CN116549507B - 一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法 - Google Patents
一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116549507B CN116549507B CN202310730884.5A CN202310730884A CN116549507B CN 116549507 B CN116549507 B CN 116549507B CN 202310730884 A CN202310730884 A CN 202310730884A CN 116549507 B CN116549507 B CN 116549507B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- kudzuvine root
- extract
- radix puerariae
- preparing
- microbial fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 title claims abstract description 39
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 235000010575 Pueraria lobata Nutrition 0.000 claims abstract description 98
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 77
- 241000235395 Mucor Species 0.000 claims abstract description 36
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 32
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 41
- 241000219781 Pueraria montana var. lobata Species 0.000 claims description 26
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 26
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 20
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 20
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 20
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 20
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 17
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 15
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 12
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 6
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 6
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 4
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 3
- 241001558145 Mucor sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000219780 Pueraria Species 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims 1
- 244000046146 Pueraria lobata Species 0.000 abstract description 72
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 abstract description 35
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 abstract description 35
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 abstract description 35
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 14
- 108010059892 Cellulase Proteins 0.000 abstract description 11
- 229940106157 cellulase Drugs 0.000 abstract description 11
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 abstract description 8
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 abstract description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 6
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 abstract description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 abstract description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 abstract description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 abstract description 4
- 229920002488 Hemicellulose Polymers 0.000 abstract description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229920001277 pectin Polymers 0.000 abstract description 3
- 239000001814 pectin Substances 0.000 abstract description 3
- 235000010987 pectin Nutrition 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 26
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 21
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- RXUWDKBZZLIASQ-UHFFFAOYSA-N Puerarin Natural products OCC1OC(Oc2c(O)cc(O)c3C(=O)C(=COc23)c4ccc(O)cc4)C(O)C(O)C1O RXUWDKBZZLIASQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- HKEAFJYKMMKDOR-VPRICQMDSA-N puerarin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1C1=C(O)C=CC(C2=O)=C1OC=C2C1=CC=C(O)C=C1 HKEAFJYKMMKDOR-VPRICQMDSA-N 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 4
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- GOMNOOKGLZYEJT-UHFFFAOYSA-N isoflavone Chemical compound C=1OC2=CC=CC=C2C(=O)C=1C1=CC=CC=C1 GOMNOOKGLZYEJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N isoflavone Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC(OC)=C1C1=COC2=C(C=CC(C)(C)O3)C3=C(OC)C=C2C1=O CJWQYWQDLBZGPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008696 isoflavones Nutrition 0.000 description 3
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 3
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 3
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 3
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 2
- 206010019133 Hangover Diseases 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010059820 Polygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 108010093305 exopolygalacturonase Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 2
- GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L sodium sulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])=O GEHJYWRUCIMESM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 241000220485 Fabaceae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241001149947 Mucor circinelloides f. lusitanicus Species 0.000 description 1
- 241001480490 Mucoraceae Species 0.000 description 1
- 241000235388 Mucorales Species 0.000 description 1
- 241000972273 Mucoromycota Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241001326562 Pezizomycotina Species 0.000 description 1
- 241000731396 Pueraria montana var. thomsonii Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 206010039424 Salivary hypersecretion Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000036528 appetite Effects 0.000 description 1
- 235000019789 appetite Nutrition 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000007910 chewable tablet Substances 0.000 description 1
- 229940068682 chewable tablet Drugs 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052564 epsomite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002481 ethanol extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 description 1
- 229930182486 flavonoid glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000007955 flavonoid glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 description 1
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 108010002430 hemicellulase Proteins 0.000 description 1
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 108010062085 ligninase Proteins 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000874 microwave-assisted extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 238000005325 percolation Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 206010036067 polydipsia Diseases 0.000 description 1
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000026451 salivation Diseases 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L sodium L-tartrate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O HELHAJAZNSDZJO-OLXYHTOASA-L 0.000 description 1
- 235000010265 sodium sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000001433 sodium tartrate Substances 0.000 description 1
- 229960002167 sodium tartrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011004 sodium tartrates Nutrition 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N sulfuric acid Substances OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
- A61K36/488—Pueraria (kudzu)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
- A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/30—Extraction of the material
- A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
- A61K2236/331—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using water, e.g. cold water, infusion, tea, steam distillation or decoction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
- C12R2001/785—Mucor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Mycology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Obesity (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
Abstract
本发明公开了一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法，在热水超声法制备葛根提取物前，增加了微生物发酵处理。所用的发酵菌株毛霉HY6‑19，是针对能够水解葛根细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。毛霉HY6‑19在葛根粉中适度生长，产生较高活性的纤维素酶以及其他多种水解酶，之后，经发酵的葛根粉加水保温，细胞壁中的纤维素、半纤维素和果胶等物质被酶解，有助于细胞壁中与纤维素结合的物质和胞内物质溶出，提取物得率显著提高，多糖含量也显著提高。本发明提供的微生物发酵法制备葛根提取物的方法，较直接采用热水超声提取法相比，葛根提取物得率可以提高25.9％，多糖含量增加14.6％。
Description
(一)技术领域
本发明属于生物技术在植物有效成分提取中的应用领域，具体涉及一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法。
(二)背景技术
葛根为豆科多年生藤本植物野葛(Pueraria lobata)或粉葛(Puerafiathomsanii)的干燥根。我国葛根资源极为丰富，目前发现有9个品种和2个变种，大部分省份都有分布，野葛主要分布于陕西、湖北、湖南、河南、安徽、广东、四川、浙江等地；粉葛作为栽培品种种植，主产于广西、广东、云南、四川等地。
葛根素有“亚洲人参”的美誉，是我国一道传统中药材，具有解肌、退热、生津、透疹、升阳止泻的功效，多用于治疗外感发热、头痛、项背牵强、消渴、热痢、麻疹不透、泄泻、高血压等症状。葛根富含多糖、异黄酮类、葛根素、皂苷、蛋白质和微量元素等成分，表现出多种生理活性，如降血压、降血糖、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等。1998年3月我国卫生部将野葛正式列入“既是食品又是药品”的目录之中。作为食品，葛根可用于提取食用淀粉，或提取葛根素、异黄酮或多糖等有效成分，用于食品或保健食品。
葛根倍受人们关注的另一个原因是它的解酒功能。葛根解酒的历史记载由来已久，早在唐代《千金要方》中就有记载：以鲜葛根捣汁可治酒醉不醒者，且葛根性味甘凉，有鼓舞胃气、缓解酒毒呕吐之效；宋代《本草衍义》中记载：以葛根粉治酒醉者；唐代甄权《药性论》记载：葛根能“开胃下食、止烦渴”。现代药理学研究表明，葛根不仅能够降低酒精中毒患者血液中酒精浓度，还能够提高酒精性中毒的治疗有效率。近些年来，葛根解酒相关产品开发越来越丰富，形式也多种多样，不仅有解酒药物，还有各种解酒食品和饮料，如葛根解酒含片、葛根咀嚼片、葛根解酒烧鸡、葛根解酒茶、葛根解酒巧克力等等。
中药的提取常用方法有煎煮法、回流法、浸渍法、渗漉法等，这些方法往往存在有效成分损失大、耗时长、工序多、有效成分的提取率不高等缺点。近年来，人们开发了许多中药提取新技术、新方法，如超临界流体萃取技术、超声波提取技术、微波萃取技术、半仿生提取技术、生物酶解提取技术和组织破碎提取技术等，这些方法克服了传统中药提取方法存在的问题，极大的提高了中药有效成分的收率和纯度，但也存在设备要求高、增加了生产成本、有效成分降解等问题。有关从葛根中提取多糖、异黄酮和葛根素研究有较多报道。按提取使用的溶剂不同，有乙醇提取法和水提取法两种，在这两种方法的基础上，有辅以超声波、微波强化和酶解法强化提取，能显著提高提取物的得率。
近年来，酶解技术在中药活性成分的提取中有广泛应用，该方法具有反应条件温和、不破坏有效成分原有的立体结构和生物活性、提取时间短、提取率高、反应特异性高等优点。目前应用在植物活性成分提取中最多的酶是纤维素酶，由于植物的细胞壁构成包括纤维素、半纤维素、木质素和果胶等物质，单一使用纤维素酶，对提高产物提取得率非常有限。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶。使用复合酶虽然可以有效地提高产物提取得率，但多种酶的使用，以及酶的使用量较大，无疑增加了提取的成本。
微生物能够产生多种水解植物组织的酶类，自然界中的植物残枝败叶都是由微生物产酶分解。特别是自然界中的一些霉菌，能够产生包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等多种酶。所以，如果利用一株合适的霉菌直接发酵预处理葛根，只要控制好生长程度，达到产酶分解葛根的细胞壁，但又未分解有效成分，从而促进有效成分的溶出，提取物得率就能得以提高。相比于酶解提取法，微生物产生的多种酶对葛根的水解效果更好，而且多糖被适当降解，分子量降低，活性提高；一些黄酮苷的糖基被水解，释放出黄酮苷元，提取物的生物活性会更好。
为了提高葛根提取物的制备得率和生物活性，本发明对葛根进行微生物发酵后，再使用热水超声波提取，提取物得率提高，多糖的含量可以显著增加。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法，将微生物发酵技术应用于葛根提取物的制备，葛根经微生物毛霉HY6-19发酵后，再经热水超声提取，提取物得率显著提高，多糖含量增加。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法，所述方法为：(1)葛根粉中接种毛霉(Mucor sp.)HY6-19的孢子液，搅拌均匀后于30–32℃发酵52–60h，获得葛根发酵物；所述毛霉HY6-19，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:63391，保藏日期2023年4月24日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)葛根发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温3–5h，经热水超声提取后过滤，滤液浓缩，获得葛根水提浓缩液；(3)葛根水提浓缩液经真空干燥，粉碎后，获得葛根提取物。
进一步，所述步骤(1)中的葛根是豆科植物野葛(Pueraria lobata)的干燥根；葛根粉是干燥的葛根经粉碎后过60目筛的细粉。
进一步，所述步骤(1)中的毛霉HY6-19孢子液的制备方法为：低温保藏的毛霉HY6-19孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，于30℃恒温培养48–72h后，加无菌生理盐水于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选用无菌生理盐水将孢子液调整孢子浓度为5×106–9×106个/mL。所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌15min。
进一步，所述步骤(1)中的毛霉HY6-19的孢子液体积用量以葛根粉质量计为3–4mL/g。
进一步，所述步骤(2)葛根水提浓缩液的制备方法为：葛根发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温3–5h，然后转入水温90–98℃的超声波清洗机中，160–200W超声提取40–60min，超声提取结束后，趁热用200目滤布过滤，将滤液于60℃、–0.1MPa下减压浓缩至原体积的1/15–1/25，获得葛根水提浓缩液，所述的去离子水体积加入量以发酵前葛根粉质量计为25–35mL/g。
进一步，所述步骤(3)中的葛根提取物的制备方法为：葛根水提浓缩液于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在热水超声法制备葛根提取物前，增加了微生物发酵处理。所用的发酵菌株毛霉HY6-19，是针对能够水解葛根细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。毛霉HY6-19在葛根粉中适度生长，产生较高活性的纤维素酶以及其他多种水解酶，之后，经发酵的葛根粉加水保温，细胞壁中的纤维素、半纤维素和果胶等物质被酶解，有助于细胞壁中与纤维素结合的物质和胞内物质溶出，提取物得率显著提高，多糖含量也显著提高。本发明提供的微生物发酵法制备葛根提取物的方法，较直接采用热水超声提取法相比，葛根提取物得率可以提高25.9％，多糖含量增加14.6％。
(四)附图说明
图1为毛霉HY6-19在PDA上28℃培养2d的菌落形态照片。
图2为苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线(葡萄糖为标准品)。
图3为DNS法测定还原糖的标准曲线(葡萄糖为标准品)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所用的葛根是豆科植物野葛(Pueraria lobata)的干燥根，葛根粉是干燥的葛根经粉碎后过60目筛的细粉。
本发明实施例所述的葛根的提取物得率按公式1计算：
实施例1：发酵葛根的微生物菌株分离和筛选
发酵葛根的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)从落叶较多的林地取松软湿润的土壤1g，用无菌生理盐水稀释1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于30℃恒温培养48h后。挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于30℃恒温培养72h，得纯培养霉菌菌株10株，各菌株的编号见表1；
(2)10个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度，使不同菌株的孢子液在5×106–9×106个/mL范围内，得各菌株的孢子液；
(3)10只经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，分别加入5g葛根粉，再分别加入15mL步骤(2)制备的各霉菌孢子液(体积用量以葛根粉质量计为3mL/g)，搅拌均匀后，三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养60h，获得葛根发酵物；
(4)步骤(3)全部葛根发酵物中，各加入150mL去离子水[料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀于35℃水浴中保温3h，然后转入90℃的超声波清洗机中，160W超声提取60min。超声提取结束后，趁热用200目滤布过滤，收集滤液；
(5)步骤(4)所得的滤液于60℃、–0.1MPa下减压浓缩至10mL(原体积的1/15)，获得葛根水提浓缩液。水提浓缩液于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
从步骤(3)开始，5g葛根粉中加入15mL无菌生理盐水，按照步骤(3)–(5)制备葛根提取物，做不接种霉菌的空白发酵对照；从步骤(4)开始，5g葛根粉加入150mL去离子水直接提取，按照步骤(4)、(5)制备葛根提取物，做未发酵的对照。经不同菌株发酵的葛根以及对照的提取物得率和多糖含量见表1。
表1经不同菌株发酵的葛根以及对照的提取物得率和多糖含量
由表1数据可以看出，加入无菌生理盐水但未接种霉菌孢子的空白发酵对照，虽有少量杂菌生长，但提取物得率较未发酵的对照无显著性差异，提取物的多糖含量却降低了8.12％。葛根经过多数菌株发酵后，提取物得率没有显著提高，甚至有显著降低。经过HY4、HY6和HY9菌株发酵后，提取物得率分别提高了12.6％、11.9％和10.9％，但是相比之下，经HY6发酵后的葛根提取物中多糖含量最高，较未经发酵对照提高了9.52％，本发明选定HY6菌株作为葛根的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，于三角瓶中，用8层纱布扎口，经高压蒸汽121℃灭菌15min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的葛根提取物中多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：用去离子水将葛根提取物配制成浓度为1mg/mL的水溶液；取1mL葛根提取物水溶液于10-mL离心管中，再加入4mL无水乙醇(体系的乙醇体积分数为80％)，充分振荡后于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃上清液，加10mL去离子水溶解，得葛根提取物的多糖水溶液。取1mL葛根提取物的多糖水溶液于10mL具塞管中，加1mL体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温。以1mL去离子水代替多糖水溶液的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同浓度葡萄糖样品的A490，绘制葡萄糖浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定的葛根提取物多糖含量。
实施例2：发酵葛根的微生物菌株诱变选育
对实施例1筛选的菌株HY6进行诱变育种，筛选发酵性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株HY6经PDA平板培养基30℃活化培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团蓬松的脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.34×107个/mL；
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于6只直径6cm的培养皿中，培养皿分别于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，用无菌生理盐水作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率；
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，30℃培养72h，获得50个菌株。各个菌株的平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2.5mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液(即为粗酶液)，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择产酶活力较原菌株HY6提高幅度相对较高的菌株15株，再按实施例1方法，用这些菌株的孢子液接种葛根粉发酵，再经热水超声提取，经突变菌株发酵葛根以及对照的提取物得率和多糖含量见表2。
表2经突变菌株发酵的葛根以及对照的提取物得率和多糖含量
从表2数据可以看出，在筛选的15个菌株中，编号为HY6-19的菌株，发酵产纤维素酶的活力为62.7U/mL，较野生菌株HY6的51.3U/mL提高了22.3％。用该菌株发酵葛根后，提取物得率为37.2％，较野生菌株HY6的33.8％提高了10.1％，较未发酵的对照30.2％提高了23.2％；提取物中的多糖含量为41.5％，较野生菌株HY6的33.8％提高了6.14％，较未发酵的对照35.7％提高了27.7％,所以，本发明选定HY6-19菌株作为发酵葛根的微生物菌株。
所述的产酶培养基组成为：小麦麸皮50g/L，(NH4)2SO4 6g/L，蛋白胨4g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，CaCl2 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，搅拌均匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A540)，由葡萄糖标准曲线(图3)计算样品中的葡萄糖浓度，再计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
纤维素酶活力按公式2计算。
公式2中，C：由标准曲线计算得到的葡萄糖浓度(μg/mL)；V1：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V2：粗酶液体积，即0.5mL。
葡萄糖标准曲线的绘制：7支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，搅拌均匀，于分光光度计测定A540，以葡萄糖浓度为横坐标，A540为纵坐标绘制标准曲线(图3)。
DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。
实施例3：菌株HY6-19的分类鉴定
菌株HY6-19划线接种在PDA平板培养基上28℃培养，初期菌丝为灰白色；1天后灰色略有加深，菌丝较长、蓬松，表面产生少量灰色孢子。光学显微镜下可以观察到分生孢子梗单生，繁密成层，直立，全部顶生孢子囊，孢子囊较大，球形，灰褐色，孢囊孢子球形，直径4–5μm。毛霉HY6-19在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图1。
测得菌株HY6-19的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，同源性大于95％的仅有2株，即Mucor lusitanicus CBS 108.17(96.56％和Mucor phayaoensis MFLUCC 21-0044(95.50％)，所以依据ITS序列比对结果，可以确定HY6-19菌株是一株毛霉(Mucor)，尚不能把HY6-19鉴定到种，因此，HY6-19的分类属于(参考NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)真菌界(Fungi)，毛菌门(Mucoromycota)，毛霉亚门(Pezizomycotina)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，毛霉属(Mucor)的一个种(Mucor sp.)。
所述菌株HY6-19的rDNA-ITS核苷酸序列为：
TTATCTATTTACTGTGAAACGTATTATTACTTGACGCCTGAGGGATGTTCCATTGCTATAAGGATAGGCAGCGGAAATGTTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGACGTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACTTTTGTTGAATAGGATGACTGAGAGTCTCTTGATCGTCAGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGATGGCTGAACTTTTTTTTAATATTAAAAAAAACTCCTGGGGGAAACTGGGGTGGGGCCCCCCCAATAACCCTTTTTTAAATTTGAACTGAAATCCAGGGGGAATACCCGGTGAACTT。
综上，从土壤中分离到微生物菌株HY6，经紫外线诱变后，筛选获得了用于发酵葛根的菌株HY6-19，即毛霉(Mucor sp.)HY6-19，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63391，保藏日期2023年4月24日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：毛霉HY6-19发酵制备葛根提取物的方法1
利用毛霉HY6-19发酵法制备葛根提取物，可以按以下步骤操作：
(1)冷冻干燥保存的毛霉HY6-19孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养72h。加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为8.70×106个/mL，得毛霉HY6-19孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；
(2)10g葛根粉于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入30mL步骤(1)制备的毛霉HY6-19孢子液(体积用量以葛根粉质量计为3mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养60h，获得葛根发酵物；
(3)步骤(2)的全部葛根发酵物转入500-mL的烧杯中，加300mL的去离子水[料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀后，于35℃水浴中保温5h。之后，烧杯转入水温90℃的超声波清洗机中，160W超声提取60min，趁热用200目滤布过滤，收集全部滤液；
(4)将步骤(3)制备的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至12mL(原滤液体积的1/25)，获得葛根水提浓缩液。全部的水提浓缩液于一只洁净的培养皿中，于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
按上述步骤，从10g葛根中提取获得3.78g提取物，得率为37.8％，多糖含量为41.3％。
对比例1：常规热水超声法制备葛根提取物(与实施例4对比)
(1)10g葛根粉于500-mL的烧杯中，加300mL的去离子水[料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀后，于35℃水浴中保温5h。之后，烧杯转入水温90℃的超声波清洗机中，160W超声提取60min，趁热用200目滤布过滤，收集全部滤液；
(2)将步骤(1)制备的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至12mL(原滤液体积的1/25)，获得葛根水提浓缩液。全部的水提浓缩液于一只洁净的培养皿中，于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
按上述步骤，从10g葛根中提取获得3.10g提取物，得率为31.0％，多糖含量为36.6％。
比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在葛根热水超声提取前，增加了毛霉HY6-19发酵处理，提取物的制备得率由未发酵的31.0％提高到37.8％，提高了21.9％，提取物中的多糖含量由36.6％提高到41.3％，提高了12.8％。
实施例5：毛霉HY6-19发酵制备葛根提取物的方法2
利用毛霉HY6-19发酵法制备葛根提取物，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的毛霉HY6-19的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养64h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为7.35×106个/mL，得毛霉HY6-19孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；
(2)10g葛根粉于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入35mL步骤(1)制备的毛霉HY6-19孢子液(体积用量以葛根粉质量计为3.5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于32℃条件下培养56h，获得葛根发酵物；
(3)步骤(2)的全部葛根发酵物转入500-mL的烧杯中，加250mL的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于37.5℃水浴中保温4h。之后，烧杯转入水温94℃的超声波清洗机中，180W超声提取50min，趁热用200目滤布过滤，收集全部滤液；
(4)将步骤(3)制备的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得葛根水提浓缩液。全部的水提浓缩液于一只洁净的培养皿中，于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
按上述步骤，从10g葛根中提取获得3.67g提取物，得率为36.7％，多糖含量为41.8％。
对比例2：常规热水超声法制备葛根提取物(与实施例5对比)
(1)10g葛根粉于500-mL的烧杯中，加250mL的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于37.5℃水浴中保温4h。之后，烧杯转入水温94℃的超声波清洗机中，180W超声提取50min，趁热用200目滤布过滤，收集全部滤液；
(1)将步骤(2)制备的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得葛根水提浓缩液。全部的水提浓缩液于一只洁净的培养皿中，于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
按上述步骤，从10g葛根中提取获得2.99g提取物，得率为29.9％，多糖含量为37.1％。
比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在葛根热水超声提取前，增加了毛霉HY6-19发酵处理，提取物的制备得率由未发酵的29.9％提高到36.7％，提高了22.7％，提取物中的多糖含量由37.1％提高到41.8％，提高了12.7％。
实施例6：毛霉HY6-19发酵制备葛根提取物的方法3
利用毛霉HY6-19发酵法制备葛根提取物，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的毛霉HY6-19的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于30℃恒温培养48h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为6.85×106个/mL，得毛霉HY6-19孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；
(2)10g葛根粉于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入40mL步骤(1)制备的毛霉HY6-19孢子液(体积用量以葛根粉质量计为4mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于32℃条件下培养52h，获得葛根发酵物；
(3)步骤(2)的全部葛根发酵物转入500-mL的烧杯中，加350mL的去离子水[料液比为1:35(g:mL)]，搅拌均匀后，于40℃水浴中保温3h。之后，烧杯转入水温98℃的超声波清洗机中，200W超声提取40min，趁热用200目滤布过滤，收集全部滤液；
(4)将步骤(3)制备的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至14mL(原滤液体积的1/25)，获得葛根水提浓缩液。全部的水提浓缩液于一只洁净的培养皿中，于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
按上述步骤，从10g葛根中提取获得3.84g提取物，得率为38.4％，多糖含量为41.6％。
对比例3：常规热水超声法制备葛根提取物(与实施例5对比)
(1)10g葛根粉于500-mL的烧杯中，加350mL的去离子水[料液比为1:35(g:mL)]，搅拌均匀后，于40℃水浴中保温3h。之后，烧杯转入水温98℃的超声波清洗机中，200W超声提取40min，趁热用200目滤布过滤，收集全部滤液；
(2)将步骤(1)制备的滤液于60℃、–0.1MPa条件下减压浓缩至14mL(原滤液体积的1/25)，获得葛根水提浓缩液。全部的水提浓缩液于一只洁净的培养皿中，于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
按上述步骤，从10g葛根中提取获得3.05g提取物，得率为30.5％，多糖含量为36.3％。
比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在葛根热水超声提取前，增加了毛霉HY6-19发酵处理，提取物的制备得率由未发酵的30.5％提高到38.4％，提高了25.9％，提取物中的多糖含量由36.3％提高到41.6％，提高了14.6％。
Claims (8)
1.一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述方法为：(1)葛根粉中接种毛霉Mucor sp. HY6-19的孢子液，搅拌均匀后于30–32℃发酵52–60h，获得葛根发酵物；所述毛霉HY6-19，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:63391，保藏日期2023年4月24日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)葛根发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温3–5h，经热水超声提取后过滤，滤液浓缩，获得葛根水提浓缩液；(3)葛根水提浓缩液经真空干燥，粉碎后，获得葛根提取物。
2.如权利要求1所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中葛根粉是干燥的葛根经粉碎后过60目筛的细粉。
3.如权利要求1所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的毛霉HY6-19孢子液的制备方法为：低温保藏的毛霉HY6-19孢子接种于PDA平板培养基上，于30℃恒温培养48–72h后，加无菌生理盐水于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液。
4.如权利要求1或3所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于孢子液浓度为5×106–9×106个/mL。
5.如权利要求1所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的毛霉HY6-19的孢子液体积用量以葛根粉质量计为3–4mL/g。
6.如权利要求1所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述步骤(2)葛根水提浓缩液的制备方法为：葛根发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温3–5h，然后转入水温90–98℃的超声波清洗机中，160–200W超声提取40–60min，超声提取结束后，趁热用200目滤布过滤，将滤液于60℃、–0.1MPa下减压浓缩至原体积的1/15–1/25，获得葛根水提浓缩液。
7.如权利要求1或6所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述的去离子水体积加入量以发酵前葛根粉质量计为25–35mL/g。
8.如权利要求1所述微生物发酵法制备葛根提取物的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的葛根提取物的制备方法为：葛根水提浓缩液于65℃、–0.1MPa真空干燥至恒重，粉碎，得葛根提取物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310730884.5A CN116549507B (zh) | 2023-06-19 | 2023-06-19 | 一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310730884.5A CN116549507B (zh) | 2023-06-19 | 2023-06-19 | 一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116549507A CN116549507A (zh) | 2023-08-08 |
| CN116549507B true CN116549507B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=87500323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310730884.5A Active CN116549507B (zh) | 2023-06-19 | 2023-06-19 | 一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116549507B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115747068A (zh) * | 2022-12-28 | 2023-03-07 | 南京科技职业学院 | 一种提高葛根中黄酮类物质含量的微生物发酵方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016071505A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Danmarks Tekniske Universitet | Microbial production of the flavonoids garbanzol, resokaempferol and fisetin |
| CN107334138A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-11-10 | 安徽胜华农业发展有限公司 | 一种葛根膳食纤维片的制备方法 |
| CN114933973A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-08-23 | 浙江树人学院（浙江树人大学） | 拉斯坦毛霉hz-6-27及其在黄精多糖提取中的应用 |
-
2023
- 2023-06-19 CN CN202310730884.5A patent/CN116549507B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016071505A1 (en) * | 2014-11-07 | 2016-05-12 | Danmarks Tekniske Universitet | Microbial production of the flavonoids garbanzol, resokaempferol and fisetin |
| CN107334138A (zh) * | 2017-07-05 | 2017-11-10 | 安徽胜华农业发展有限公司 | 一种葛根膳食纤维片的制备方法 |
| CN114933973A (zh) * | 2022-02-17 | 2022-08-23 | 浙江树人学院（浙江树人大学） | 拉斯坦毛霉hz-6-27及其在黄精多糖提取中的应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Diversity of soil fungi in root system of seven wild Chinese herbal medicine plants in Yuntai mountain of Jiangsu Province.;Ruan XiaoDong等;Jiangsu Journal of Agricultural Sciences;20081231;第24卷(第5期);629-633 * |
| 双向发酵技术在中药渣开发利用中的研究进展;张庆明;世界中医药;20210430;第16卷(第7期);1151-1155 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116549507A (zh) | 2023-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112481134B (zh) | 一种利用微生物发酵法提取桑叶多糖的方法 | |
| CN111471727B (zh) | 一种利用微生物发酵法提取白术多糖的方法 | |
| CN113564212B (zh) | 一种利用微生物发酵法提取杜仲叶多糖的方法 | |
| CN112574890B (zh) | 总状毛霉sy5-47及其在桑叶黄酮提取中的应用 | |
| CN116549507B (zh) | 一种微生物发酵法制备葛根提取物的方法 | |
| CN106916861A (zh) | 一种同时生产木耳多糖和黑色素的方法 | |
| CN118374357A (zh) | 总状毛霉sj6-19及其在提取沙棘叶总黄酮中的应用 | |
| CN114196578B (zh) | 棘孢曲霉nm-11-6及其在柠檬精油提取中的应用 | |
| CN111334440A (zh) | 米根霉ch5及其在提取紫芝多糖中的应用 | |
| CN114085778A (zh) | 米根霉jyh-4-23及其在金银花绿原酸提取中的应用 | |
| CN115838444B (zh) | 一种利用微生物酶解辅助提取艾叶多糖的方法 | |
| CN114933973B (zh) | 拉斯坦毛霉hz-6-27及其在黄精多糖提取中的应用 | |
| CN114606137B (zh) | 日本曲霉hy-8-25及其在迷迭香精油提取中的应用 | |
| CN116144506A (zh) | 土曲霉dk3-18及其在提取柿叶总黄酮中的应用 | |
| CN116024096A (zh) | 泡盛曲霉sr3-28及其在从朱砂七提取大黄素中的应用 | |
| CN111394258B (zh) | 匍枝根霉fl-3及其在提取茯苓多糖中的应用 | |
| CN108796027A (zh) | 一种生产类胡萝卜素的方法 | |
| CN116041561B (zh) | 一种利用微生物发酵辅助提取荷叶多糖的方法 | |
| CN116115675B (zh) | 一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法 | |
| CN113564055B (zh) | 毡毛青霉dz-9-67及其在杜仲叶总黄酮提取中的应用 | |
| CN116731881A (zh) | 毛霉hy6-19及其在制备枳椇子提取物中的应用 | |
| CN116042409A (zh) | 黑曲霉hy4-25及其在提取荷叶总黄酮中的应用 | |
| CN115894726B (zh) | 一种利用微生物酶解法提取杭白菊多糖的方法 | |
| CN117866118A (zh) | 一种利用微生物发酵辅助提取黄秋葵多糖的方法 | |
| CN118027240A (zh) | 一种微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |