CN116286387A - 少根根霉ds6-14及其在党参多糖提取中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株少根根霉DS6‑14及其在党参多糖提取中的应用。少根根霉DS6‑14保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63063，保藏日期2022年12月20日，该菌株是针对能够水解党参细胞壁而有目的分离和筛选获得。在从党参中提取多糖前，增加了少根根霉DS6‑14发酵预处理，菌体在添加蔗糖的党参粉中适度生长，产生多种水解酶，之后，经发酵的党参粉加水保温酶解，细胞壁中的纤维素、半纤维素和果胶等物质被水解，有助于结合态的党参多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，党参多糖的提取得率提高46.7％。

Description

少根根霉DS6-14及其在党参多糖提取中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株少根根霉DS6-14及其在党参多糖提取中的应用。
(二)背景技术
党参(Codonopsis Radix)为桔梗科植物党参(Codonopsis pilosula)、素花党参(Codonopsis pilosula var.modesta)或川党参(Codonopsistangshen)的干燥根。党参是传统的药食同源野生植物，作为中药材，具有增强造血功能、调节血压、保护胃肠道、增强免疫、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、保护神经、抗菌、抗炎、降血脂等功效，临床上可用于防治高血脂症、低血压、造血功能障碍、急性高原反应以及功能性子宫出血等；作为食材，具有补中益气、健脾益肺等功效。党参中主要含有甾醇类、糖苷类、多糖类、生物碱类以及三萜类化合物，其中党参多糖是党参的主要活性成分之一，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗炎、抗病毒、免疫增强、糖尿病治疗、抑制血小板聚集、中枢神经抑制等作用，因此，开发党参多糖为主要成分的药品及保健食品市场前景广阔。
目前有较多关于党参多糖提取方法的研究报道，基本方法都是热水提取乙醇沉淀法(简称“水提醇沉法”)。在热水提取方法的基础上，有采取超声、微波、酶解等辅助措施的提取方法。常规的热水提取法具有操作简单、成本低的优点，但存在提取时间长、提取次数多和提取效率低等缺点；超声提取法和微波提取法虽然操作简单，提取时间短，但这些方法存在耗能大、成本高等缺点。酶辅助提取法是利用纤维素酶、果胶酶或复合酶，通过酶解反应分解党参的细胞壁及细胞间质中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质，使细胞壁舒松、破损，减小传质阻力，从而提高党参多糖的提取率，具有条件温和、提取时问短、能耗低、成本低廉、利于保持有效成分原有药效等优点。
有研究采用酶解法辅助党参多糖提取，如岳显文的用纤维素酶辅助提取党参多糖，得率较未酶解提取法提高了23.92％，但纤维素酶加量为提取体系的2.4％，显然酶的用量较大[岳显文.党参酶解提取工艺优化.黑龙江医药,2011,24(5):743-744.]。酶解辅助植物有效成分的提取方法中，如果酶的使用量较大，无疑会增加提取成本，如果多糖提取得率提高带来的经济效益不及酶以及酶解操作所带来的成本，那么该工艺就没有工业化应用的价值。
自然界中的植物残枝败叶都是靠微生物分解腐烂，这些微生物在生长过程中可以产生多种分解植物组织的酶类，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和果胶酶等。所以，如果用微生物直接发酵预处理党参，只要控制好生长程度，达到产酶分解党参的细胞壁，但又未分解可溶性多糖，从而促进党参多糖溶出，提取得率就能得以提高。
为了提高党参多糖的提取得率，本发明对常规的水提醇沉提取法进行改进，增加微生物发酵预处理步骤，可使党参多糖的提取得率大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株新的微生物菌株—少根根霉(Rhizopus arrhizus)DS6-14及其在党参多糖提取中的应用，党参经该菌株发酵后，多糖的提取得率可以显著提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新的微生物菌株—少根根霉(Rhizopus arrhizus)DS6-14，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63063，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述少根根霉DS6-14，是从党参的微生物富集培养物中分离，经过筛选获得的优良菌株。所述少根根霉DS6-14的形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为灰白色，绒毛状，2d后变为灰色，菌丝层较厚、疏松，菌丝较长，表面有灰色孢子，菌落背面灰白色，无色素扩散。匍匐菌丝和假根不发达，假根少而短；孢子囊梗多数弯曲，很少单生，多形成伞状聚合，直接由菌丝长出而不与假根相对应；孢子囊球形或近球形、深棕灰色；孢囊孢子为椭圆形或多边形，直径4–7μm。少根根霉DS6-14在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
所述的少根根霉DS6-14的核糖体DNA内转录间隔区(RibosomaL DNAinternaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述少根根霉DS6-14在提取党参多糖中的应用，所述应用的方法为：(1)向党参粉中加入少根根霉DS6-14的孢子液，搅拌均匀后于28℃发酵60–64h，获得党参发酵物；(2)向党参发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–8h，经超声水提后过滤和浓缩，获得党参水提浓缩液；(3)向党参水提浓缩液中加入乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和真空干燥后，获得党参多糖。
进一步，所述步骤(1)中的党参粉是植物党参(Codonopsis pilosula)的干燥根，粉碎后过80目筛的细粉。
进一步，所述步骤(1)中的少根根霉DS6-14孢子液的制备方法为：低温保藏的少根根霉DS6-14孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，于28℃恒温培养56–72h后，加无菌蔗糖水溶液于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为5×106–10×106个/mL。所述的无菌蔗糖水溶液，蔗糖的浓度为20–30g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min。所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，高压蒸汽121℃灭菌20min。
进一步，所述步骤(1)中的少根根霉DS6-14的孢子液，体积用量以党参粉质量计为1.5–2.0mL/g。
进一步，所述步骤(2)党参水提浓缩液的制备方法为：党参发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–8h，然后转入水温90–95℃的超声波清洗机中，100–150W超声提取1.5–2.0h，超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液于60℃、–0.1Mpa下减压浓缩至原体积的1/25–1/20，获得党参水提浓缩液，所述的去离子水体积加入量以发酵前党参粉质量计为20–25mL/g。
进一步，所述步骤(3)中的党参多糖的制备方法为：向党参水提浓缩液中加入4–5倍体积的无水乙醇，使体系的乙醇体积分数达到80％–83.3％，4℃条件下静置12–16h后，8000r/min离心5–10min，收集沉淀，加入原料党参粉质量计1–2mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种新的微生物菌株少根根霉DS6-14，该菌株是针对能够水解党参细胞壁而有目的分离和筛选获得。少根根霉DS6-14在添加蔗糖的党参粉中适度生长，产生多种水解酶，之后，经发酵的党参粉加水保温酶解，细胞壁中的纤维素、半纤维素和果胶等物质被水解，有助于结合态的党参多糖在超声水提时溶出，从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，党参多糖的提取得率提高46.7％。
(四)附图说明
图1为少根根霉DS6-14在PDA上28℃培养3d的菌落形态照片。
图2为苯酚-硫酸法测定多糖的标准曲线。
图3为DNS法测定葡萄糖的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所述的党参是桔梗科植物党参(Codonopsis pilosula)的干燥根，党参粉是的干燥的党参经粉碎后过80目筛的细粉。
实施例1：发酵党参的微生物菌株分离和筛选
发酵党参的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)50-mL三角瓶中加入5g的党参粉，再加入10mL无菌生理盐水润湿，于28℃恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃恒温培养72h，得纯培养菌株10株，各菌株的编号见表1。
(2)10个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌蔗糖水溶液，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度，使不同菌株的孢子液在5×106–10×106个/mL之间，得各菌株的孢子液。所述的无菌蔗糖水溶液的浓度为30g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min。
(3)10只经160℃、2h干热灭菌的50-mL三角瓶，分别加入1g党参粉，再分别加入1.5mL的步骤(2)制备的各霉菌孢子液(体积用量以党参粉质量计为1.5mL/g)，搅拌均匀后，三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养64h，获得党参发酵物。
(4)取步骤(3)经各菌株发酵的全部党参粉中，各加入25mL去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀于35℃水浴中酶解4h，然后转入95℃的超声波清洗机中，100W超声提取2h。超声水提结束后，8000r/min离心5min，取1mL上清液于10-mL离心管中，再加入5mL的无水乙醇(溶液的乙醇体积分数为83.3％)，充分振荡后于4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃上清液，加5mL去离子水溶解，采用苯酚-硫酸法测定提取液中可溶性多糖含量。
从步骤(3)开始，1g党参粉中加入1.5mL无菌蔗糖溶液(浓度30g/L)，做不接种霉菌的空白发酵对照；按步骤(4)方法，1g党参加入25mL去离子水直接提取多糖，做未发酵提取对照。经不同菌株发酵的党参以及对照的多糖提取得率见表1。
表1经不同菌株发酵的党参以及对照的多糖提取得率
Figure BDA0004023574440000051
由表1数据可以看出，加入无菌蔗糖水溶液但未接种霉菌的空白发酵对照，由于几乎没有霉菌生长，多糖的提取得率与未发酵提取对照物没有显著性差异。多数菌株发酵党参后，多糖的提取得率没有显著提高，甚至经过有些菌株的发酵，多糖得率反而显著下降，如DS1、DS3和DS7菌株，说明用于发酵党参以提高多糖提取得率的微生物菌株有种属的选择性。党参经DS-6菌株发酵后，多糖提取得率为21.3％，较未经发酵对照的16.7％相比，提高了27.5％，本发明选定DS-6菌株作为提高党参多糖提取得率的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的浓度配制，pH自然，于三角瓶中，用8层纱布扎口，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的党参多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：党参多糖提取液用去离子做适当倍数稀释(估算样品中多糖的浓度在标准曲线测定范围内)；固体党参多糖提取物用去离子配制成浓度为0.2mg/mL的样品溶液作为待样品。吸取样品溶液1mL于10mL具塞管中，加1mL体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀后置沸水浴中加热15min，冷却至室温。以1mL去离子作为空白对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同浓度葡萄糖样品的A490，绘制葡萄糖浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程，由回归方程计算测定党参多糖样品中多糖含量。
所述的党参多糖提取得率按以下公式计算：
Figure BDA0004023574440000061
实施例2：发酵党参的微生物菌株的复筛
对菌株DS6再次单孢子分离，筛选发酵性能更加优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株DS-6于PDA斜面培养基，28℃恒温培养箱中培养48h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加有约50粒玻璃珠)，振荡15min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗颈部塞少量脱脂棉)。用无菌生理盐水稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别移取不同稀释度的孢子液0.1mL涂布PDA平板培养基，培养皿倒置于28℃培养48h。挑取PDA平板上的单菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得35个菌株，各菌株编号见表2。
(2)菌株的筛选：各个菌株经28℃培养72h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2mL，接入50mL产酶培养基中，于28℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液(即粗酶液)，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择产酶活力较原菌株DS6提高幅度相对较高的菌株13株，再按实施例1方法，用这13个菌株的孢子液接种党参粉发酵，超声水提醇沉法提取多糖，复筛菌株发酵党参及对照的多糖提取得率见表2。
表2复筛菌株发酵党参及对照的多糖提取得率
Figure BDA0004023574440000062
Figure BDA0004023574440000071
从表2数据可以看出，在复筛的13个菌株中，编号为DS6-14的菌株，产纤维素酶的活力为65.6U/mL，较原菌株DS-6的56.2U/mL提高了16.7％，用该菌株发酵党参粉后，多糖提取得率为24.4％，较野生菌株DS-6的21.3％提高了14.6％，较未发酵提取对照的16.8％提高了46.1％。
所述的产酶培养基组成为：可溶性淀粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO45g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，摇匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A540)。由葡萄糖标准曲线(图3)计算样品中的葡萄糖浓度，再而计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
纤维素酶活力按以下公式(1)计算。
Figure BDA0004023574440000072
式(1)中，C：由标准曲线计算得的葡萄糖浓度(μg/mL)；V1：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V2：粗酶液体积，即0.5mL。
葡萄糖标准曲线的绘制：7支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，摇匀，于分光光度计测定A540，以葡萄糖浓度为横坐标，A540为纵坐标绘制标准曲线(图3)。
DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。
实施例3：菌株DS6-14的分类鉴定
菌株DS6-14划线接种在PDA平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为灰白色，绒毛状，2d后变为灰色，菌丝层较厚、疏松，菌丝较长，表面有灰色孢子，菌落背面灰白色，无色素扩散。匍匐菌丝和假根不发达，假根少而短；孢子囊梗多数弯曲，很少单生，多形成伞状聚合，直接由菌丝长出而不与假根相对应；孢子囊球形或近球形、深棕灰色；孢囊孢子为椭圆形或多边形，直径4–7μm。菌株DS6-14在PDA平板培养基上28℃培养3d的菌落照片见图1。
测得菌株DS6-14的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与已知的少根根霉(Rhizopus arrhizus)典型菌株CBS112.07的rDNA-ITS序列有99.28％的同源性。根据菌株DS6-14菌落形态特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确定菌株DS6-14的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，毛霉门(Mucoromycota)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，根霉属(Rhizopus)，少根根霉(Rhizopus arrhizus)。
所述菌株DS6-14的rDNA-ITS核苷酸序列为：
TTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGCACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTAATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTCTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGCAACTTTCAAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。
综上，从党参粉微生物富集物中分离到菌株DS6，经第二次分离纯化后，筛选获得菌株DS6-14，即少根根霉(Rhizopus arrhizus)DS6-14，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63063，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：少根根霉DS6-14应用于党参多糖的提取
少根根霉DS6-14应用于党参多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)冷冻干燥保存的少根根霉DS6-14孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养72h。加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为8.75×106个/mL，得少根根霉DS6-14孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液的浓度为30g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min。
(2)5g党参粉于经160℃、2h干热灭菌的100-mL三角瓶中，再加入7.5mL步骤(1)制备的少根根霉DS6-14孢子液(体积用量以党参粉质量计为1.5mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养64h，获得党参发酵物。
(3)步骤(2)的全部党参发酵物转入250-mL的烧杯瓶中，加125mL的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于35℃水浴中酶解4h。之后，三角瓶转入水温95℃的超声波清洗机中，100W超声提取2h，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至5mL(原滤液体积的1/25)，获得党参水提浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部党参水提浓缩液中，加入25mL的无水乙醇(5倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为83.3％)，4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，沉淀加入10mL的无水乙醇(按原料党参粉质量计的2.0mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖提取物。
按上述步骤，从5g党参中提取获得1.87g多糖提取物，多糖含量为65.7％，即得到党参多糖1.23g，提取得率为24.6％。
对比例1：常规水提醇沉法提取党参多糖(与实施例4对比)
(1)5g党参粉于250-mL的烧杯中，加125mL的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于35℃水浴中保温4h。之后，三角瓶转入水温95℃的超声波清洗机中，100W超声提取2h，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至5mL(原滤液体积的1/25)，获得党参水提浓缩液。
(2)向步骤(1)获得的全部党参水提浓缩液中，加入25mL的无水乙醇(5倍浓缩液的体积，体系的乙醇体积分数为83.3％)，4℃条件下静置12h后，8000r/min离心5min，弃去上清液，沉淀加入10mL的无水乙醇(按原料党参粉质量计的2.0mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖提取物。
按上述步骤，从5g党参中提取获得1.53g多糖提取物，多糖含量为56.4％，即得到党参多糖0.863g，提取得率为17.3％。
比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在党参超声水提多糖前，增加了少根根霉DS6-14发酵预处理，多糖的提取得率由未发酵预处理的17.3％提高到24.6％，提高了42.2％。
实施例5：少根根霉DS6-14应用于党参多糖的提取
少根根霉DS6-14应用于党参多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的少根根霉DS6-14的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养64h，加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为7.05×106个/mL，得少根根霉DS6-14孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液的浓度为25g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min。
(2)10g党参粉于经160℃、2h干热灭菌的100-mL三角瓶中，再加入18mL步骤(1)制备的少根根霉DS6-14孢子液(体积用量以党参粉质量计为1.8mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养62h，获得党参发酵物。
(3)步骤(2)的全部党参发酵物转入500-mL的烧杯中，加250mL的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于30℃水浴中酶解6h。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，125W超声提取1.5h，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得党参水提浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部党参水提浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置14h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀加入15mL的无水乙醇(按原料党参粉质量计的1.5mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖提取物。
按上述步骤，从10g党参中提取获得3.64g多糖提取物，多糖含量为64.3％，即得到党参多糖2.34g，提取得率为23.4％。
对比例2：常规水提醇沉法提取党参多糖(与实施例5对比)
(1)10g党参粉于500-mL的烧杯中，加250mL的去离子水[料液比为1:25(g:mL)]，搅拌均匀后，于30℃水浴中保温6h。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，125W超声提取1.5h，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至10mL(原滤液体积的1/25)，获得党参水提浓缩液。
(2)向步骤(1)获得的全部党参水提浓缩液中，加入40mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置14h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入15mL的无水乙醇(按原料党参粉质量计的1.5mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖提取物。
按上述步骤，从10g党参中提取获得2.99g多糖提取物，多糖含量为55.2％，即得到党参多糖1.65g，提取得率为16.5％。
比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在党参超声水提多糖前，增加了少根根霉DS6-14发酵预处理，多糖的提取得率由未发酵预处理的16.5％提高到23.4％，提高了41.8％。
实施例6：少根根霉DS6-14应用于党参多糖的提取
少根根霉DS6-14应用于党参多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的少根根霉DS6-14的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养56h，加10mL的无菌蔗糖水溶液于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬浮，孢子液转移至无菌试管中，用无菌蔗糖水溶液调整孢子浓度为8.10×106个/mL。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1；所述的无菌蔗糖水溶液的浓度为20g/L，高压蒸汽115℃灭菌20min。
(2)25g党参粉于经160℃、2h干热灭菌的150-mL三角瓶中，在加入50mL步骤(1)制备的少根根霉DS6-14孢子液(体积用量以党参粉质量计为20mL/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下培养60h，获得党参发酵物。
(3)步骤(2)的全部党参发酵物转入1-L的烧杯中，加500mL的去离子水[料液比为1:20(g:mL)]，搅拌均匀后，于30℃水浴中酶解8h。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，150W超声提取1.5h，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至25mL(原滤液体积的1/20)，获得党参水提浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部党参水提浓缩液中，加入100mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀加入25mL的无水乙醇(按原料党参粉质量计的1.0mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖提取物。
按上述步骤，从25g党参中提取获得9.38g多糖提取物，多糖含量为66.1％，即得到党参多糖6.20g，提取得率为24.8％。
对比例3：常规水提醇沉法提取党参多糖(与实施例6对比)
(1)25g的党参粉于1-L的烧杯中，加500mL的去离子水[料液比为1:20(g:mL)]，搅拌均匀后，于30℃水浴中保温8h。之后，三角瓶转入水温90℃的超声波清洗机中，150W超声提取1.5h，趁热布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃、–0.1Mpa条件下减压浓缩至25mL(原滤液体积的1/20)，获得党参水提浓缩液。
(2)向步骤(1)获得的全部党参水提浓缩液中，加入100mL的无水乙醇(4倍浓缩液体积，体系的乙醇体积分数为80％)，4℃条件下静置16h后，8000r/min离心10min，弃去上清液，加入25mL的无水乙醇(按原料党参粉质量计的1.0mL/g)洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖提取物。
按上述步骤，从25g党参中提取获得7.61g多糖提取物，多糖含量为55.6％，即得到党参多糖4.23g，提取得率为16.9％。
比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在党参超声水提多糖前，增加了少根根霉DS6-14发酵预处理，多糖的提取得率由未发酵预处理的16.9％提高到24.8％，提高了46.7％。

Claims (10)

1.少根根霉(Rhizopus arrhizus)DS6-14，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No:63063，保藏日期2022年12月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述的少根根霉DS6-14在提取党参多糖中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：(1)向党参粉中加入少根根霉DS6-14的孢子液，搅拌均匀后于28℃发酵60–64h，获得党参发酵物；(2)向党参发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–8h，经超声水提后过滤和浓缩，获得党参水提浓缩液；(3)党参水提浓缩液中加入乙醇使多糖沉淀，沉淀物经乙醇洗涤和真空干燥后，获得党参多糖。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的党参粉是植物党参的干燥根，粉碎后过80目筛的细粉。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中少根根霉DS6-14的孢子液体积用量以党参粉质量计为1.5–2.0mL/g。
6.如权利要求3或5所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中少根根霉DS6-14孢子液的制备方法为：低温保藏的少根根霉DS6-14孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，于28℃恒温培养56–72h后，加无菌蔗糖水溶液于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述无菌蔗糖水溶液浓度为20–30g/L，所述孢子液浓度为5×106–10×106个/mL。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(2)中党参水提浓缩液的制备方法为：党参发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–8h，然后转入水温90–95℃的超声波清洗机中，100–150W超声提取1.5–2.0h；超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液于60℃、–0.1Mpa下减压浓缩至原体积的1/25–1/20，获得党参水提浓缩液。
9.如权利要求3或8所述的应用，其特征在于，所述去离子水体积加入量以原料党参粉质量计为20–25mL/g。
10.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)党参多糖的制备方法为：向党参水提浓缩液中加入4–5倍体积的无水乙醇，使体系的乙醇体积分数达到80％–83.3％，4℃条件下静置12–16h后，8000r/min离心5–10min，收集沉淀，加入原料党参粉质量计1–2mL/g的无水乙醇洗涤一次，再次离心，沉淀物于50℃、–0.1Mpa真空干燥至恒重，得党参多糖。
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