CN116041561B - 一种利用微生物发酵辅助提取荷叶多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用微生物发酵辅助提取荷叶多糖的方法，在从荷叶中提取多糖前，增加了微生物发酵预处理，所用的微生物菌株黑曲霉HY4‑25，是针对能够水解荷叶细胞壁而有目的筛选得到，它在添加蔗糖的荷叶粉中适度生长，产生多种水解酶。之后，荷叶粉加水保温酶解，细胞壁中的纤维素、半纤维素和木质素等物质被水解，有助于荷叶可溶性多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，荷叶多糖的提取得率可以提高51.8％。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖的方法。
(二)背景技术
荷叶是科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的叶。莲又称莲花、荷花等，生长在池塘和湖泊中，我国大部分地区均有分布，主产于湖南、浙江、江苏等地。长期以来，荷叶在食用及药用两方面均有广泛的应用。历版《中华人民共和国药典》一部中的药材和饮片均收载了荷叶，其性味苦平，归肝、脾、胃经，具清暑化湿，升发清阳，凉血止血的功能，主治暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚泄泻，血热吐衄，便血崩漏等。荷叶因含多种活性成分而具显著的食疗功效。荷叶中除了含有普通植物所共有的碳水化合物、脂类、蛋白质、单宁等常规化学成分外，还含有丰富的黄酮、多糖和生物碱。荷叶多糖具有突出的生物活性，在增强免疫功效、抑制肿瘤、抗病毒、降低血糖、改善脂肪代谢等方面有显著功能。我国的荷叶资源非常丰富，从荷叶中提取多糖，可以提高农业种植莲藕的经济效率。
从植物中提取多糖的基本方法都是热水提取乙醇沉淀法(简称为“水提醇沉法”)，在此基础之上，有用微波、超声波、高压和酶解等辅助提取。不同提取方法有各自的优缺点，如常规的水提醇沉法操作简单，但存在提取得率低、耗时长等缺点；微波辅助提取法提取时间短、效率高，但多糖的活性有所下降；超声辅助提取法设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够显著；酶解辅助提取法能够显著提高提取得率，而且条件温和，提取的多糖活性好，缺点是增加了酶的使用成本，提取过程耗时长。
近年来，酶解技术在植物活性成分的提取中有广泛应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等，在适宜的条件下水解植物原料，植物的细胞壁被水解，从而有利于胞内活性成分在提取时溶出。酶解技术应用于荷叶多糖的提取也有报道，如刘军波等利用纤维素酶辅助水提法提取荷叶多糖，得率达到9.66％(未醇沉分析)[刘军波,邹礼根,赵芸. 酶辅助提取荷叶多糖的工艺研究.食品研究与开发,2013,34(24):74-76.]。目前应用在植物活性成分提取中最多的酶是纤维素酶，植物的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等物质，单一使用纤维素酶，对提高产物提取得率非常有限。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶。使用复合酶虽然可以有效地提高产物提取得率，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。
微生物产生酶的能力非常强大，特别是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。所以，如果利用某种微生物，直接发酵植物原料，菌体在生长过程中产生的各种水解酶，可以协同分解细胞壁成分，从而有利于细胞中的有效成分释放，提取得率便可以显著提高。
为了提高荷叶多糖的提取得率，本发明对常规的水提醇沉法提取方法进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，可使荷叶多糖的提取得率大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种利用微生物发酵辅助提取荷叶多糖的方法，所述微生物发酵辅助，即采用一株新的微生物菌株—黑曲霉(Aspergillus niger)HY4-25对荷叶发酵预处理，荷叶多糖的提取得率可以显著提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种利用微生物发酵辅助提取荷叶多糖的方法，所述方法为：荷叶粉中加入黑曲霉HY4-25的孢子液，搅拌均匀后于30℃发酵60–72h，获得荷叶发酵物；荷叶发酵物中加入去离子水，振荡均匀后于35–40℃保温3–4h，经超声水提后浓缩，获得荷叶水提浓缩物；再将浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得荷叶多糖。
进一步，所述的黑曲霉(Aspergillus niger)HY4-25，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62851，保藏日期2022年9月25日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
进一步，所述荷叶粉是将新鲜荷叶85℃烘干粉碎后，过40目筛获得细粉。
进一步，所述黑曲霉HY4-25孢子液的制备方法为：低温保藏的黑曲霉HY4-25孢子接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板培养基上，于28–30℃恒温培养48–60h后，加浓度为40–50g/L的无菌蔗糖水溶液于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1×107–2×107个/mL。所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5左右)。
进一步，所述黑曲霉HY4-25的孢子液体积用量以荷叶粉质量计为1.5–2.0mL/g。
进一步，所述荷叶水提浓缩物的制备方法为：荷叶发酵物加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温3–4h，然后转入水温75–80℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取30–60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0–10.0，布氏漏斗抽滤，收集的滤液用乙酸调节pH至4.0–5.0，再次布氏漏斗抽滤，滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/10–1/12，获得荷叶水提浓缩物；所述荷叶发酵物中去离子水体积加入量以原料荷叶粉质量计为20–25mL/g，即料液比(g:mL)为1:20–1:25。
进一步，所述荷叶多糖的制备方法为：向荷叶水提浓缩物中加入其体积3–4倍的无水乙醇，使总溶液的乙醇体积分数达到75％–80％，4℃条件下静置14–16h后，8000r/min 离心5–10min，弃去上清液，加入原料荷叶粉质量计2–5mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得荷叶多糖提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在从荷叶中提取多糖前，增加了微生物发酵预处理，所用的微生物菌株黑曲霉HY4-25，是针对能够水解荷叶细胞壁而有目的筛选得到，它在添加蔗糖的荷叶粉中适度生长，产生多种水解酶。之后，荷叶粉加水保温酶解，细胞壁中的纤维素、半纤维素和木质素等物质被水解，有助于荷叶可溶性多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，荷叶多糖的提取得率可以提高51.8％。
(四)附图说明
图1为黑曲霉HY4-25在PDA上28℃培养48h的菌落照片。
图2为苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。
图3为DNS法测定葡萄糖的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明所述的荷叶是莲科植物莲(Nelumbo nucifera Gaertn.)的叶，产地浙江省德清县。荷叶粉是新鲜成熟荷叶经85℃烘干后粉碎，过40目筛的细粉。
实施例1：发酵荷叶的微生物菌株分离和筛选
发酵荷叶的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)250-mL三角烧瓶中加入10g的荷叶粉，加入20mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃培养60h，得纯培养菌株9株，各菌株的编号见表1。
(2)9个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌蔗糖水溶液，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整不同菌株的孢子浓度在1.0×107–2.0×107个/mL之间，获得各菌株的孢子液。所述的无菌蔗糖水溶液是浓度为40g/L的蔗糖水溶液，经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(3)9只经160℃、2h干热灭菌的100-mL三角瓶中，分别加入10g荷叶粉，再分别加入20mL的步骤(2)制备的各霉菌孢子液(以荷叶粉质量计的2.0mL/g)，搅拌均匀后，三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养60h，获得荷叶发酵物。
(4)取步骤(3)经各菌株发酵的荷叶发酵物总重量的1/10(相当于1g原料荷叶粉)，于50-mL离心管中，各加入25mL去离子水(料液比为1:25)，振荡均匀于35℃水浴中保温4h，然后转入75℃的超声波清洗机中，200W超声提取30min，再用饱和 Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至5.0，再次布氏漏斗抽滤。取1mL滤液于试管中，再加入3mL的无水乙醇(溶液的乙醇体积分数为 75％)，充分振荡后于4℃条件下静置14h后，8000r/min离心5min，弃上清液，加5mL 的无水乙醇洗涤一次，再次离心后弃去上清液，加5mL去离子水溶解沉淀物，采用苯酚-硫酸法测定溶液中可溶性多糖含量。
从步骤(3)开始，10g荷叶粉中加入20mL无菌蔗糖水溶液(40g/L)的处理做空白发酵对照。按步骤(4)方法，1g荷叶粉加入30mL含纤维素酶(活力为2000U/mL) 的磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)，做纤维素酶法提取对照；1g荷叶粉加入30mL 去离子水，做未发酵的对照。经不同菌株发酵的荷叶以及对照的多糖提取得率见表1。
表1经不同菌株发酵的荷叶以及对照的多糖提取得率
由表1数据可以看出，加入无菌蔗糖水溶液的空白发酵对照，以及多数菌株的发酵，荷叶多糖的提取得率并未显著提高，甚至有所下降，如HY3和HY8菌株，说明用于发酵荷叶以提高多糖提取得率的微生物菌株有种属的选择性。用纤维素酶酶解荷叶，也能提高多糖的提取得率，较未经发酵的对照提高了9.21％，但远不如HY4菌株的发酵。荷叶经HY4菌株发酵后，多糖提取得率为6.57％，较未经发酵对照的5.54％相比，提高了 18.6％，本发明选定HY4菌株作为提高荷叶多糖提取得率的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：新鲜马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，摇匀后装入三角瓶中，8层纱布扎口，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的荷叶多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：荷叶多糖提取液用去离子水做适当倍数稀释(估算样品中多糖的浓度在标准曲线测定范围内)；固体多糖样品配制成质量浓度0.1mg/mL的溶液。吸取待测样品溶液1mL于试管中，加1mL的体积分数5％苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后室温放置 10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以1mL去离子水作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同葡萄糖质量浓度样品的A490，绘制葡萄糖质量浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定荷叶多糖样品中多糖含量。
所述的荷叶多糖提取得率按以下公式计算：
实施例2：发酵菌株HY4的诱变选育
对菌株HY4进行诱变育种，筛选发酵性能更加优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株HY4经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.46×107个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.0mL上述孢子液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养36h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得38个菌株。各个菌株经28℃培养60h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL 无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2 mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的菌株10株，再按实施例1方法，用这10个菌株的孢子液接种荷叶粉发酵，超声水提醇沉法提取多糖，测定提取液中的多糖含量。复筛的突变菌株发酵荷叶多糖提取得率见表2。
表2复筛的突变菌株发酵荷叶后多糖提取得率
从表2数据可以看出，在复筛的10个菌株中，编号为HY4-25的菌株，产纤维素酶的活力为122U/mL，较野生菌株HY4的82.7U/mL提高了47.5％，用该菌株发酵荷叶粉后，多糖提取得率为8.34％，较野生菌株HY4的6.57％提高了26.9％，较未经发酵对照的5.54％提高了50.5％。
所述的产酶培养基组成为：小麦麸皮40g/L，(NH4)2SO45 g/L，蛋白胨4g/L，KH2PO43g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g，溶剂为自来水，pH 6.0。。 250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的质量浓度为1％羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，摇匀，用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长 540nm处吸光度(A540)，由葡萄糖标准曲线(图3)计算样品中的葡萄糖浓度，再计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
纤维素酶活力按以下公式(1)计算。
公式(1)中，C：由标准曲线计算得的葡萄糖浓度(mg/mL)；V1：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V2：粗酶液体积，即0.5mL。
葡萄糖标准曲线的绘制：6支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL。混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，摇匀，于分光光度计测定A540，以葡萄糖浓度为横坐标，A540为纵坐标绘制标准曲线(图3)。
DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。
实施例3：菌株HY4-25的分类鉴定
菌株HY4-25划线接种在PDA平板培养基上，28℃培养48h后，菌落正面为黑色，表面有大量黑色颗粒，反面黄褐色，无渗出液，培养基中无可溶性色素；分生孢子梗发生于基质，直径为7.0–15μm；顶囊近球形，直径为50–70μm；顶囊周围着生双层分生孢子小梗，长短不一，外层小梗上产生分生孢子；分生孢子褐色球形，直径2.5–4.0μm，表面粗糙。黑曲霉HY4-25在PDA平板培养基上28℃培养48h的菌落照片见图1。
测得菌株HY4-25的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行 BLAST比对，与典型菌株黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16888、臭曲霉(Aspergillus foetidus)CBS 121.28和万岁兰曲霉(Aspergillus welwitschiae)CBS139.54的rDNA-ITS 序列均有100％的同源性。但菌株HY4-25菌落形态特征更加符合黑曲霉的特征，所以确定菌株HY4-25的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲 (Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科 (Aspergillaceae)，曲霉属(Aspergillus)，黑曲霉(Aspergillus niger)。
所述的ITS区rDNA序列为：
CCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCG
GCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAAC
ACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAA
CTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGA
TAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGC
GCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCC
CGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCA
GCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAG
GATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATAC。
综上，从荷叶粉微生物富集物中分离到菌株HY4，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株HY4-25，即黑曲霉(Aspergillus niger)HY4-25，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62851，保藏日期2022年9月25日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖的应用
利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖，可以按以下步骤操作：
(1)冷冻干燥保存的黑曲霉HY4-25孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基上，于 30℃恒温培养60h。加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1.85×107个/mL，得黑曲霉HY4-25孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液是浓度为40g/L的蔗糖水溶液，经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(2)10g荷叶粉置于经160℃、2h干热灭菌的100-mL三角瓶中，再加入20mL 步骤(1)制备的黑曲霉HY4-25孢子液(以荷叶粉质量计的2.0mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养60h，获得荷叶发酵物。
(3)步骤(2)的全部荷叶发酵物转入500-mL的三角瓶中，加250mL的去离子水(料液比为1:25)，振荡均匀后，置于35℃水浴中保温4h。之后，三角瓶转入水温 75℃的超声波清洗机中，200W超声提取30min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至 9.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至5.0，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至25mL，获得荷叶水提浓缩物。
(4)向步骤(3)获得的全部荷叶水提浓缩物中，加入75mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，溶液的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置14h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入20mL的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa 真空干燥至恒重，研磨成细粉，得荷叶多糖提取物。
按上述步骤，从10g荷叶中提取获得1.53g多糖提取物，多糖含量为54.4％，即得到荷叶多糖0.832g，提取得率为8.32％，产品为灰绿色粉状物。
对比例1：常规水提醇沉法提取荷叶多糖(与实施例4对比)
(1)10g荷叶粉于500-mL的三角瓶中，加250mL的去离子水(料液比为1:25)，振荡均匀后，置于35℃水浴中保温4h。之后，三角瓶转入水温75℃的超声波清洗机中， 200W超声提取30min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至5.0，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至25mL，获得荷叶水提浓缩物。
(2)向步骤(1)获得的全部荷叶水提浓缩物中，加入75mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，溶液的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置14h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入20mL的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa 真空干燥至恒重，研磨成细粉，得荷叶多糖提取物。
按上述步骤，从10g荷叶中提取获得1.06g多糖提取物，多糖含量为52.7％，即得到荷叶多糖0.559g，提取得率为5.59％，产品为灰绿色粉状物。
比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在荷叶超声水提多糖前，增加了黑曲霉HY4-25发酵预处理，多糖的提取得率达到了8.32％，较不采用发酵预处理的常规方法提取的5.59％提高了48.8％。
实施例5：利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖的应用
利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的黑曲霉HY4-25的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养54h，加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1.73×107个/mL，得黑曲霉HY4-25孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液是浓度为45g/L的蔗糖水溶液，经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(2)25g荷叶粉置于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入40mL 步骤(1)制备的黑曲霉HY4-25孢子液(以荷叶粉质量计的1.6mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养66h，获得荷叶发酵物。
(3)步骤(2)的全部荷叶发酵物转入1-L的三角瓶中，加600mL的去离子水(料液比为1:24)，振荡均匀后，置于40℃水浴中保温3.5h。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，150W超声提取45min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.5，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至4.5，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至50mL，获得荷叶水提浓缩物。
(4)向步骤(3)获得的全部荷叶水提浓缩物中，加入200mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，溶液的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置15h后，8000r/min离心10 min，弃去上清液，加入50mL的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa 真空干燥至恒重，研磨成细粉，得荷叶多糖提取物。
按上述步骤，从25g荷叶中提取获得3.83g多糖提取物，多糖含量为55.2％，即得到荷叶多糖2.11g，提取得率为8.44％，产品为灰绿色粉状物。
对比例2：常规水提醇沉法提取荷叶多糖(与实施例5对比)
(1)25g荷叶粉于1-L的三角瓶中，加600mL的去离子水(料液比为1:24)，振荡均匀后，置于40℃水浴中保温3h。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中， 150W超声提取45min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.5，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至4.5，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至50mL，获得荷叶水提浓缩物。
(2)向步骤(1)获得的全部荷叶水提浓缩物中，加入200mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，溶液的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置15h后，8000r/min离心10 min，弃去上清液，加入50mL的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa 真空干燥至恒重，研磨成细粉，得荷叶多糖提取物。
按上述步骤，从25g荷叶中提取获得2.59g多糖提取物，多糖含量为53.5％，即得到荷叶多糖1.39g，提取得率为5.56％，产品为灰绿色粉状物。
比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在荷叶超声水提多糖前，增加了黑曲霉HY4-25发酵预处理，多糖的提取得率达到了8.44％，较不采用发酵预处理的常规方法提取的5.56％提高了51.8％。
实施例6：利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖的应用
利用黑曲霉HY4-25发酵辅助提取荷叶多糖，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的黑曲霉HY4-25的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养48h，加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1.53×107个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液是浓度为 50g/L的蔗糖水溶液，经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(2)50g荷叶粉置于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，在加入75mL 步骤(1)制备的黑曲霉HY4-25孢子液(以荷叶粉质量计的1.5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养72h，获得荷叶发酵物。
(3)步骤(2)的全部荷叶发酵物按重量平均分配到2只1-L的三角瓶中，各加500 mL的去离子水(料液比为1:20)，振荡均匀后，置于40℃水浴中保温3h。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至10.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至4.0，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至100mL，获得荷叶水提浓缩物。
(4)向步骤(3)获得的全部荷叶水提浓缩物中，加入400mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，溶液的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10 min，弃去上清液，加入100mL的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1 Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得荷叶多糖提取物。
按上述步骤，从50g荷叶中提取获得7.66g多糖提取物，多糖含量为54.1％，即得到荷叶多糖4.14g，提取得率为8.28％，产品为灰绿色粉状物。
对比例3：常规水提醇沉法提取荷叶多糖(与实施例6对比)
(1)2只1-L的三角瓶中，各加25g的荷叶粉和500mL的去离子水(料液比为 1:20)，振荡均匀后，置于40℃水浴中保温2h。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至10.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至4.0，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1 Mpa条件下减压浓缩至100mL，获得荷叶水提浓缩物。
(2)向步骤(1)获得的全部荷叶水提浓缩物中，加入400mL的无水乙醇(溶4 倍浓缩液体积，液的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10 min，弃去上清液，加入100mL的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1 Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得荷叶多糖提取物。
按上述步骤，从50g荷叶中提取获得5.22g多糖提取物，多糖含量为52.6％，即得到荷叶多糖2.75g，提取得率为5.50％，产品为灰绿色粉状物。
比较实施例6和对比例1的结果可以看出：在荷叶超声水提多糖前，增加了黑曲霉HY4-25发酵预处理，多糖的提取得率达到了8.28％，较不采用发酵预处理的常规方法提取的5.50％提高了50.5％。
Claims (7)
1.一种利用微生物发酵辅助提取荷叶多糖的方法，其特征在于，所述方法为：荷叶粉中加入黑曲霉(Aspergillus niger)HY4-25的孢子液，搅拌均匀后于30℃发酵60–72h，获得荷叶发酵物；荷叶发酵物中加入去离子水，振荡均匀后于35–40℃保温3–4h，经超声水提后浓缩，获得荷叶水提浓缩物；再将浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得荷叶多糖；
所述的黑曲霉HY4-25，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62851，保藏日期2022年9月25日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；
所述黑曲霉HY4-25孢子液的制备方法为：低温保藏的黑曲霉HY4-25孢子接种于PDA平板培养基上，于28–30℃恒温培养48–60h后，加浓度为40-50g/L的无菌蔗糖水溶液于黑曲霉HY4-25平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液，将孢子液用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为1×107–2×107个/mL；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荷叶粉是将新鲜荷叶85℃烘干粉碎后，过40目筛获得细粉。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉HY4-25的孢子液体积用量以荷叶粉质量计为1.5–2.0mL/g。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荷叶水提浓缩物的制备方法为：荷叶发酵物加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温3–4h，然后转入水温75–80℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取30–60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0–10.0，布氏漏斗抽滤，收集的滤液用乙酸调节pH至4.0–5.0，再次布氏漏斗抽滤，滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/10–1/12，获得荷叶水提浓缩物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荷叶发酵物中去离子水体积加入量以原料荷叶粉质量计为20–25mL/g。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荷叶多糖的制备方法为：向荷叶水提浓缩物中加入无水乙醇，4℃条件下静置14–16h后，8000r/min离心5–10min，弃去上清液，加入无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得荷叶多糖提取物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述加入荷叶水提浓缩物中的无水乙醇是其体积的3–4倍，使溶液的乙醇体积分数达到75％–80％；洗涤用无水乙醇体积用量以原料荷叶粉质量计为2–5mL/g。
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