CN116115675B - 一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2‑16经产酶培养基培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；将粗酶液与枇杷叶粉混合，于40–45℃条件酶解4–5h，再往酶解体系中加入粗酶液体积2.0–2.5倍的无水乙醇超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；总黄酮提取液经减压蒸干，乙醇溶解、离心和真空干燥，得总黄酮提取物。本发明提供的枇杷叶微生物酶解方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从枇杷叶中提取总黄酮的得率可以提高35.8％。

Description

一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法
(一)技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉一种微生物酶解技术在提取枇杷叶总黄酮中的应用。
(二)背景技术
枇杷(Eriobotrya japonica)，又名卢桔、卢橘、金丸，为蔷薇科常绿小型乔木，在我国大部分地区均有分布，主产于福建、浙江、江苏、湖北等地。枇杷果实是一种颇受人喜爱的水果，近年来全国种植枇杷的面积逐渐扩大，枇杷的花、叶、果核及果梗均可入药。历版《中华人民共和国药典》一部中的药材均收载了枇杷叶，枇杷叶性味苦，微寒，归肺、胃经。具清肺止咳，降逆止呕的功能，主治肺热咳嗽，气逆喘急，胃热呕逆，烦热口渴。中成药枇杷叶膏是枇杷叶沸水煎煮后浓缩的浸膏，用于治疗肺热燥咳，痰少咽干。近年来，国内外对枇杷叶的化学成分和药理作用研究较多，其主要含有挥发油、三萜类、倍半萜类、黄酮类、多酚类和多糖类等化合物。在枇杷叶的众多化学成分中，黄酮类化合物具有突出的生物活性，在抗氧化、抗衰老、治疗心脑血管疾病、降血脂等药用保健方面有显著功能。我国枇杷树种植面积大，每年修剪产生大量废弃叶片，从枇杷叶中提取黄酮，应用于药物、功能食品和饲料等具有良好的经济意义。
植物总黄酮的提取方法主要有水提取法、碱水提取法、有机溶剂提取法和CO2超临界提取法等，在前3种方法的基础上，又有辅以超声波、高压、微波和酶解等强化提取的方法。不同提取方法有各自的优缺点，如水提取法成本低，但总黄酮得率也较低，提取物中含有大量的多糖和蛋白质；有机溶剂提取法常用乙醇提取，优点是提取得率较高，但乙醇的消耗量较大；超声或微波辅助提取法在水提或乙醇提取法的基础上，增加超声或微波处理，促进黄酮溶出，提取得率有一定的提高；CO2超临界萃取法提取的总黄酮纯度较高，但提取得率往往不高，而且设备要求比较高。目前应用最多的方法是超声辅助乙醇提取法，总黄酮的提取得率和纯度较高，乙醇可以回收重复利用，超声波的使用成本也较低。
近年来，酶解辅助植物有效成分的提取有较多的应用，它是用纤维素酶、果胶酶或蛋白酶等预处理植物原料，可使植物细胞壁成分(纤维素、半纤维素、木质素、果胶和蛋白质等)水解，有利于有效成分在提取时释放，从而提高产物的提取得率。用酶解辅助枇杷叶总黄酮提取也有研究报道，如来丽丽等用纤维素酶辅助提取枇杷叶总黄酮，得率较普通提取法提高了3.5倍[来丽丽,杨荣兵,王桢煜,等.纤维素酶辅助提取枇杷叶总黄酮的工艺研究.甘肃中医学院学报,2015,32(6):26-29.]。
用纯酶预处理植物原料，酶的使用量往往较大，其成本不容忽视，而且植物细胞壁由多种成分构成，单用一种酶水解难以取得非常理想的效果。为了提高酶解提取的效果，许多研究采用复合酶法，就是同时使用纤维素酶、果胶酶和蛋白酶等2种及2种以上的酶，虽然可以显著提高产物提取得率，但多种酶的使用，无疑增加了提取成本。
微生物产生酶的能力非常强大，尤其是一些放线菌和霉菌，可以产生多种分解植物组织的水解酶，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶、果胶酶和蛋白酶等。因此，如果利用某种微生物在合适的条件下培养，发酵液中含有大量的水解酶，利用发酵液(粗酶液)直接水解植物原料，这些酶能协同分解细胞壁成分，从而有利于有效成分的释放，能显著提高提取得率；而且，使用未经分离纯化的粗酶液，降低了酶的成本。
为了提高枇杷叶总黄酮的提取得率，本发明用微生物发酵制备的粗酶液酶解枇杷叶，可使枇杷叶总黄酮的提取得率大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，将微生物酶解技术应用于枇杷叶总黄酮的超声提取，枇杷叶经微生物发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮的提取得率可以大幅度提高。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，所述方法为：(1)垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2-16经产酶培养基培养，获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；所述垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2-16，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62907，保藏日期2022年10月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070；(2)将粗酶液与枇杷叶粉混合，于40–45℃条件酶解4–5h，再往酶解体系中加入无水乙醇超声提取，抽滤，得总黄酮提取液；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，乙醇溶解、离心和真空干燥，得总黄酮提取物。
进一步，所述步骤(1)中的垫状青霉EJ2-16发酵制备粗酶液的方法为：将垫状青霉EJ2-16孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200–250r/min振荡培养64–72h，发酵液过滤，滤液即为粗酶液；所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉40–50g/L，蛋白胨5–6g/L，(NH4)2SO44–5g/L，KH2PO4 3–5g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，CaCl2 0.3–0.5g/L，FeSO4·7H2O0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5。
进一步，优选所述产酶培养基组成为：玉米粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH6.0。
本发明所述垫状青霉EJ2-16在产酶培养前，需要先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得垫状青霉EJ2-16孢子液，按体积分数5％–6％的量接入产酶培养基进行培养，具体产酶培养方法为：
①孢子液制备：将垫状青霉EJ2-16接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板培养基，于30℃培养72–80h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得垫状青霉EJ2-16孢子液；所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的质量浓度配制，pH自然(实测6.5)，高压蒸汽121℃灭菌20min。
②产酶培养：用步骤①活化培养后垫状青霉EJ2-16孢子液按体积分数5％–6％的接种量，接入产酶培养基，于30℃、200–250r/min振荡培养64–72h，获得干菌体浓度为4.25–4.61g/L、纤维素酶活力为92.8–96.7U/mL的发酵液。
进一步，所述步骤(2)中的粗酶液体积用量以枇杷叶粉质量计为6–10mL/g[即料酶比为1:6–1:10(g:mL)]；所述枇杷叶粉是新鲜枇杷叶，自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。
进一步，所述步骤(2)中总黄酮提取液的制备方法为：所述的枇杷叶酶解结束后，往体系中加入粗酶液体积2.0–2.5倍的无水乙醇，使体系中乙醇体积分数达到66.7％–71.4％，料液比为1:21–1:30(g:mL)。摇匀后置于水浴温度为70–75℃的超声波清洗机中，100–200W提取60–90min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液。
进一步，所述步骤(3)中从总黄酮提取液中回收总黄酮的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入体积为原料枇杷叶质量计0.5–1.0mL/g的无水乙醇，充分振荡后于8000r/min离心5–10min，上清液转入到洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：在枇杷叶乙醇超声提取总黄酮前，增加了微生物发酵制备的粗酶液酶解。所用的产酶微生物垫状青霉EJ2-16，是针对能够水解枇杷叶细胞壁而有目的筛选得到，经产酶培养的粗酶液中含有多种水解酶，能够协同水解枇杷叶中的纤维素和果胶等物质，使细胞壁破损，有助于黄酮类物质溶出，总黄酮的提取得率显著提高。本发明提供的枇杷叶微生物酶解方法，较直接采用乙醇超声提取法相比，从枇杷叶中提取总黄酮的得率可以提高35.8％。
(四)附图说明
图1为垫状青霉EJ2-16在PDA上30℃培养4d的菌落照片。
图2为分光光度法测定总黄酮的标准曲线。
图3为DNS法测定葡萄糖的标准曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明所述的枇杷叶是蔷薇科植物枇杷树(Eriobotrya japonica)的叶片，采自浙江工业大学莫干山校区校园内，枇杷叶粉是新鲜枇杷叶，自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。
实施例1：产酶微生物菌株的分离和筛选
用于制备粗酶液酶解枇杷叶的微生物菌株，按如下步骤分离和筛选获得：
(1)250-mL三角烧瓶中加入10g的枇杷叶粉，加入18mL无菌生理盐水搅拌均匀，于30℃培养72h。将长满霉菌的富集培养物用无菌生理盐水分别稀释1×10-6、1×10-7、1×10-8倍后，分别吸取0.1mL稀释液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于30℃培养48h，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，于30℃培养72h，得纯培养菌株9株，各菌株的编号见表1。
(2)9个菌株的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。
(3)取步骤(2)制备各菌株的孢子液2.5mL接入50mL产酶培养基中(接种量为5％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下产酶培养72h后，全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液。
(4)9只50-mL离心管中分别加入1g枇杷叶粉，加入步骤(3)制备的各菌株粗酶液10mL[料酶比为1:10(g:mL)]，摇匀后于40℃酶解5h，得枇杷叶酶解物。
(5)步骤(4)经各个菌株粗酶液酶解的全部枇杷叶酶解物中，分别加入20mL的无水乙醇[2.0倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数66.7％，料液比1:30(g:mL)]，摇匀后置于70℃水浴的超声波清洗机中，100W超声提取90min，趁热布氏漏斗抽滤，收集滤液，分光光度法测定其中的总黄酮含量。
从步骤(4)开始，1g的枇杷叶粉，加入10mL未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做未酶解对照；1g的枇杷叶粉，加入10mL活力为2000U/mL纤维素酶磷酸盐缓冲液(pH 6.0，0.2mol/L)做纤维素酶解对照。经不同菌株粗酶液酶解的枇杷叶及对照的总黄酮提取得率见表1。
表1不同菌株粗酶液酶解的枇杷叶及对照的总黄酮提取得率
由表1数据可以看出，枇杷叶经EJ2菌株发酵制备的粗酶液酶解后，总黄酮提取得率为8.44％，较未经酶解的对照7.12％相比，总黄酮提取得率提高了18.5％。用纤维素酶处理枇杷叶，也能显著提高总黄酮的提取得率(7.63％)，较未经酶解的对照提高了7.16％，但远不如EJ2菌株发酵制备的粗酶液。枇杷叶经过多数微生物菌株的粗酶液酶解后，总黄酮的提取得率并未提高，甚至有所下降，如EJ4菌株。以上结果说明用于酶解枇杷叶以提高总黄酮提取得率的微生物产酶菌株有选择性，不仅要求能产酶水解枇杷叶细胞壁成分，还要求不能产酶降解黄酮。本发明选定EJ2菌株作为提高枇杷叶总黄酮提取得率的产酶菌种。
所述的PDA平板培养基是成品马铃薯葡萄糖琼脂培养基，购自青岛海博生物技术有限公司，用自来水按46g/L的质量浓度配制，pH自然(实测6.5)，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入直径9cm无菌培养皿，每皿15–20mL。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法为：玉米粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。250-mL三角烧瓶装50mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述的总黄酮含量采用分光光度法测定，具体方法为：2.5mL总黄酮提取液(视样品中总黄酮浓度高低适当调整取样量，控制测定A510＝0.2–0.8之间，固体总黄酮粗提物用60％乙醇水溶液溶解)，于10-mL刻度试管中，加入质量浓度5％亚硝酸钠(NaNO2)水溶液0.4mL，静置6min，加浓度质量10％硝酸铝[Al(NO3)3]水溶液0.6mL，静置6min，加浓度质量20％氢氧化钠(NaOH)水溶液2mL，再用体积分数分数60％乙醇水溶液定容至10mL，摇匀，放置15min，于分光光度计测定波长510nm处的吸光度(A510)，由芦丁标准曲线(图2)计算得样品中总黄酮浓度，再由浓度乘以测定样品的体积得总黄酮质量。
芦丁标准曲线的绘制：用体积分数60％乙醇水溶液配制浓度为0.25g/L的芦丁标准品溶液。分别取芦丁标准品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于10-mL刻度试管中，用分数60％乙醇水溶液补充至2.5mL，加入质量浓度5％亚硝酸钠水溶液0.4mL，静置6min，加质量浓度10％硝酸铝水溶液0.6mL，静置6min，加质量浓度20％氢氧化钠水溶液2mL，再用分数60％乙醇水溶液定容至10mL，摇匀，放置15min，于分光光度计测定波长510nm处的吸光度(A510)。以芦丁浓度为横坐标，A510为纵坐标绘制标准曲线(图2)。
所述的从枇杷叶中提取总黄酮得率按以下公式计算：
实施例2：产酶菌株EJ2的诱变选育
对菌株EJ2进行诱变育种，筛选产酶性能更加优良的菌株，具体方法为：
(1)孢子液的制备：菌株EJ2经PDA平板培养基30℃活化培养64h后，加5mL无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮。移取1mL孢子液到装有50mL无菌生理盐水的三角烧瓶中(加有20–30粒玻璃珠)，室温振荡15min。孢子液经过滤除去菌丝(三角漏斗底部塞一小团脱脂棉)，在显微镜下用血球计数板对孢子液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，调整孢子数量为1.82×107个/mL。
(2)诱变：在红光照明下，分别取1.5mL上述孢子液和一枚无菌回形针于5只直径6cm的培养皿中，培养皿分别置于磁力搅拌器上，在预热30min的15W紫外灯距离30cm处，分别照射1、2、3、4、5、6min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后，分别移取0.1mL涂布PDA平板培养基。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。接种后的PDA平板用黑布包裹，倒置于30℃培养48h，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。
(3)筛选：挑取致死率在90％以上PDA平板上的菌落转接新鲜PDA平板培养基上，获得45个菌株。各个菌株经30℃培养72h的新鲜平板培养物中，分别加入10mL无菌生理盐水，用接种环搅动使得孢子悬浮，得各菌株的孢子液。取各菌株的孢子液2.5mL，接入50mL产酶培养基中，于30℃、200r/min振荡培养72h后，发酵液用布氏漏斗抽滤，收集滤液，测定各菌株发酵滤液的纤维素酶活力。选择酶活较野生菌株提高幅度相对较高的菌株15株。按实施例1方法，用这15个菌株发酵的粗酶液酶解枇杷叶，乙醇超声提取总黄酮。经复筛突变菌株粗酶液酶解的枇杷叶总黄酮提取得率见表2。
表2经复筛突变菌株粗酶液酶解的枇杷叶总黄酮提取得率
从表2数据可以看出，在复筛的15个菌株中，编号为EJ2-16的菌株，产纤维素酶的活力为94.2U/mL，较野生菌株EJ2的72.8U/mL提高了29.4％，用该菌株发酵制备的粗酶液酶解枇杷叶后，总黄酮提取得率为9.47％，较野生菌株EJ2的8.44％提高了12.2％，较未经酶解的对照7.12％提高了33.0％。所以，本发明选定EJ2-16菌株作为提高枇杷叶总黄酮提取得率的产酶菌株。
所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。
所述的纤维素酶活力测定：10-mL刻度试管中分别加入1.5mL的10g/L羧甲基纤维素钠溶液(pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液配制)和0.5mL粗酶液，50℃水浴保温30min，然后加入3mL DNS试剂，煮沸5min，流水冷却后加去离子水定容至10mL，摇匀；用100℃煮沸10min后失活的粗酶液做相同处理为参比，于分光光度计测定波长540nm处吸光度(A540)。由葡萄糖标准曲线(图3)计算样品中的葡萄糖浓度，再而计算纤维素酶活力(U/mL)。纤维素酶活力的定义：在pH 6.0、50℃条件下，每分钟水解羧甲基纤维素钠生成1μg葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位(U)。
纤维素酶活力按以下公式(1)计算。
式(1)中，C：由标准曲线计算得的葡萄糖浓度(mg/mL)；V1：酶反应体系体积，即2mL；T：反应时间，即30min；V2：粗酶液体积，即0.5mL。
葡萄糖标准曲线的绘制：6支10-mL刻度试管中，分别加入浓度为1mg/mL的标准葡萄糖水溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，然后各加入pH 6.0，0.2mol/L磷酸缓冲液2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8mL，再各加入DNS溶液3.0mL，混合液于沸水浴中煮沸5min，流水冷却后用去离子水定容至10mL，摇匀，于分光光度计测定A540，以葡萄糖浓度为横坐标，A540为纵坐标绘制标准曲线(图3)。
DNS试剂的配制：6.3g的3,5-二硝基水杨酸、262mL浓度为2mol/L的NaOH水溶液加入到500mL含有182g酒石酸钠的热水溶液中，再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加去离子水定容至1L，贮于棕色瓶中，7d后使用。
实施例3：菌株EJ2-16的分类鉴定
菌株EJ2-16划线接种在PDA平板培养基上，30℃培养2d，菌落正面灰白色，呈较厚的絮状菌丝层，培养3d后，菌落逐渐变为土黄色，有皱褶，表面有粉红色斑块，反面深黄色，无气味。分生孢子梗从基质菌丝伸出，有对称的分枝，具有典型的青霉属霉菌的帚状分生孢子头；分生孢子球形，直径2.5–3.0μm，壁光滑。菌株EJ2-16在PDA平板培养基上30℃培养4d的菌落照片见图1。
测得菌株EJ2-16的rDNA-ITS核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该序列在NCBI(National Center for Biotechnology Information,https://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行BLAST比对，与垫状青霉(Penicillium pulvillorum)典型菌株CBS 280.39的rDNA-ITS序列有99.04％的同源性，菌株EJ2-16菌落形态也符合垫状青霉的特征，所以，可以确定菌株EJ2-16的生物学分类位置为(参考Mycobank，http://www.mycobank.org)：真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，子囊菌亚门(Pezizomycotina)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)，散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)，散囊菌目(Eurotiales)，曲霉科(Aspergillaceae)，青霉属(Penicillium)，垫状青霉(Penicillium pulvillorum)。
所述的ITS区rDNA序列为：
GGGTCACCTCCCACCCGTGTTTATCGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCTCACGGCCGCCGGGGGGCATCCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACACCATTGAACTCTGTCTGAAGATTGCAGTCTGAGCGATTAGCTAAATCAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGCCCCCCGGTCTCGGGGGGCGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCCCGCCGGCGACCCCAAATCAATCTATCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。
综上，从枇杷叶粉微生物富集物中分离到菌株EJ2，经紫外线诱变后，筛选获得了菌株EJ2-16，即垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2-16，该菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:62907，保藏日期2022年10月20日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编510070。
实施例4：利用垫状青霉EJ2-16酶解辅助提取枇杷叶中的总黄酮
利用垫状青霉EJ2-16酶解辅助提取枇杷叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：
(1)冻干管保存的垫状青霉EJ2-16孢子粉，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养80h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得垫状青霉EJ2-16的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)用步骤(1)制备的孢子液5mL接种100mL产酶培养基(接种量为5％的体积分数)，于30℃、200r/min振荡条件下培养72h，得干菌体浓度为4.61g/L的发酵液(共2瓶)。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为93.7U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和pH同实施例1，250-mL三角烧瓶装100mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)10g枇杷叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)方法制备的粗酶液100mL[料酶比为1:10(g:mL)]，摇匀后于40℃酶解5h，得枇杷叶酶解物。
(4)步骤(3)全部枇杷叶酶解物中，加入200mL无水乙醇[2倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数66.7％，料液比1:30(g:mL)]，摇匀后置于70℃水浴的超声波清洗机中，功率100W超声提取90min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL乙醇(按原料枇杷叶粉质量计的1.0mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液转入到1只洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物1.99g，总黄酮含量为46.5％，即得到总黄酮0.925g，提取得率为9.25％。
对比例1：未经酶解的枇杷叶总黄酮提取(与实施例4对比)
(1)10g枇杷叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入300mL体积分数66.7％的乙醇水溶液[料液比1:30(g:mL)]，摇匀后置于70℃水浴的超声波清洗机中，功率100W超声提取90min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加10mL乙醇(按原料枇杷叶粉质量计的1.0mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心5min，上清液转入到1只洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物1.62g，总黄酮含量为43.8％，即得到总黄酮0.710g，提取得率为7.10％。
比较实施例4和对比例1的结果可以看出：在提取枇杷叶总黄酮前，增加了垫状青霉EJ2-16发酵制备的粗酶液酶解处理，总黄酮的提取得率由7.10％提高到9.25％，提高了30.3％。
实施例5：利用垫状青霉EJ2-16酶解辅助提取枇杷叶中的总黄酮
利用垫状青霉EJ2-16酶解辅助提取枇杷叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的垫状青霉EJ2-16 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养76h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得垫状青霉EJ2-16的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)用步骤(1)制备的孢子液6mL接种100mL产酶培养基(接种量为6％的体积分数)，于30℃、250r/min振荡条件下培养68h，得干菌体浓度为4.53g/L的发酵液(共3瓶)。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为96.7U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
(3)25g枇杷叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)方法制备的粗酶液200mL[料酶比为1:8(g:mL)]，摇匀后于45℃酶解4.5h，得枇杷叶酶解物。
(4)步骤(3)全部枇杷叶酶解物中，按重量平均分装到2只500-mL的三角瓶中，各加200mL无水乙醇[2.0倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数66.7％，料液比为1:24(g:mL)]，摇匀后置于75℃水浴的超声波清洗机中，功率150W超声提取75min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加15mL乙醇(按原料枇杷叶粉质量计的0.6mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液转入到1只洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物5.05g，总黄酮含量为47.3％，即得到总黄酮2.39g，提取得率为9.56％。
对比例2：未经酶解的枇杷叶总黄酮提取(与实施例5对比)
(1)25g枇杷叶粉平均分配到2只500-mL三角烧瓶中，各加入300mL体积分数66.7％的乙醇水溶液[料液比为1:24(g:mL)]，摇匀后置于75℃水浴的超声波清洗机中，功率150W超声提取75min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加15mL乙醇(按原料枇杷叶粉质量计的0.6mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液转入到1只洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物3.95g，总黄酮含量为44.6％，即得到总黄酮1.76g，提取得率为7.04％。
比较实施例5和对比例2的结果可以看出：在提取枇杷叶总黄酮前，增加了垫状青霉EJ2-16发酵制备的粗酶液酶解处理，总黄酮提取得率由7.04％提高到9.56％，提高了35.8％。
实施例6：利用垫状青霉EJ2-16酶解辅助提取枇杷叶中的总黄酮
利用垫状青霉EJ2-16酶解提取枇杷叶中的总黄酮，可以按以下步骤操作：
(1)4℃保存的垫状青霉EJ2-16 PDA菌落孢子，接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃培养72h，加10mL无菌生理盐水于平板培养物中，用接种环搅动使孢子悬浮，得垫状青霉EJ2-16的孢子液。所述的PDA平板培养基成分和配制方法同实施例1。
(2)用步骤(1)制备的孢子液6mL接种100mL产酶培养基(接种量为6％的体积分数)，于30℃、250r/min振荡条件下培养64h，得干菌体浓度为4.25g/L的发酵液(共4瓶)。全部发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为粗酶液，滤液的纤维素酶活力为92.8U/mL。所述的产酶培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
(3)50g枇杷叶粉于500-mL三角烧瓶中，加入步骤(2)方法制备的粗酶液300mL[料酶比为1:6(g:mL)]，摇匀后于45℃酶解4h，得枇杷叶酶解物。
(4)步骤(3)全部枇杷叶酶解物，按重量平均分装到3只500-mL的三角瓶中，各加入250mL无水乙醇[2.5倍粗酶液体积，体系乙醇体积分数71.4％，料液比为1:21(g:mL)]，摇匀后置于75℃水浴的超声波清洗机中，功率200W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(5)步骤(4)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加25mL乙醇(按原料枇杷叶粉质量计的0.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液平均分配到2只洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物9.72g，总黄酮含量为47.4％，即得到总黄酮4.61g，提取得率为9.22％。
对比例3：未经酶解的枇杷叶总黄酮提取(与实施例6对比)
(1)50g枇杷叶粉平均分配到3只500-mL三角烧瓶中，分别加入350mL体积分数71.4％的乙醇水溶液[料液比为1:21(g:mL)]，摇匀后置于75℃水浴的超声波清洗机中，功率200W超声提取60min，布氏漏斗抽滤，得总黄酮提取液。
(2)步骤(1)制备的总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa减压蒸馏至无液体流出，加25mL乙醇(按原料枇杷叶粉质量计的0.5mL/g)，充分振荡后转入离心管中，于8000r/min离心10min，上清液平均分配到2只洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
按上述步骤，得总黄酮提取物7.56g，总黄酮含量为45.7％，即得到总黄酮3.46g，提取得率为6.92％。
比较实施例6和对比例3的结果可以看出：在提取枇杷叶总黄酮前，增加了垫状青霉EJ2-16发酵制备的粗酶液酶解处理，总黄酮提取得率由6.92％提高到9.22％，提高了33.2％。

Claims (5)

1.一种微生物酶解辅助提取枇杷叶总黄酮的方法，其特征在于，所述方法为：(1)垫状青霉(Penicillium pulvillorum)EJ2-16孢子接种于产酶培养基中，于30℃、200–250r/min振荡培养64–72h，获得的发酵液过滤，收集的滤液为粗酶液；所述垫状青霉EJ2-16保藏编号：GDMCC No:62907；所述产酶培养基终浓度组成为：玉米粉40–50g/L，蛋白胨5–6g/L，(NH4)2SO4 4–5g/L，KH2PO4 3–5g/L，MgSO4·7H2O 0.5–1.0g/L，CaCl2 0.3–0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1–0.2g/L，溶剂为自来水，pH 6.0–6.5；(2)将粗酶液与枇杷叶粉混合，于40–45℃条件酶解4–5h，再往酶解体系中加入粗酶液体积2.0–2.5倍的无水乙醇，使体系中乙醇体积分数达到66.7％–71.4％，摇匀后置于水浴温度为70–75℃的超声波清洗机中，100–200W提取60–90min；超声醇提结束后，趁热抽滤，得总黄酮提取液；粗酶液体积用量以枇杷叶粉质量计为6–10mL/g；(3)总黄酮提取液经减压蒸干，乙醇溶解、离心和真空干燥，得总黄酮提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述垫状青霉EJ2-16在产酶培养前，先经平板培养基培养产生孢子，然后将孢子悬浮于生理盐水中，获得垫状青霉EJ2-16孢子液，按体积分数5％–6％的量接入产酶培养基进行培养，孢子液按如下方法制备：将垫状青霉EJ2-16接种于PDA平板培养基，于30℃培养72–80h，获得平板培养物；平板培养物中加入无菌生理盐水，用接种环搅动使孢子悬浮，获得垫状青霉EJ2-16孢子液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)产酶培养基组成为：玉米粉40g/L，蛋白胨6g/L，(NH4)2SO4 4g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，CaCl2 0.5g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，溶剂为自来水，pH 6.0。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述枇杷叶粉是新鲜枇杷叶，自来水洗净后85℃烘干，粉碎后过40目筛的细粉。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中从总黄酮提取液中回收总黄酮的方法为：总黄酮提取液于45℃、–0.1MPa条件下蒸馏至无液体流出，加入体积为原料枇杷叶质量计0.5–1.0mL/g的无水乙醇，充分振荡后于8000r/min离心5–10min，上清液转入到洁净培养皿中，50℃、–0.1MPa真空干燥，得总黄酮提取物。
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