAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA。

综上，从艾叶粉微生物富集物中分离到菌株AY2，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株AY2-19，即禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2-19，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63062，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

实施例4：利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶多糖的应用

利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶多糖，可以按以下步骤操作：

(1)冻干管保存的禾谷镰刀菌AY2-19孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃培养72h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得禾谷镰刀菌AY2-19的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液3mL接种100mL产酶培养基(接种量为3％的体积分数)，于30℃、180r/min振荡条件下培养72h，得干菌体浓度为3.68g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为36.3U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，250-mL三角烧瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)5g艾叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液50mL[料酶比为1:10(g:mL)]，搅拌均匀后于30℃水浴中酶解4h，得艾叶酶解物。

(4)步骤(3)全部艾叶酶解物中，补充150mL去离子水[提取体系含水200mL，料液比为1:40(g:mL)]，搅拌均匀后于85℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原体积的1/20)，获得水提浓缩液。

(5)向步骤(4)获得的全部浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，体系乙醇体积分数为80％)充分振荡后，于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入10mL无水乙醇(原料艾叶粉质量的2mL/g)，振荡后再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得艾叶多糖提取物。

按上述步骤，得艾叶多糖提取物0.637g，多糖含量为24.6％，即得到多糖0.157g，提取得率为3.14％。

对比例1：未经酶解的艾叶多糖提取(与实施例4对比)

(1)5g艾叶粉于250-mL三角烧瓶中，加入200mL去离子水[体系料液比为1:40(g:mL)]，搅拌均匀后于85℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原体积的1/20)，获得水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，体系乙醇体积分数为80％)充分振荡后，于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入10mL无水乙醇(原料艾叶粉质量的2mL/g)，振荡后再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得艾叶多糖提取物。

按上述步骤，得艾叶多糖提取物0.542g，多糖含量为20.2％，即得到多糖0.109g，提取得率为2.18％。

比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在提取艾叶多糖前，增加了禾谷镰刀菌AY2-19发酵制备的粗酶液酶解，多糖的提取得率由2.18％提高到3.14％，提高了44.0％。

实施例5：利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶多糖的应用

(1)4℃保存的禾谷镰刀菌AY2-19 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃培养68h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得禾谷镰刀菌AY2-19的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液4mL接种100mL产酶培养基(接种量为4％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养68h，得干菌体浓度为3.77g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为34.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。

(3)10g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液60mL[料酶比为1:6(g:mL)]，搅拌均匀后于28℃水浴中酶解5h，得艾叶酶解物。

(4)步骤(3)全部艾叶酶解物中，补充290mL去离子水[提取体系含水350mL，料液比为1:35(g:mL)]，搅拌均匀后于90℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取75min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至14mL(原体积的1/25)，获得水提浓缩液。

(5)向步骤(4)获得的全部浓缩液中，加入42mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，体系乙醇体积分数为75％)充分振荡后，于4℃条件下静置14h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入10mL无水乙醇(原料艾叶粉质量的1mL/g)，振荡后再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得艾叶多糖提取物。

按上述步骤，得艾叶多糖提取物1.21g，多糖含量为25.8％，即得到多糖0.312g，提取得率为3.12％。

对比例2：未经酶解的艾叶多糖提取(与实施例5对比)

(1)10g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入350mL去离子水[体系料液比为1:35(g:mL)]，搅拌均匀后于90℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取75min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至14mL(原体积的1/25)，获得水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入42mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，体系乙醇体积分数为75％)充分振荡后，于4℃条件下静置14h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入10mL无水乙醇(原料艾叶粉质量的1mL/g)，振荡后再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得艾叶多糖提取物。

按上述步骤，得艾叶多糖提取物1.03g，多糖含量为21.5％，即得到多糖0.221g，提取得率为2.21％。

比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在提取艾叶多糖前，增加了禾谷镰刀菌AY2-19发酵制备的粗酶液酶解，多糖的提取得率由2.21％提高到3.12％，提高了41.2％。

实施例6：利用禾谷镰刀菌AY2-19酶解辅助提取艾叶多糖的应用

(1)4℃保存的禾谷镰刀菌AY2-19 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于28℃培养64h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得禾谷镰刀菌AY2-19的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。

(2)用步骤(1)制备的孢子液7.5mL接种150mL产酶培养基(接种量为5％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养64h，得干菌体浓度为3.64g/L的发酵液。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为35.2U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成同实施例1，500-mL三角烧瓶装150mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)25g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)制备的粗酶液100mL(体系料酶比为1:4)，搅拌均匀后于26℃水浴中酶解6h，得艾叶酶解物。

(4)步骤(3)全部艾叶酶解物中，补充650mL去离子水[提取体系含水750mL，料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀后于90℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取90min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至30mL(原体积的1/25)，获得水提浓缩液。

(5)向步骤(4)获得的全部浓缩液中，加入90mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，体系乙醇体积分数为75％)充分振荡后，于4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入15mL无水乙醇(原料艾叶粉质量的0.6mL/g)，振荡后再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得艾叶多糖提取物。

按上述步骤，得艾叶多糖提取物2.99g，多糖含量为26.0％，即得到多糖0.777g，提取得率为3.11％。

对比例3：未经酶解的艾叶多糖提取(与实施例6对比)

(1)25g艾叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入750mL去离子水[体系料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀后于90℃的超声波清洗机中，功率150W超声提取90min，布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至30mL(原体积的1/25)，获得水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入90mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，体系乙醇体积分数为75％)充分振荡后，于4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入15mL无水乙醇(原料艾叶粉质量的0.6mL/g)，振荡后再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得艾叶多糖提取物。

按上述步骤，得艾叶多糖提取物2.54g，多糖含量为21.7％，即得到多糖0.551g，提取得率为2.20％。

比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在提取艾叶多糖前，增加了禾谷镰刀菌AY2-19发酵制备的粗酶液酶解，多糖的提取得率由2.20％提高到3.11％，提高了41.4％。

Claims

1.一种利用微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法，其特征在于，所述方法为：(1)微生物菌株禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)AY2-19孢子接种于产酶培养基中，于30℃、180–200r/min振荡培养64–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：小麦麸皮40–50g/L，蛋白胨8–10g/L，NaNO₃ 5–6g/L，KH₂PO₄ 1–2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25–0.5g/L，CaCl₂ 0.4–0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5；所述的禾谷镰刀菌AY2-19，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63062，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)将粗酶液与艾叶粉混合，于26–30℃条件下酶解4–6h，得艾叶酶解物；(3)艾叶酶解物中补充去离子水，经85–90℃下超声提取，滤液浓缩后，获得艾叶水提浓缩液；(4)向艾叶水提浓缩液加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得艾叶多糖提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的产酶培养基组成为：小麦麸皮50g/L，蛋白胨10g/L，NaNO₃ 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，CaCl₂ 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述禾谷镰刀菌AY2-19在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得禾谷镰刀菌AY2-19孢子液，按体积分数3％–5％的量接入产酶培养基进行培养；所述禾谷镰刀菌AY2-19孢子培养方法为：将禾谷镰刀菌AY2-19接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基，于28℃培养64–72h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得禾谷镰刀菌AY2-19孢子液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中艾叶粉是新鲜艾叶经自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中粗酶液体积用量以艾叶粉质量计为4–10mL/g。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中超声提取的条件是：往艾叶酶解物中补充去离子水，搅拌均匀后于水温85–90℃的超声波清洗机中，150W超声提取60–90min。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中艾叶酶解物经超声提取的滤液浓缩的条件为：滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至原体积的1/25–1/20，获得艾叶水提浓缩液。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)艾叶多糖提取物的制备方法为：向艾叶水提浓缩液中加入无水乙醇，使溶液的乙醇体积分数达到75％–80％，4℃条件下静置12–16h后，8000r/min离心5–10min，弃去上清液，加入原料艾叶粉质量计0.6–2mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得艾叶多糖提取物。