CN116042407A - 少根根霉as7-34及其在提取当归多糖中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种少根根霉AS7‑34及其在提取当归多糖中的应用，少根根霉(Rhizopus arrhizus)AS7‑34，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62601，保藏日期2022年7月6日。本发明在从当归中提取多糖前，增加了微生物菌株少根根霉AS7‑34发酵预处理，之后，当归粉加水保温酶解，细胞壁中的纤维素、半纤维素和木质素等物质被水解，有助于当归可溶性多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，当归多糖的提取得率可以提高43.7％。

Description

少根根霉AS7-34及其在提取当归多糖中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株少根根霉AS7-34及其在提取当归多糖中的应用。
(二)背景技术
中药材当归(Angelicae Sinensis Radix)是伞形科(Apiaceae)多年生草本植物当归(Angelica sinensis)的干燥根。当归是一味常用的传统中药，其性温，味甘、辛，具有补血、活血、调经止痛、润肠通便、扶正固本之功效。当归含有多种活性成分，包括藁本内酯、阿魏酸、当归多糖、查耳酮和倍半萜烯等。近年来的药理学研究表明，当归多糖具有丰富的生物活性，通过激活补体，对机体免疫系统、造血系统发挥作用，还具有抗肿瘤、抗放射性损伤和促进胃溃疡愈合等活性，中成药“归芪口服液”和“归芪颗粒”的主要成分之一就是当归多糖。因此，当归多糖在医疗和保健食品行业具有广阔的应用前景。
目前，关于当归多糖提取方法有较多研究报道，基本的方法都是热水提取乙醇沉淀法(简称为“水提醇沉法”)，在此基础之上，又有用微波、超声波、酶解等辅助提取。不同提取方法有各自的优缺点。例如，传统的水提醇沉法操作简单，但存在提取得率低、耗时长等缺点；微波辅助提取法提取时间短、效率高，但多糖的活性有所下降；超声辅助提取法设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够显著；酶解辅助提取法能够显著提高提取得率，且条件温和，提取的多糖活性好，缺点是增加了酶的使用成本，提取过程耗时长。
近年来，酶解技术应用于植物活性成分的提取得到广泛应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等，在适宜的条件下水解植物原料，使植物的细胞壁水解，从而有利于胞内活性成分在提取时释放。目前，纤维素酶是植物活性成分提取中应用最多的酶，植物的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，单一使用纤维素酶往往难以达到非常理想的效果。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶，虽然可以显著提高产物提取得率，但多种酶的使用无疑增加了提取成本。
微生物具有很强的产酶能力，特别是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。所以，如果利用某种微生物直接发酵植物原料，菌体在生长过程中产生的各种水解酶可以协同分解细胞壁成分，从而有利于细胞中的有效成分释放，提取得率便可以显著提高。
为了提高当归多糖的提取得率，本发明对传统的水提醇沉法提取方法进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，可大幅度提高归多糖的提取得率。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的微生物菌株—少根根霉(Rhizopus arrhizus)AS7-34及其在提取当归多糖中的应用，当归经该菌株发酵后，当归多糖的提取得率可以显著提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新的微生物菌株—少根根霉(Rhizopus arrhizus)AS7-34，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62601，保藏日期2022年7月6日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述少根根霉AS7-34，是从当归的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述少根根霉AS7-34的菌落形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基(PDA)上，28℃条件下培养，菌落初期为浅白色绒毛状，1天后逐渐变为灰色，接种线处长出的菌丝颜色较深，菌落表层有大量灰黑色孢子；匍匐菌丝和假根不发达，假根较短，指状；匍匐菌丝颜色较浅；孢子囊梗多数弯曲，很少单生，多形成伞状聚合，直接由菌丝长出而不与假根相对应；孢子囊球形或近球形、深棕灰色；孢囊孢子为椭圆形或多边形，表面有淡淡的条纹，直径4–7μm。少根根霉AS7-34在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1。
所述的少根根霉AS7-34的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述少根根霉AS7-34在提取当归多糖中的应用，所述应用的方法为：(1)当归粉中加入少根根霉AS7-34的孢子液，搅拌均匀后于28–30℃发酵60–72h，获得当归发酵物；(2)当归发酵物中加入去离子水，振荡均匀后于30–35℃保温4–6h，经超声水提后浓缩，获得当归水提浓缩物；(3)再将当归水提浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得当归多糖提取物。
进一步，步骤(1)所述当归粉是将中药材当归自然晾干或80℃烘干粉碎后过40目筛获得。
进一步，步骤(1)所述少根根霉AS7-34孢子液的制备方法为：低温保藏的少根根霉AS7-34孢子接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板培养基上，于28–30℃恒温培养48–60h后，向培养物中加入浓度为40–60g/L的无菌蔗糖水溶液，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为5×106–9×106个/mL。所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L(切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5左右)。
进一步，步骤(1)所述加入当归粉中少根根霉AS7-34的孢子液体积用量以当归粉质量计为1.0–1.6mL/g。
进一步，步骤(2)所述当归发酵物中去离子水体积加入量以步骤(1)原料当归粉质量计为15–20mL/g(即料液比1:15–1:20)。
进一步，步骤(2)所述当归水提浓缩物的制备方法为：当归发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃保温4–6h，然后转入水温80–85℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取40–60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0–10.0，布氏漏斗抽滤，收集的滤液用乙酸调节pH至4.0–5.0，再次布氏漏斗抽滤，滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至原体积的1/15–1/10，获得当归水提浓缩物；所述当归发酵物中去离子水体积加入量以原料当归粉质量计为15–20mL/g(即料液比1:15–1:20)。
进一步，步骤(3)所述当归多糖的制备方法为：向当归水提浓缩物中加入体积分数为95％的乙醇(以下简称“95％乙醇”)，使溶液的乙醇体积分数达到70％–75％，4℃条件下静置12–16h后，8000r/min离心5–10min，弃去上清液，加入原料当归粉质量计2mL/g的95％乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得当归多糖提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明在从当归中提取多糖前，增加了微生物发酵预处理，所用的微生物菌株少根根霉AS7-34，是针对能够水解当归植物细胞壁而有目的筛选得到，它在添加蔗糖的当归粉中适度生长，产生多种水解酶。之后，当归粉加水保温酶解，细胞壁中的纤维素、半纤维素和木质素等物质被水解，有助于当归可溶性多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，当归多糖的提取得率可以提高43.7％。
(四)附图说明
图1为少根根霉AS7-34的菌落形态照片。
图2为苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。
图3为对硝基苯酚浓度—A400标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所述的当归是伞形科(Apiaceae)多年生草本植物当归(Angelicasinensis)的干燥根；所述的当归粉是当归自然晾干或80℃烘干后，粉碎过40目筛的细粉。
实施例1：发酵当归微生物菌株的分离和筛选
(1)100-mL三角瓶中加入5g的当归粉，再加入5mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释至1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养60h，得纯培养菌株12株，各菌株的编号见表1。
(2)12个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL的40g/L无菌蔗糖水溶液，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用40g/L无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为5.0×106–9.0×106个/mL，即为各菌株的孢子液。所述的无菌蔗糖水溶液经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(3)12只经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶，分别加入10g当归粉，再分别加入10mL的步骤(2)制备的各霉菌孢子液，搅拌均匀后，三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养72h，获得当归发酵物。
(4)向步骤(3)经各菌株发酵的全部当归发酵物的三角瓶中，各加入150mL去离子水(原三角瓶中，料液比为1:15)，振荡均匀于30℃水浴中保温6h，然后转入80℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至5.0，再次布氏漏斗抽滤。取1mL滤液于试管中，再加入3mL的95％乙醇(溶液的乙醇体积分数为71.3％)，充分振荡后于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃上清液，加5mL去离子水溶解沉淀物，采用苯酚-硫酸法测定溶液中可溶性多糖含量。
同样条件下，10g当归粉中加入10mL的40g/L无菌蔗糖水溶液的处理做空白发酵对照；用150mL含纤维素酶(活力为1000U/mL)的磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)直接提取当归多糖，做纤维素酶法提取对照。经不同菌株发酵的当归以及对照的多糖提取得率见表1。
表1经不同菌株发酵的当归以及对照的多糖提取得率
Figure BDA0003839767120000051
由表1数据可以看出，加入10mL无菌蔗糖水溶液的空白发酵对照，以及多数菌株的发酵，当归多糖的提取得率并未显著提高，甚至有所下降，说明用于发酵当归以提高多糖提取得率的微生物菌株有种属的选择性。用纤维素酶水溶液提取当归多糖，也能提高多糖的提取得率，较未经酶解的对照提高了12.7％，但远不如AS7菌株的发酵。当归经AS7菌株发酵后，多糖提取得率为11.8％，较未经发酵对照的9.23％相比，提高了27.8％，本发明选定AS7菌株作为提高当归多糖提取得率的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L，溶剂为水，pH自然，按如下组成和方法配制：新鲜马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，摇匀后装入三角瓶中，8层纱布扎口，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的当归多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：待测样品为当归多糖提取液时，用去离子水做适当倍数稀释(测定的A490在0.2–0.8之间)；待测样品为固体多糖提取物时，配制成质量浓度0.1mg/mL的水溶液。吸取待测样品溶液1mL于试管中，加1mL的体积分数5％苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以1mL去离子水作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同质量浓度葡萄糖样品的A490，绘制葡萄糖质量浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定当归多糖样品中多糖含量。
所述的当归多糖提取得率按以下公式计算：
Figure BDA0003839767120000061
实施例2：发酵菌株AS7的诱变选育
对菌株AS7进行诱变育种，筛选发酵当归性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株AS7经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部放一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.33×106个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子悬液于直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0min。上述照射处理后的孢子液作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养36h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得52个菌株。各个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。吸取各菌株的孢子液2mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活力提高幅度较大的菌株15株，再按实施例1方法，用这15个菌株的孢子液接种当归粉发酵，超声水提醇沉法提取多糖，测定提取液中的多糖含量。复筛的突变菌株发酵当归的多糖提取得率见表2。
表2复筛的突变菌株发酵的当归多糖提取得率
Figure BDA0003839767120000071
从表2数据可以看出，在复筛的15个菌株中，编号为AS7-34的菌株，发酵产β-葡萄糖苷酶的活力为32.5U/mL，较野生菌株AS7的21.3U/mL提高了52.6％，用该菌株发酵当归后，多糖提取得率为13.7％，较野生菌株AS7的11.8％提高了16.1％，较未经发酵对照的9.23％提高了48.4％。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：麸皮30g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO45g/L，MgSO40.5 g/L，CaCl2 0.2g/L，FeSO4 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8mL、5mmol/L的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)0.2mL(pH 6.0、0.2mol/L的磷酸缓冲液配制)，于35℃下反应15min后，加入2mL的1mol/L Na2CO3溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于400nm波长下测定吸光度(A400)。由对硝基苯酚(pNP)浓度—A400标准曲线(图3)计算出反应体系中pNP浓度。
β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：35℃下、pH 6.0缓冲体系中，l min内水解pNPG生成1μmol的pNP的酶量为1个酶活力单位。
β-葡萄糖苷酶活力的活力按以下公式(1)计算：
Figure BDA0003839767120000081
式(1)中，V1：反应体系总体积；C1：pNP浓度；V2：粗酶液体积；T：反应时间。
对硝基苯酚浓度—A400标准曲线的制作：用去离子水配制浓度为1mmol/L的pNP标准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL至l0 mL容量瓶中，用l mol/LNa2CO3溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度分别为10、20、30、40、50μmol/L。以去离子水为空白，测定在400nm波长处的吸光值，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A400为纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—A400标准曲线(图3)。
实施例3：菌株AS7-34的分类鉴定
菌株AS7-34划线接种在PDA平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为浅白色绒毛状，1天后逐渐变为灰色，接种线处长出的菌丝颜色较深，菌落表层有大量灰黑色孢子；匍匐菌丝和假根不发达，假根较短，指状；匍匐菌丝颜色较浅；孢子囊梗多数弯曲，很少单生，多形成伞状聚合，直接由菌丝长出而不与假根相对应；孢子囊球形或近球形、深棕灰色；孢囊孢子为椭圆形或多边形，表面有淡淡的条纹，直径4–7μm。少根根霉AS7-34在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1。
测得菌株AS7-34的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与已知的少根根霉(Rhizopus arrhizus)典型菌株CBS112.07的rDNA-ITS序列有100％的同源性。根据菌株AS7-34菌落形态特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株AS7-34的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，毛霉门(Mucoromycota)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，根霉属(Rhizopus)，少根根霉(Rhizopus arrhizus)。
所述的rDNA-ITS序列为：
GGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGTACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTGATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTTTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGTAACTTTCAAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTA。
综上，从当归粉的微生物富集物中分离的菌株AS7，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株AS7-34，即少根根霉(Rhizopus arrhizus)AS7-34，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62601，保藏日期2022年7月6日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：少根根霉AS7-34应用于当归多糖的提取
少根根霉AS7-34应用于当归多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)冷冻干燥保存的少根根霉AS7-34孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养60h。加10mL的40g/L无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用40g/L无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为6.80×106个/mL，得少根根霉AS7-34孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(2)25g当归粉置于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入25mL步骤(1)制备的少根根霉AS7-34孢子液，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养72h，获得当归发酵物。
(3)步骤(2)的全部当归发酵物转入1-L的三角瓶中，加400mL的去离子水(料液比为1:16)，振荡均匀后，置于30℃水浴中保温6h。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，100W超声提取60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至5.0，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至40mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入112mL的95％乙醇(溶液的乙醇体积分数为70％)，4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入50mL的95％乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得当归多糖提取物。
按上述步骤，从25g当归中提取获得5.32g当归多糖提取物，多糖含量为61.8％，即得到当归多糖3.29g，提取得率为13.2％，产品为灰白色粉状物。
实施例5：少根根霉AS7-34应用于当归多糖的提取
少根根霉AS7-34应用于当归多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的少根根霉AS7-34的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养54h，加10mL的50g/L无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用50g/L无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为8.35×106个/mL，得少根根霉AS7-34孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(2)25g当归粉置于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入30mL步骤(1)制备的少根根霉AS7-34孢子液，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养66h，获得当归发酵物。
(3)步骤(2)的全部当归发酵物转入1-L的三角瓶中，加450mL的去离子水(料液比为1:18)，振荡均匀后，置于32.5℃水浴中保温5h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，150W超声提取50min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.5，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至4.5，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至40mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入150mL的95％乙醇(溶液的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置14h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入50mL的95％乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得当归多糖提取物。
按上述步骤，从25g当归中提取获得5.49g多糖提取物，多糖含量为63.2％，即得到当归多糖3.47g，提取得率为13.9％，产品为灰白色粉状物。
实施例6：少根根霉AS7-34应用于当归多糖的提取
少根根霉AS7-34应用于当归多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的少根根霉AS7-34的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养48h，加10mL的60g/L无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌60g/L蔗糖水溶液调整孢子浓度为7.85×106个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液经高压蒸汽121℃灭菌15min。
(2)25g当归粉置于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，在加入40mL步骤(1)制备的少根根霉AS7-34孢子液，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养60h，获得当归发酵物。
(3)步骤(2)的全部当归发酵物转入1-L的三角瓶中，加500mL的去离子水(料液比为1:20)，振荡均匀后，置于35℃水浴中保温4h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，200W超声提取40min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至10.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至4.0，再次布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至40mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入150mL的95％乙醇(溶液的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入50mL的95％乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得当归多糖提取物。
按上述步骤，从25g当归中提取获得5.46g多糖提取物，多糖含量为67.6％，即得到当归多糖3.69g，提取得率为14.8％，产品为灰白色粉状物。
对比例1：常规水提醇沉法提取当归多糖
(1)25g当归粉于1-L的三角瓶中，加500mL的去离子水(料液比为1:20)，振荡均匀后，置于35℃水浴中保温4h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，200W超声提取40min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至10.0，趁热布氏漏斗抽滤，滤液用乙酸调节pH至5.0，将全部的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至40mL，获得浓缩液。
(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入150mL的95％乙醇(溶液的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入50mL的95％乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，研磨成细粉，得当归多糖提取物。
按上述步骤，从25g当归中提取获得4.15g多糖提取物，多糖含量为61.9％，即得到当归多糖2.57g，提取得率为10.3％。
比较实施例6和对比例1的结果可以看出：在当归超声水提多糖前，增加了少根根霉AS7-34发酵预处理，多糖的提取得率达到了14.8％，较不采用发酵预处理的常规方法提取的10.3％相比，提高了43.7％。

Claims (10)

1.少根根霉(Rhizopus arrhizus)AS7-34，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62601，保藏日期2022年7月6日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述少根根霉AS7-34在提取当归多糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：(1)当归粉中加入少根根霉AS7-34的孢子液，搅拌均匀后于28–30℃发酵60–72h，获得当归发酵物；(2)当归发酵物中加入去离子水，振荡均匀后于30–35℃保温4–6h，经超声水提后浓缩，获得当归水提浓缩物；(3)再将当归水提浓缩物加乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和干燥后，获得当归多糖提取物。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述当归粉是将中药材当归自然晾干或80℃烘干粉碎后过40目筛获得。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述少根根霉AS7-34孢子液的制备方法为：低温保藏的少根根霉AS7-34孢子接种于PDA平板培养基上，于28–30℃恒温培养48–60h后，向培养物中加入浓度为40–60g/L的无菌蔗糖水溶液，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述加入当归粉中少根根霉AS7-34的孢子液体积用量以当归粉质量计为1.0–1.6mL/g。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述当归发酵物中去离子水体积加入量以步骤(1)原料当归粉质量计为15–20mL/g。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)超声水提的方法为：在80–85℃的超声波清洗机中，100–200W超声提取40–60min，再用饱和Ca(OH)2水溶液调节pH至9.0–10.0，布氏漏斗抽滤，收集的滤液用乙酸调节pH至4.0–5.0，再次布氏漏斗抽滤，滤液浓缩。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，滤液浓缩条件为滤液于60℃、-0.1MPa条件下减压浓缩至原体积的1/15–1/10，获得当归水提浓缩物。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述当归多糖的制备方法为：向当归水提浓缩物中加入体积分数为95％的乙醇，使溶液的乙醇体积分数达到70％–75％，4℃条件下静置12–16h后，8000r/min离心5–10min，弃去上清液，加入体积分数95％乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、-0.1Mpa真空干燥至恒重，得当归多糖提取物。
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