CN118027240A - 一种微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法，本发明在热水超声提取沙棘叶多糖前，增加了微生物发酵预处理，所用的微生物发酵菌株总状毛霉SJ6‑19，是针对能够水解沙棘叶细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。总状毛霉SJ6‑19在添加蔗糖的沙棘叶粉中适度生长，产生多种水解酶，之后，将发酵的沙棘叶粉加水保温，细胞壁中的纤维素、半纤维素和果胶等物质被水解，有助于结合态的多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖提取得率。较不采用发酵预处理的直接提取相比，沙棘叶的多糖提取得率可以提高86.8％。

Description

一种微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法

(一)技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种利用微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法。

(二)背景技术

沙棘(Hippophae rhamnoides)，又名黑刺、醋柳等，是胡颓子科落叶小乔木或灌木，广泛分布于中国、蒙古、俄罗斯和北欧等地，在我国主要分布于华北、西北和西南地区，常生长于海拔800–3600米温带地区向阳的山嵴、谷地、干涸河床地或山坡，多砾石或沙质土壤或黄土上。沙棘由于能够抵抗干旱、风和沙的侵蚀，可扎根于盐碱土中生长，因此，它被广泛应用于盐碱草地和森林的恢复、沙漠绿化，具有很高的生态重要性。

沙棘的各个部位，包括果实、叶以及果皮中都富含维生素、多糖、多酚、黄酮、不饱和脂肪酸和微量元素等多种活性成分，具有极高的药用和营养价值，是一种药食同源性植物，它在改善肠道菌群、保护心血管系统、抗氧化、降低血糖和血脂方面有显著作用。沙棘含有的众多活性成分中，多糖备受人们关注，其具有良好抗氧化能力，能够增强人体免疫功能，并且在免疫调节、抗炎、抗肿瘤、改善肠道菌群、保肝、降血糖、抗高脂血症等方面有非常重要的意义。所以，多糖作为一种植物来源的天然活性物质，可应用于食品、药品和保健品等多个领域。

目前有较多关于从沙棘果中提取多糖的研究报道，由于沙棘果可以直接药用和食用，以及开发成沙棘果干、沙棘果汁、沙棘膏等产品，所以用沙棘果为原料提取多糖成本较高。一些沙棘果加工企业，为了提高果实的利用率，会使用沙棘果渣提取多糖，原料成本相对较低。相比之下，沙棘叶资源还没有得到开发利用，近些年来的研究发现，沙棘叶中也含有较多的多糖，而目前，仅有少量沙棘叶被开发成沙棘茶叶、沙棘叶饮料类特色产品，所以，深度开发和利用沙棘叶，能够给沙棘产地带来良好的经济效益。

目前，有不少关于沙棘叶多糖提取方法的研究报道，基本的方法都是热水提取乙醇沉淀法(简称为“水提醇沉法”)，在此基础之上，有用微波和超声波等辅助提取。不同提取方法有各自的优缺点，如常规的热水提取法操作简单，但存在提取得率低、耗时长等缺点；微波辅助提取法提取时间短、效率高，但多糖容易受到微波的破坏而活性有所下降；超声辅助提取法设备要求低，不会显著增加提取成本，但对提高提取得率的效果不够显著，这是目前最常用的方法。

近年来，酶解法在提取植物多糖中有较多的应用，其能够显著提高提取得率，而且条件温和，提取的多糖活性好，缺点是增加了酶的使用成本。酶解法提取常用的纤维素酶、果胶酶等都是微生物发酵产生，如果利用微生物直接发酵提取原料，微生物在生长中产生多种水解酶，就能够水解植物细胞壁中的纤维素、半纤维素、果胶等物质，从而有利于与纤维素紧密结合的可溶性多糖释放，当然，微生物也可能产酶分解多糖，但可以通过选择合适的发酵菌种，以及控制好发酵程度，达到酶解破坏细胞壁，但又尚未产酶降解可溶性多糖，从而提高多糖提取得率，而且相比于酶解辅助提取法，微生物发酵辅助提取节省了酶的成本。

为了能够开发利用沙棘叶，克服从沙棘叶提取多糖得率低的问题，本发明对沙棘叶做微生物发酵预处理，再采用热水超声提取，可使沙棘叶的多糖提取得率大幅度提高。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种利用微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法。将微生物发酵技术应用于沙棘叶多糖的提取，沙棘叶经微生物总状毛霉(Mucor racemosus)SJ6-19发酵后，再经热水超声提取，多糖提取得率显著提高。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法，所述的方法包括以下步骤：(1)沙棘叶粉中加入总状毛霉(Mucor racemosus)SJ6-19的孢子液，搅拌均匀后于28–30℃发酵48–60h，获得沙棘叶发酵物；所述总状毛霉SJ6-19，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:64324，保藏日期2024年3月1日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)沙棘叶发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温2.0–2.5h，经超声水提后过滤，滤液浓缩，获得沙棘叶水提浓缩液；(3)沙棘叶水提浓缩液，加入乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤，真空干燥后，获得沙棘叶多糖。

进一步，所述步骤(1)中的沙棘叶是植物沙棘(Hippophae rhamnoides)的绿色叶片，采摘后自然晾干；沙棘叶粉是沙棘叶经85℃烘干后，粉碎过40目筛的细粉。

进一步，所述步骤(1)中的总状毛霉SJ6-19孢子液的制备方法为：低温保存的总状毛霉SJ6-19孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，于28℃培养56–72h，加无菌蔗糖水溶液于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为5×10⁶–10×10⁶个/mL。所述的无菌蔗糖水溶液中蔗糖的浓度为15–20g/L，高压蒸汽115℃灭菌15min。所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌15min。

进一步，所述步骤(1)中的总状毛霉SJ6-19的孢子液体积用量以沙棘叶粉质量计为2–3mL/g。

进一步，所述步骤(2)沙棘叶水提浓缩液的制备方法为：沙棘叶发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35–40℃保温2.0–2.5h，然后转入水温85–90℃的超声波清洗机中，100–150W超声提取60–90min，超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/10–1/25，获得沙棘叶水提浓缩液，所述的去离子水体积加入量以原料沙棘叶粉质量计为25–30mL/g。

进一步，所述步骤(3)中的沙棘叶多糖的制备方法为：向沙棘叶水提浓缩液中加入3–4倍体积的无水乙醇，使体系的乙醇体积分数达到75％–80％，4℃条件下静置16–20h后，8000r/min离心5–10min，收集沉淀物，沉淀物用原料沙棘叶粉质量计1.5–2.0mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心后沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明在热水超声提取沙棘叶多糖前，增加了微生物发酵预处理，所用的微生物发酵菌株总状毛霉SJ6-19，是针对能够水解沙棘叶细胞壁而有目的分离和筛选，并经过诱变获得。总状毛霉SJ6-19在添加蔗糖的沙棘叶粉中适度生长，产生多种水解酶，之后，将发酵的沙棘叶粉加水保温，细胞壁中的纤维素、半纤维素和果胶等物质被水解，有助于结合态的多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖提取得率。较不采用发酵预处理的直接提取相比，沙棘叶的多糖提取得率可以提高86.8％。

(四)附图说明

图1：苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线(葡萄糖为标准品)。

图2：DNS法测定葡萄糖的标准曲线。

图3：总状毛霉SJ6-19在PDA上28℃培养3d的菌落形态照片。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明中所用原料、仪器和设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、仪器和设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

本发明实施例中所述的沙棘叶是植物沙棘(Hippophae rhamnoides)的绿色叶片，采摘后自然晾干，产地甘肃省定西市漳县贵清山。沙棘叶粉是沙棘叶经85℃烘干后，粉碎过40目筛的细粉。

本发明实施例中所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基(青岛海博生物技术有限公司)，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，于三角瓶中，用8层纱布扎口，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9-cm的无菌培养皿中，每皿15–20mL。

本发明实施例中所述的无菌生理盐水是0.9％的NaCl水溶液，经高压蒸汽121℃灭菌15min。

本发明实施例中所述的多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：沙棘叶多糖提取液用去离子水做适当倍数稀释(估算样品中多糖的浓度在标准曲线测定范围内)；固体沙棘叶多糖提取物用去离子水配制成浓度为0.2mg/mL的样品溶液作为待样品。吸取样品溶液1mL于10mL具塞管中，加1mL体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温。以1mL去离子水代替样品溶液的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A₄₉₀)。以相同方法测定不同浓度葡萄糖样品的A₄₉₀，绘制葡萄糖浓度—A₄₉₀标准曲线(图1)，得回归方程，由回归方程计算测定沙棘叶多糖样品中多糖含量。

所述的沙棘叶多糖提取得率按公式1计算：

实施例1：沙棘叶发酵菌株的分离和筛选

发酵沙棘叶的微生物菌株，按以下步骤分离和筛选获得：

(1)250-mL三角瓶中加入5g沙棘叶粉和0.5g花盆土壤，再加入10mL无菌生理盐水搅拌均匀，于28℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于PDA平板培养基上，于28℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃培养72h，得纯培养菌株7株，各菌株的编号见表1。

(2)7个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度，使不同菌株的孢子液在5×10⁶–10×10⁶个/mL之间，得各菌株的孢子液。

(3)7只经160℃、2h干热灭菌的50-mL三角瓶，分别加入1g沙棘叶粉，再分别加入2mL步骤(2)制备的各霉菌孢子液(体积用量以沙棘叶粉质量计为2mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃培养72h，获得沙棘叶发酵物。

(4)步骤(3)各菌株的全部沙棘叶发酵物中，各加入30mL去离子水[料液比为1:30g:mL)]，搅拌均匀后于90℃的超声波清洗机中，100W超声提取90min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，取1mL滤液于10-mL离心管中，再加入4mL的无水乙醇(溶液的乙醇体积分数为80％)，充分振荡后于4℃条件下静置16h后，8000r/min离心5min，弃上清液，加5mL去离子水溶解，采用苯酚-硫酸法测定提取液中可溶性多糖含量。

同时，做以下三个对照：①空白发酵对照：步骤(3)中，1g沙棘叶粉中加入2mL无菌生理盐水，于28℃培养72h后，再按步骤(4)提取多糖；②酶解提取对照：1g沙棘叶粉中加入30mL活力为250U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)，于40℃保温5h后，再按步骤(4)提取多糖；③未发酵提取对照：1g沙棘叶粉加入30mL去离子水按步骤(4)方法提取多糖。

经不同菌株发酵的沙棘叶以及对照的多糖提取得率见表1。

表1经不同菌株发酵的沙棘叶以及对照的多糖提取得率

由表1数据可以看出，未接种霉菌孢子的空白发酵对照，有少量杂菌生长，但多糖提取得率与未发酵提取对照没有显著性差异。沙棘叶经过多数菌株发酵后，多糖提取得率有显著提高，但经过有些菌株的发酵，多糖得率显著下降，如菌株SJ5和SJ7，说明用于发酵沙棘叶以提高多糖提取得率的霉菌有种属的选择性。沙棘叶经菌株SJ6发酵后，多糖提取得率5.32％，较未经发酵对照的4.19％相比，提高了27.0％，显著优于纤维素酶酶解提取对照的多糖得率(4.73％)。因此，本发明选定菌株SJ6作为沙棘叶发酵的初始菌种。

实施例2：发酵沙棘叶的微生物菌株诱变选育

对菌株SJ6进行诱变育种，筛选发酵性能更优良的菌株，具体方法为：

(1)孢子液的制备：菌株SJ6经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团蓬松的脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.32×10⁷个/mL。

(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子悬液于直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。上述照射处理后的孢子液作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布含有10mg/mL脱氧胆酸钠的PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于30℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。

(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得45个菌株。各个菌株接种PDA平板经28℃培养60h的新鲜培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2mL，接入50mL产酶培养基中，于28℃、200r/min振荡培养54h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液(粗酶液)，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力，选择产酶活力较原菌株SJ6提高大于10％的菌株15株，再按实施例1方法，用这15个菌株的孢子液接种沙棘叶粉发酵，热水超声提取多糖，突变菌株发酵的沙棘叶以及对照的多糖提取得率见表2。

表2突变菌株发酵的沙棘叶以及对照的多糖提取得率

从表2数据可以看出，在15个突变菌株中，编号为SJ6-19的菌株，产纤维素酶的活力为42.7U/mL，较原菌株SJ6的32.4U/mL提高了31.8％，用该菌株发酵沙棘叶粉后，多糖提取得率为6.18％，较野生菌株SJ6的5.32％提高了16.2％，较直接提取对照4.19％提高了47.5％。所以，本发明选定菌株SJ6-19作为沙棘叶的发酵菌株。

所述的产酶培养基组成为：可溶性淀粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH₄)₂SO₄ 4g/L，KH₂PO₄5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，CaCl₂ 0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL浓度为10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL的DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，摇匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A₅₄₀)，由葡萄糖标准曲线(图2)计算样品中的葡萄糖浓度，再计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃的条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。

纤维素酶活力按公式2计算。

公式2中，C：由标准曲线计算得到的葡萄糖浓度(μmol/mL)；V₁：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V₂：粗酶液体积，即0.5mL。

葡萄糖标准曲线的绘制：7支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1g/L的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，摇匀，于分光光度计测定A₅₄₀，以葡萄糖浓度为横坐标，A₅₄₀为纵坐标绘制标准曲线(图2)。

DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。

实施例3：菌株SJ6-19的分类鉴定

菌株SJ6-19线接种在PDA平板培养基上，28℃培养，菌落初期为浅白色绒毛状，随着培养时间的延长，逐渐变为灰白色，菌丝细长，直立，高度约0.6–0.8cm，表面有少量黑色孢子囊；无假根和匍匐菌丝，孢子囊梗单轴状分枝，分枝不规则；孢子囊呈球形、灰褐色；孢子呈球形或短椭圆形，表明光滑，大小5–8μm×6–10μm。菌株SJ6-19在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图3。

测得菌株SJ6-19的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对(Sequences from type material)，与总状毛霉(Mucor racemosus)典型菌株CBS260.68的rDNA-ITS序列有100％的同源性，菌株SJ6-19的形态特征也完全符合总状毛霉的形态特征，可以确定菌株SJ6-19的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，毛霉门(Mucoromycota)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，毛霉属(Mucor)，总状毛霉(Mucor racemosus)。

所述菌株SJ6-19的rDNA-ITS核苷酸序列为：

TTATCTATTTACTGTGAACTGTATTATTATTTGACATTTGAGGGATGTTCCAATGTTATAAGGATAGACATTGGAAATGTTAACCGAGTCATAATCAGGTTTAGGCCTGGTATCCTATTATTATTTACCAAATGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACTTTTGTTGTATAGGATTATTGGGGGCCTCTCGATCTGTATAGATCTTGAAATCCCTGAAATTTACTAAGGCCTGAACTTGTTTAAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGGAAAGCTCTTGTAATTGACTTTGATGGGGCCTCCCAAATAAATCTCTTTTAAATTTGATCTGAAATCAGGCGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCA。

综上，从沙棘叶粉微生物富集物中分离到菌株SJ6，经紫外线诱变后，筛选获得菌株SJ6-19，即总状毛霉(Mucor racemosus)SJ6-19，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:64324，保藏日期2024年3月1日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。

实施例4：总状毛霉SJ6-19应用于沙棘叶多糖的提取

总状毛霉SJ6-19应用于沙棘叶多糖的提取，可以按以下步骤操作：

(1)冷冻干燥保存的总状毛霉SJ6-19孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃培养64h。加10mL无菌蔗糖水溶液于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为5.60×10⁶个/mL，得总状毛霉SJ6-19孢子液。所述无菌蔗糖水溶液浓度为20g/L，经高压蒸汽115℃灭菌15min。

(2)5g沙棘叶粉于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入10mL步骤(1)制备的总状毛霉SJ6-19孢子液(体积用量以沙棘叶粉质量计为2mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃培养60h，获得沙棘叶发酵物。

(3)步骤(2)的全部沙棘叶发酵物，加150mL的去离子水[料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀后，于35℃水浴中保温2.5h。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，100W超声提取90min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至15mL(原滤液体积的1/10)，获得沙棘叶水提浓缩液。

(4)向步骤(3)获得的全部沙棘叶水提浓缩液中，加入60mL的无水乙醇(4倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，离心管中加入10mL无水乙醇(按原料沙棘叶粉质量计的2mL/g)，充分振荡后再次离心，沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖提取物。

按上述步骤，从5g沙棘叶中提取获得1.08g多糖提取物，多糖含量为35.1％，即得到沙棘叶多糖0.379g，提取得率为7.58％。

对比例1：常规水提醇沉法提取沙棘叶多糖(与实施例4对比)

(1)5g沙棘叶粉于250-mL的烧杯中，加150mL的去离子水[料液比为1:30(g:mL)]，搅拌均匀后，于35℃水浴中保温2.5h。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，100W超声提取90min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至15mL(原滤液体积的1/10)，获得沙棘叶水提浓缩液。

(2向步骤(1)获得的全部沙棘叶水提浓缩液中，加入60mL的无水乙醇(4倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，离心管中加入10mL无水乙醇(按原料沙棘叶粉质量计的2mL/g)，充分振荡后再次离心，沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖提取物。

按上述步骤，从5g沙棘叶中提取获得0.635g多糖提取物，多糖含量为33.5％，即得到沙棘叶多糖0.213g，提取得率为4.26％。

比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在沙棘叶超声水提多糖前，增加了总状毛霉SJ6-19发酵预处理，多糖提取得率由直接提取的4.26％提高到7.58％，提高了77.9％。

实施例5：总状毛霉SJ6-19应用于沙棘叶多糖的提取

总状毛霉SJ6-19应用于沙棘叶多糖的提取，可以按以下步骤操作：

(1)4℃保存的总状毛霉SJ6-19的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃培养60h，加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为7.35×10⁶个/mL，得总状毛霉SJ6-19孢子液。所述的无菌蔗糖水溶液的浓度为17.5g/L，高压蒸汽115℃灭菌15min。

(2)10g沙棘叶粉于经160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，再加入25mL步骤(1)制备的总状毛霉SJ6-19孢子液(体积用量以沙棘叶粉质量计为2.5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃培养24h，获得沙棘叶发酵物。

(3)步骤(2)的全部沙棘叶发酵物转入500-mL的烧杯中，加280mL的去离子水[料液比为1:28(g:mL)]，搅拌均匀后，于37.5℃水浴中保温2h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，125W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至14mL(原滤液体积的1/20)，获得沙棘叶水提浓缩液。

(4)向步骤(3)获得的全部沙棘叶水提浓缩液中，加入49mL的无水乙醇(3.5倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为78％)，4℃条件下静置18h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，离心管中加入15mL无水乙醇(按原料沙棘叶粉质量计的1.5mL/g)，充分振荡后再次离心，沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖提取物。

按上述步骤，从10g沙棘叶中提取获得2.17g多糖提取物，多糖含量为37.2％，即得到沙棘叶多糖0.807g，提取得率为8.07％。

对比例2：常规水提醇沉法提取沙棘叶多糖(与实施例5对比)

(1)10g沙棘叶粉于500-mL的烧杯中，加280mL的去离子水[料液比为1:28(g:mL)]，搅拌均匀后，于37.5℃水浴中保温2h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，125W超声提取75min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至14mL(原滤液体积的1/20)，获得沙棘叶水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部沙棘叶水提浓缩液中，加入49mL的无水乙醇(3.5倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为78％)，4℃条件下静置18h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，离心管中加入15mL无水乙醇(按原料沙棘叶粉质量计的1.5mL/g)，充分振荡后再次离心，沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖提取物。

按上述步骤，从10g沙棘叶中提取获得1.24g多糖提取物，多糖含量为34.8％，即得到沙棘叶多糖0.432g，提取得率为4.32％。

比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在沙棘叶超声水提多糖前，增加了总状毛霉SJ6-19发酵预处理，多糖提取得率由直接提取的8.07％提高到4.32％，提高了86.8％。

实施例6：总状毛霉SJ6-19应用于沙棘叶多糖的提取

总状毛霉SJ6-19应用于沙棘叶多糖的提取，可以按以下步骤操作：

(1)4℃保存的总状毛霉SJ6-19的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃培养56h，加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为8.25×10⁶个/mL。所所述的无菌蔗糖水溶液的浓度为15g/L，高压蒸汽115℃灭菌15min。

(2)20g沙棘叶粉于经160℃、2h干热灭菌的500-mL三角瓶中，再加入60mL步骤(1)制备的总状毛霉SJ6-19孢子液(体积用量以沙棘叶粉质量计为3mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃培养48h，获得沙棘叶发酵物。

(3)步骤(2)的全部沙棘叶发酵物转入1-L的烧杯中，加500的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于40℃水浴中保温2h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，150W超声提取60min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至20mL(原滤液体积的1/25)，获得沙棘叶水提浓缩液。

(4)向步骤(3)获得的全部沙棘叶水提浓缩液中，加入60mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置20h后，8000r/min离心10min，弃去上清液。离心管中加入20mL无水乙醇(按原料沙棘叶粉质量计的1mL/g)，充分振荡后再次离心，沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖提取物。

按上述步骤，从20g沙棘叶中提取获得4.02g多糖提取物，多糖含量为35.6％，即得到沙棘叶多糖1.43，提取得率为7.15％。

对比例3：常规水提醇沉法提取沙棘叶多糖(与实施例6对比)

(1)20g的沙棘叶粉于1-L的烧杯中，加500的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于40℃水浴中保温2h。之后，三角瓶转入水温85℃的超声波清洗机中，150W超声提取60min，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至20mL(原滤液体积的1/25)，获得沙棘叶水提浓缩液。

(2)向步骤(1)获得的全部沙棘叶水提浓缩液中，加入60mL的无水乙醇(3倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为75％)，4℃条件下静置20h后，8000r/min离心10min，弃去上清液。离心管中加入20mL无水乙醇(按原料沙棘叶粉质量计的1mL/g)，充分振荡后再次离心，沉淀物于70℃、–0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖提取物。

按上述步骤，从20g沙棘叶中提取获得2.38g多糖提取物，多糖含量为34.2％，即得到沙棘叶多糖0.814g，提取得率为4.07％。

比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在沙棘叶超声水提多糖前，增加了总状毛霉SJ6-19发酵预处理，多糖提取得率由直接提取的4.07％提高到7.15％，提高了75.7％。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更、放大以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种利用微生物发酵辅助提取沙棘叶多糖的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：(1)沙棘叶粉中加入总状毛霉(Mucor racemosus)SJ6-19的孢子液，搅拌均匀后于28-30℃发酵48-60h，获得沙棘叶发酵物；所述总状毛霉SJ6-19保藏编号GDMCCNo:64324；(2)沙棘叶发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35-40℃保温2.0-2.5h，经超声水提后过滤，滤液浓缩，获得沙棘叶水提浓缩液；(3)沙棘叶水提浓缩液，加入乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤，真空干燥后，获得沙棘叶多糖。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的沙棘叶是植物沙棘(Hippophaerhamnoides)的绿色叶片，采摘后自然晾干；沙棘叶粉是沙棘叶经85℃烘干后，粉碎过40目筛的细粉。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的总状毛霉SJ6-19孢子液的制备方法为：低温保存的总状毛霉SJ6-19孢子接种于PDA平板培养基上，于28℃培养56-72h，加无菌蔗糖水溶液于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液。

4.如权利要求1或3所述的方法，其特征在于，将孢子液用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为5×10⁶-10×10⁶个/mL，所述的无菌蔗糖水溶液中蔗糖的浓度为15-20g/L。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中的总状毛霉SJ6-19的孢子液体积用量以沙棘叶粉质量计为2-3mL/g。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)沙棘叶水提浓缩液的制备方法为：沙棘叶发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于35-40℃保温2.0-2.5h，然后转入水温85-90℃的超声波清洗机中，100-150W超声提取60-90min，超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液于60℃、-0.1Mpa条件下减压浓缩至原体积的1/10-1/25，获得沙棘叶水提浓缩液。

7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述的去离子水体积加入量以原料沙棘叶粉质量计为25-30mL/g。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的沙棘叶多糖的制备方法为：向沙棘叶水提浓缩液中加入3-4倍体积的无水乙醇，使体系的乙醇体积分数达到75％-80％，4℃条件下静置16-20h后，8000r/min离心5-10min，收集沉淀物，沉淀物用原料沙棘叶粉质量计1.5-2.0mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心后沉淀物于70℃、-0.1Mpa条件下真空干燥至恒重，得沙棘叶多糖。