CN114933973B - 拉斯坦毛霉hz-6-27及其在黄精多糖提取中的应用 - Google Patents

拉斯坦毛霉hz-6-27及其在黄精多糖提取中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株拉斯坦毛霉HZ‑6‑27及其在黄精多糖提取中的应用，所述应用的方法为：黄精粉中加入无菌生理盐水，接种拉斯坦毛霉HZ‑6‑27孢子，搅拌均匀后于30–32℃发酵48–60h，得黄精发酵物；向黄精发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–5h，经超声水提后浓缩，获得黄精水提浓缩物；再将黄精水提浓缩物中加入乙醇沉淀，沉淀物真空干燥后，获得黄精多糖。在从黄精中提取多糖前，增加了拉斯坦毛霉HZ‑6‑27发酵预处理，黄精的细胞壁被水解，有助于多糖溶出，从而其提取得率得以显著提高。较不采用发酵预处理的常规方法相比，黄精多糖的提取得率提高93.5％。

Description

拉斯坦毛霉HZ-6-27及其在黄精多糖提取中的应用
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株拉斯坦毛霉HZ-6-27及其在黄精多糖 提取中的应用。
(二)背景技术
黄精是百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)多年生草本植物，包括黄精(Polygonatum sibiricum)、滇黄精(Polygonatum kingianum)和多花黄精(Polygonatumcyrtonema)三个种。黄精的根茎就是中药材“黄精”，其味甘，性平，归脾、肺、肾经， 具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效，主治脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干 食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴。同时，黄精 作为药食同源的食材，又具有解热消暑、改善记忆力、提高免疫力等功能。黄精的活性 成分主要包括多糖、黄酮、木脂素、蒽醌、生物碱、挥发性油脂等。其中，黄精多糖被 认定为具有抗氧化、抗炎、降血压、抗动脉粥样硬化、抗病毒、抑制癌细胞、保肝等作 用，是中药黄精饮片的主要指标成分，如中国药典(2020版一部)要求含黄精多糖以无 水葡萄糖计，不得少于4.0％。
提取黄精多糖的方法有多种，基本的方法都是水提醇沉，在此基础之上，有用超声波、微波、酶解、加压等方法辅助提取。不同的提取方法有各自的优缺点，如传统的 水提醇沉法操作简单，但存在提取率低、耗时长等缺点；微波辅助提取法提取时间短、 效率高，但其所需料液比高，多糖的品质有所下降；超声辅助提取法则无需加热，效率 较高，且不会显著增加提取成本；酶解辅助提取法是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶对提 取原料预处理，酶水解植物组织的非水溶性多糖，有利于水溶性多糖的溶解，从而能够 显著提高提取得率，但是酶的使用会增加提取成本。将酶解与超声波辅助联合应用于黄 精多糖的提取，则发挥了两种方法的优点，多糖得率可以显著提高，如刘日斌等用木瓜 蛋白酶和纤维素酶辅助超声波法提取黄精多糖，提取得率可达25.63％[刘日斌,等.超 声波辅助酶法优化黄精多糖提取工艺的研究.食品研究与开发,2021,42(7):141-146]。
用纯的纤维素酶、蛋白酶或果胶酶预处理黄精，虽然可以显著提高可溶性多糖的提 取得率，但酶的使用量往往较大，如刘日斌等的研究中，纤维素酶和木瓜蛋白酶的加量为6％。大量酶的使用无疑会增加提取的成本，此外，植物组织的构成不仅是纤维素， 还有半纤维素和木质素等物质，使用一两种酶水解植物细胞壁，效果并不理想。很多微 生物在生长过程中可以产生多种水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶和蛋白 酶等。所以，如果用微生物直接发酵预处理黄精，其产生的多种水解酶协同水解多糖和 蛋白质，促进多糖溶出，从而可以提高提取得率。本发明采用微生物发酵预处理黄精原 料，可使黄精多糖的提取得率大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株微生物新菌株—拉斯坦毛霉(Mucor lusitanicus)HZ-6-27及 其在黄精多糖提取中的应用，黄精经该菌株发酵后，多糖的提取得率得到了显著提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株微生物新菌株—拉斯坦毛霉(Mucor lusitanicus)HZ-6-27，保藏于 广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62072，保藏日期2021年11月 17日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
本发明所述拉斯坦毛霉HZ-6-27，是从黄精的微生物富集培养物中分离，经过筛选和诱变选育获得的优良菌株。所述拉斯坦毛霉HZ-6-27的菌落形态特征如下：在马铃薯 葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基上，28℃培养24h，沿接种线两侧长出灰色菌丝，菌丝 直长。培养至48h，菌落厚度约5mm，有透明渗出液，不分泌色素。菌丝稠密，无假 根，孢子梗直立，分枝较多。孢子囊球形，壁潮湿，直径为40–70μm。孢囊孢子在大 小和形状上变化较大，呈球形或椭圆形，大小4–12μm×5–16μm。拉斯坦毛霉HZ-6-27 在PDA平板培养基上28℃培养24h(A)和48h(B)的菌落照片见图2。
所述的拉斯坦毛霉HZ-6-27的核糖体DNA内转录间隔区(Ribosomal DNA internaltranscribed spacer，rDNA-ITS)核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种所述拉斯坦毛霉HZ-6-27在黄精多糖提取中的应用，所述应用的 方法为：黄精粉中加入无菌生理盐水，接种拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子，搅拌均匀后于 30–32℃发酵48–60h，得黄精发酵物；向黄精发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于 30–35℃酶解4–5h，经超声水提后过滤，滤液浓缩，获得黄精水提浓缩物；再将浓缩物 加乙醇沉淀，沉淀物真空干燥后，获得黄精多糖。
进一步，所述无菌生理盐水体积用量以黄精粉质量计为0.4–0.5mL/g；所述拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子接种量以黄精粉质量计为1.5×106–2.0×106个/g；所述黄精粉是将黄精烘干粉碎后过40目筛获得。
进一步，所述拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子接种黄精粉，以孢子液的形式加入。所述孢子液的制备方法为：低温保藏的拉斯坦毛霉HZ-6-27接种于马铃薯葡萄糖(PDA)平板 培养基上，于28–30℃恒温培养36–60h后，加无菌生理盐水于培养物中，用接种环搅 动使孢子悬浮，获得孢子液；优选将孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢 子浓度为1.5×107–2.0×107个/mL。所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L (切成边长约1cm的小方块，煮沸20min后过滤留汁)，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， 溶剂为自来水，pH自然(实测6.5左右)。
进一步，所述黄精水提浓缩物的制备方法为：黄精发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–5h，然后转入水温70–80℃的超声波清洗机中，100–200W超声 提取60–120min；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液60℃减压浓缩至原体积的 1/20–1/15，获得浓缩物；所述发酵物中去离子水体积加入量以发酵前黄精粉质量计为 20–30mL/g。
进一步，所述黄精多糖的制备方法为：向浓缩物中加入3–4倍体积的95％乙醇，4℃条件下静置12–16h后，4℃条件下8000r/min离心10–15min，收集沉淀，于50℃真空 干燥至恒重，得黄精多糖提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种新菌株—拉斯坦 毛霉HZ-6-27，该菌株是针对能够水解黄精植物组织而有目的筛选获得，它能利用黄精为基质快速生长，且产糖苷酶能力强。在从黄精中提取多糖前，增加拉斯坦毛霉HZ-6-27 微生物发酵预处理，它在黄精粉中适度生长，产生多种水解酶，能够协同水解黄精中的 纤维素、半纤维素、木质素和蛋白质等物质，有助于与这些物质结合的黄精多糖溶出， 从而能够显著提高多糖的提取得率。较不采用发酵预处理的常规方法相比，黄精多糖的 提取得率提高93.5％。
(四)附图说明
图1为拉斯坦毛霉HZ-6-27的菌落形态照片；A为24h；B为48h。
图2为葡萄糖质量浓度—A490标准曲线。
图3为对硝基苯酚浓度—A400标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明实施例所述的黄精是百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum)植物黄精(Polygonatum sibiricum)的干燥根茎。所述的黄精粉是自然晾干的黄精，切片后于60℃烘干，经粉碎过40目筛的细粉。本发明所述的室温为25–30℃。
实施例1：发酵黄精的微生物菌株分离和筛选
发酵黄精的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)250-mL三角瓶中加入10g的黄精粉，再加入2mL无菌生理盐水润湿，于28℃ 恒温培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃ 恒温培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于28℃恒 温培养60h，得纯培养菌株11株，各菌株的编号见表1。
(2)11个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅 动使孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为1.5×107– 2.0×107个/mL，即为各菌株的孢子液。
(3)12只160℃、2h干热灭菌的250-mL三角瓶中，分别加入10g黄精粉，再分 别加入4mL无菌生理盐水和1mL步骤(2)制备的各菌株孢子液，或用1mL无菌水 代替孢子液接种做空白发酵对照。搅拌均匀后，三角瓶用8层纱布扎口，于28℃条件下 培养60h，获得黄精发酵物。
(4)步骤(3)经各菌株发酵的全部黄精粉中，各加入200mL去离子水(原三角 瓶中)，搅拌均匀于30℃水浴中酶解5h，然后转入70℃的超声波清洗机中，100W超 声提取60min。超声水提结束后，趁热用布氏漏斗抽滤，采用苯酚-硫酸法测定滤液中 可溶性多糖含量。
经不同菌株发酵的黄精粉，以及接种1mL蒸馏水的空白发酵对照和未经发酵的对照，多糖的提取得率见表1。
表1经不同菌株发酵的黄精多糖提取得率
由表1数据可以看出，接种1mL生理盐水的空白发酵，以及多数菌株的发酵，黄 精多糖的提取得率并未显著提高，说明用于发酵黄精以提高多糖提取得率的微生物菌株 有种属的特异性。黄精经HZ-6菌株发酵后，多糖提取得率为19.5％，较未经发酵对照 的12.4％相比，提高的幅度最高，达到了57.3％，本发明选定HZ-6菌株作为提高黄精 多糖提取得率的发酵菌种。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成边长约为1cm的小方块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸20min，4层纱布过滤去渣，滤液 补足到1000mL，加入20g葡萄糖和20g琼脂，pH自然(实测6.5左右)，加热至琼脂 溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm的无菌培 养皿，每皿15–20mL。
所述的黄精多糖含量采用苯酚-硫酸法测定，具体方法为：黄精多糖提取液用蒸馏水做适当倍数稀释(测定的A490在0.2–0.8之间)；或固体黄精多糖提取物用蒸馏水配制 成质量浓度为0.1mg/mL的样品溶液。吸取样品溶液2mL于25-mL比色管中，加1mL 体积浓度为5％的苯酚水溶液，摇匀后迅速加入2.5mL浓硫酸(质量浓度98％)，摇匀 后室温放置10min，沸水浴中加热15min，流水冷却至室温。以2mL蒸馏水作为空白 对照的相同处理为参比，测定490nm波长下的吸光度(A490)。以相同方法测定不同葡 萄糖质量浓度样品的A490，绘制葡萄糖质量浓度—A490标准曲线(图2)，得回归方程， 由回归方程计算测定黄精多糖样品中多糖含量。
所述的黄精多糖提取得率按以下公式计算：
实施例2：发酵菌株HZ-6的诱变选育
对菌株HZ-6进行诱变育种，筛选发酵黄精性能优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株HZ-6经PDA平板培养基28℃活化培养48h后，加5mL 无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮后，转入含45mL无菌生理盐水的三角瓶中(加 有约50粒玻璃珠)，室温振荡10min。孢子悬液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部放一小 团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍 数稀释，调整孢子数量为1.18×106个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.0mL上述孢子悬液于直径6cm的培养皿中， 培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射 1、2、3、4、5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移 取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板 作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于28℃培养24h，对 平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得47个菌株。各个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接 种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。吸取各菌株的孢子液1mL，接入50mL 产酶培养基中，于28℃、200r/min恒温振荡条件下产酶培养72h后，发酵液用布氏漏 斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的β-葡萄糖苷酶活力。选择酶活力提高幅度较 大的菌株10株，再按实施例1方法，用这10个菌株发酵黄精，超声水提法提取多糖， 测定提取液中的多糖含量。复筛的突变菌株发酵的黄精多糖提取得率见表2。
表2复筛的突变菌株发酵的黄精多糖提取得率
从表2数据可以看出，在复筛的10个菌株中，编号为HZ-6-27的菌株，发酵产β- 葡萄糖苷酶的活力为19.4U/mL，较野生菌株HZ-6的13.3U/mL提高了48.1％，用该菌 株发酵黄精后，多糖提取得率为26.3％，较野生菌株HZ-6的19.5％提高了34.9％，较未 经发酵对照的12.4％提高了112％。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：乳糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸粉5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，初始 pH自然(实测为6.0)。250-mL三角瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽 121℃灭菌20min。
所述的β-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8mL、5mmol/L 的对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液0.2mL(pH 6.0、0.2mol/L的磷酸缓冲 液配制)，于35℃下反应15min后，加入2mL的1mol/L Na2CO3水溶液摇匀以终止反 应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于400nm波长下测定吸光度(A400)。由对 硝基苯酚(pNP)浓度—A400标准曲线(图3)计算出反应体系中pNP浓度。
β-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：35℃下、pH 6.0缓冲体系中，l min内水解pNPG生成1μmol pNP的酶量为1个酶活单位。
酶活按以下公式(1)计算。
式(1)中，V1：反应体系总体积；C1：pNP浓度；V2：粗酶液体积；T：反应时间。
对硝基苯酚浓度—A400标准曲线的制作：用蒸馏水配制浓度为1mmol/L的pNP标 准溶液。分别吸取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL至l0 mL容量瓶中，用l mol/L Na2CO3水溶液定容后混匀，使各样品中对硝基苯酚的浓度为10、20、30、40、50μmol/L。以 蒸馏水为空白，测定在400nm波长处的吸光值，以对硝基苯酚浓度为横坐标，A400为 纵坐标，绘制对硝基苯酚浓度—A400标准曲线。
实施例3：菌株HZ-6-27的分类鉴定
菌株HZ-6-27划线接种在PDA平板培养基上，28℃培养24h，沿接种线两侧长出 灰色菌丝，菌丝直长。28℃培养48h，菌落厚度约5mm，有透明渗出液，不分泌色素。 菌丝稠密，无假根，孢子梗直立，分枝较多。孢子囊球形，壁潮湿，直径为40–70μm。 孢囊孢子在大小和形状上变化较大，呈球形或椭圆形，大小4–12μm×5–16μm。菌株 HZ-6-27在PDA平板培养基上28℃培养24h(A)和48h(B)的菌落照片见图2。
测得菌株HZ-6-27的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行 BLAST比对，与已知的拉斯坦毛霉(Mucor lusitanicus)典型菌株CBS108.17有99.77％ 的同源性。根据菌株HZ-6-27菌落形态特征和rDNA-ITS核苷酸序列比对结果，可以确 定菌株HZ-6-27的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，毛霉门(Mucoromycota)，毛霉亚门(Mucoromycotina)，毛霉纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，毛霉属(Mucor)，拉 斯坦毛霉(Mucor lusitanicus)。
所述的ITS区rDNA序列(SEQ ID NO.1)为：
CATTATCTATTTACTGTGAAACGTATTATTACTTGACGCCTGAGGGATGTTCC ATTGCTATAAGGATAGGCAGCGGAAATGTTAACCGAGTCATAATCAAGCTTAGGC TTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGAC GTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGAT GAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATC GAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAG TATCAAAACAAACCCTCTATCCAACTTTTGTTGAATAGGATGACTGAGAGTCTCTT GATCGTCAGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGAT。
综上，从黄精粉的微生物富集物中分离的菌株HZ-6，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株HZ-6-27，即拉斯坦毛霉(Mucor lusitanicus)HZ-6-27，该菌株保藏于广东省微 生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62072，保藏日期2021年11月17日，地 址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：拉斯坦毛霉HZ-6-27应用于黄精多糖的提取
拉斯坦毛霉HZ-6-27应用于黄精多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)冷冻干燥保存的拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基上，于28℃恒温培养48h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使孢子悬 浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为1.43×107个/mL。所述 的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)10g黄精粉置于经160℃、2h干热灭菌的500-mL三角瓶中，再加入4mL无 菌生理盐水，接种步骤(1)制备的拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子液1mL(孢子接种浓度为 1.43×106个/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于30℃条件下培养54h，获得黄 精发酵物。
(3)向步骤(2)经制备的全部黄精发酵物中，加入250mL的去离子水，搅拌均匀 后，置于30℃水浴中酶解4.5h。之后，三角瓶转入水温75℃的超声波清洗机中，150W 超声提取90min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液60℃减压浓缩至15mL， 获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入45mL的95％乙醇，4℃条件下静置 12h后，4℃条件下8000r/min离心10min，收集多糖沉淀，50℃真空干燥至恒重，研 磨成细粉，得黄精多糖提取物。
按上述步骤，从10g黄精粉中获得4.11g的多糖提取物，多糖含量为62.8％，即得到黄精多糖2.58g，提取得率为25.8％，产品为灰白色粉状物。
实施例5：拉斯坦毛霉HZ-6-27应用于黄精多糖的提取
拉斯坦毛霉HZ-6-27应用于黄精多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的拉斯坦毛霉HZ-6-27的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养 基上，于30℃恒温培养42h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使 孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为1.83×107个/mL。 所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)10g黄精粉置于经160℃、2h干热灭菌的500-mL三角瓶中，再加入4.5mL 无菌生理盐水，接种步骤(1)制备的拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子液1mL(孢子接种浓度 为1.83×106个/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于32℃条件下培养48h，获得 黄精发酵物。
(3)向步骤(2)经制备的全部黄精发酵物中，加入300mL的去离子水，搅拌均匀 后，置于35℃水浴中酶解4h。之后，三角瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，200W 超声提取120min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将滤液60℃减压浓缩至15mL， 获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入60mL的95％乙醇，4℃条件下静置 14h后，4℃条件下8000r/min离心10min，收集多糖沉淀，50℃真空干燥至恒重，研 磨成细粉，得黄精多糖提取物。
按上述步骤，从10g黄精粉中获得4.08g的多糖提取物，多糖含量为65.4％，即得到黄精多糖2.67g，提取得率为26.7％，产品为灰白色粉状物。
实施例6：拉斯坦毛霉HZ-6-27应用于黄精多糖的提取
拉斯坦毛霉HZ-6-27应用于黄精多糖的提取，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的拉斯坦毛霉HZ-6-27的PDA平板孢子，接种于新鲜PDA平板培养 基上，于30℃恒温培养36h，加10mL的无菌生理盐水于培养皿中，用接种环搅动使 孢子悬浮，孢子液转移到无菌试管中，用无菌生理盐水调整孢子浓度为1.68×107个/mL。 所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)50g黄精粉置于经160℃、2h干热灭菌的500-mL三角瓶中，再加入25mL无 菌生理盐水，接种步骤(1)制备的拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子液5mL(孢子接种浓度为 1.68×106个/g)，搅拌均匀。三角瓶用8层纱布扎口，于32℃条件下培养48h，获得黄 精发酵物。
(3)步骤(2)经制备的全部黄精发酵物，按质量平均分装到3只1-L的三角瓶中， 三角瓶中各加500mL的去离子水，搅拌均匀后，置于35℃水浴中酶解4h。之后，三角 瓶转入水温80℃的超声波清洗机中，200W超声提取120min。超声水提结束后，趁热 布氏漏斗抽滤，将全部的滤液于60℃减压浓缩至75mL，获得浓缩液。
(4)向步骤(3)获得的全部浓缩液中，加入300mL的95％乙醇，4℃条件下静置 16h后，4℃条件下8000r/min离心15min，收集多糖沉淀，50℃真空干燥至恒重，研 磨成细粉，得黄精多糖提取物。
按上述步骤，从50g黄精粉中获得21.3g的多糖提取物，多糖含量为63.7％，即得到黄精多糖13.6g，提取得率为27.2％，产品为灰白色粉状物。
对比例1：常规超声水提法提取黄精多糖
(1)50g的黄精粉，按质量平均分装到3只1-L的三角瓶中，三角瓶中各加500mL 的去离子水，搅拌均匀后，置于35℃水浴中保温4h。之后，三角瓶转入水温80℃的超 声波清洗机中，200W超声提取120min。超声水提结束后，趁热布氏漏斗抽滤，将全 部的滤液于60℃减压浓缩至75mL，获得浓缩液。
(2)向步骤(1)获得的全部浓缩液中，加入300mL的95％乙醇，4℃条件下静置 16h后，4℃条件下8000r/min离心15min，收集多糖沉淀，50℃真空干燥至恒重，研 磨成细粉，得黄精多糖提取物。
按对比例1步骤，从50g的黄精粉中提取获得黄精粗多糖11.4g，多糖含量为61.5％， 即得到黄精多糖7.01g，提取得率为14.0％，产品为灰白色粉状物。
比较实施例6和对比例1方法可以看出：在黄精超声水提多糖前，增加拉斯坦毛霉HZ-6-27发酵预处理，较不采用发酵预处理的常规超声水提法相比，黄精多糖的提取得 率由14.0％提高到27.2％，提高了93.5％。
序列表
<110> 浙江树人学院（浙江树人大学）
<120> 拉斯坦毛霉HZ-6-27及其在黄精多糖提取中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 429
<212> DNA
<213> 拉斯坦毛霉(Mucor lusitanicus)
<400> 1
cattatctat ttactgtgaa acgtattatt acttgacgcc tgagggatgt tccattgcta 60
taaggatagg cagcggaaat gttaaccgag tcataatcaa gcttaggctt ggtatcctat 120
tattatttac caaaagaatt cagaattaat attgtaacat agacgtaaaa aatctataaa 180
acaactttta acaacggatc tcttggttct cgcatcgatg aagaacgtag caaagtgcga 240
taactagtgt gaattgcata ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcaa cttgcgctca 300
ttggtattcc aatgagcacg cctgtttcag tatcaaaaca aaccctctat ccaacttttg 360
ttgaatagga tgactgagag tctcttgatc gtcagatctc gaacctcttg aaatgtacaa 420
aggcctgat 429

Claims (6)

1.拉斯坦毛霉（Mucor lusitanicus）HZ-6-27，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No: 62072，保藏日期2021年11月17日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
2.一种权利要求1所述拉斯坦毛霉HZ-6-27在黄精多糖提取中的应用，其特征在于，所述应用的方法为：黄精粉中加入无菌生理盐水，接种拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子，搅拌均匀后于30–32℃发酵48–60 h，得黄精发酵物；向黄精发酵物中加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–5 h，经超声水提后过滤，滤液浓缩，获得浓缩物；再将浓缩物加乙醇沉淀，沉淀物真空干燥后，获得黄精多糖。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述无菌生理盐水体积用量以黄精粉重量计为0.4–0.5 mL/g；所述拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子接种量以黄精粉重量计为1.5×106–2.0×106个/g；所述黄精粉是将黄精烘干粉碎后过40目筛获得。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述拉斯坦毛霉HZ-6-27孢子接种黄精粉，以孢子液的形式加入，所述孢子液的制备方法为：低温保藏的拉斯坦毛霉HZ-6-27接种于PDA平板培养基上，于28–30℃恒温培养36–60 h后，加无菌生理盐水于培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，获得孢子液；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200 g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20 g/L，溶剂为自来水，pH自然。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述浓缩物的制备方法为：黄精发酵物加入去离子水，搅拌均匀后于30–35℃酶解4–5 h，然后转入水温70–80℃的超声波清洗机中，100–200 W超声提取60–120 min；超声水提结束后，趁热过滤，将滤液60℃减压浓缩至原体积的1/20–1/15，获得浓缩物；所述发酵物中去离子水体积加入量以发酵前黄精粉重量计为20–30 mL/g。
6.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述黄精多糖的制备方法为：向浓缩物中加入3–4倍体积的95％乙醇，静置12–16 h后，4℃条件下8000 r/min离心10–15 min，收集沉淀，于50℃真空干燥至恒重，得黄精多糖提取物。
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