CN111218406B - 卷枝毛霉mf-8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用 - Google Patents

卷枝毛霉mf-8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种卷枝毛霉MF‑8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用，将卷枝毛霉MF‑8经产酶培养的发酵液过滤，取滤液为粗酶液，加入经粉碎的土茯苓粉，在30‑35℃的振荡条下转化反应24‑36h，过滤除去粗酶液，滤饼经烘干，即得富含花旗松素的土茯苓。本发明筛选的卷枝毛霉MF‑8使土茯苓中的花旗松素含量提高幅度大，最高可达28.1倍，含量由原来的0.247mg/g提高到7.19mg/g；本发明具有专一性好，产物得率高，生物催化剂的成本低的优势，实现土茯苓中药效成分原位转化。

Description

卷枝毛霉MF-8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用
(一)技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种采用生物转化法提高土茯苓中花旗松素含量的方法。
(二)背景技术
花旗松素(taxifolin)又名黄杉素、二氢槲皮素、紫杉叶素，分子式为C15H12O7，分子量为304.25，CAS号为480-18-2，化学名为3,5,7,3',4'–五羟基黄烷酮(3,5,7,3',4'-pentahydroxy flavanone)结构式见图1。
研究表明，花旗松素在人体中具有多种活性，如选择性免疫抑制、抗炎、镇痛、抗菌、降血糖、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等。花旗松素是食品工业的一种新的抗氧化剂，它的抗氧化能力可以与许多天然及合成的抗氧化剂相媲美，大剂量使用没有发现它有毒性反应，也没有实验发现它对胎儿有致畸、致过敏和致突变作用，可用作保健品或食品添加剂。2017年2月14日，欧盟食品安全局就落叶松提取物(花旗松素) 作为新资源食品发布意见，批准富含花旗松素的落叶松提取物用作非酒精饮料、酸奶和巧克力糖果等的添加剂。
目前，天然花旗松素只在紫杉、黄杉、落叶松中有发现，纹母树、野黑樱中也有极少量存在。因紫杉和黄杉已列入全球濒危树种禁止采伐，而落叶松只分布在俄罗斯西伯利亚东部、蒙古国东北部、中国东北地区和朝鲜，且生长周期较长，所以，用于提取生产花旗松素的资源极为稀少和匮乏。而它的糖苷，包括落新妇苷(astilbin， CAS号29838-67-3)、新落新妇苷(neoastilbin，CAS号54081-47-9)、异落新妇苷 (isoastilbin，CAS号54081-48-0)、新异落新妇苷(neoisoastilbin，CAS号54141-72-9) 在自然界广泛存在，特别是在土茯苓、紫荆花中含量较高，如《2015年药典》规定中药材土茯苓中落新妇苷的含量不得低于0.45％。所以，以落新妇苷为原料，水解切除二糖残基而转化为花旗松素，则是一条可行的生产方法。
采用微生物发酵的含糖苷酶的粗酶液处理土茯苓，因粗酶液中含多种类型的糖苷酶，可以将土茯苓中所含的落新妇苷及其异构体都转化成花旗松素，其含量可大幅度提高，而且微生物发酵产生的多糖水解酶对植物组织结构的纤维素和半纤维素降解，使土茯苓植物组织疏松，从而有利于花旗松素的释放。经过转化处理的土茯苓，既可作为中药饮片应用于中药方剂；也可以作为花旗松素提取的原料，提取率将大幅度提高。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—卷枝毛霉(Mucorcircinelloides) MF-8菌株，及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用。经转化处理的土茯苓中，花旗松素的含量显著提高，可达7.19mg/g，工艺具有成本低、流程简单、转化率高等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—卷枝毛霉(Mucor circinelloides)MF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60920，保藏日期2019年12月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510070。
本发明所述卷枝毛霉MF-8菌株，是从中药材土茯苓的微生物富集培养物中分离，经过筛选得到的优良菌株，其核糖体18s rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。所述卷枝毛霉MF-8的形态特征如下：在马铃薯琼脂平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为灰白色绒毛状，1天后灰色略有加深，表面产生灰色孢子。光学显微镜下可以观察到分生孢子梗单生，繁密成层，直立，全部顶生孢子囊，孢子囊较大，球形，略带褐色，孢囊孢子球形，直径4–5μm。卷枝毛霉MF-8菌株在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图2。
本发明还提供一种所述卷枝毛霉MF-8提高土茯苓中花旗松素含量的应用，所述应用的方法为：将卷枝毛霉MF-8经产酶培养的发酵液过滤，取滤液为粗酶液，加入经粉碎的土茯苓粉，在30–35℃的振荡条下转化反应24–36h，过滤除去粗酶液，滤饼经烘干，即得富含花旗松素的土茯苓。
进一步，所述粗酶液的制备方法为：将卷枝毛霉MF-8接种于产酶培养基中，于 28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养2–3d，将发酵液过滤，收集滤液，即为粗酶液；所述的产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1–2g/L，葡萄糖20–40g/L，酵母浸粉10–15g/L，蛋白胨5–10g/L，NaNO3 10–16g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L， MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O0.5g/L，溶剂为自来水，初始pH 5.0–7.0。
进一步，优选所述产酶培养基组成为：落新妇苷1g/L，葡萄糖40g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，NaNO3 16g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L， MnSO4·H2O0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.5。
进一步，所述转化反应条件为30–35℃、150–200r/min条件下振荡24–36h。
进一步，所述粗酶液体积加入量以土茯苓重量计为10–50mL/g，所述土茯苓在加入前需粉碎过80目筛，粒径约为0.2mm。
进一步，所述滤饼干燥条件为85–105℃、6–10h，优选85℃。
具体的，所述利用卷枝毛霉MF–8糖苷酶提高土茯苓中花旗松素含量的方法为：
将卷枝毛霉MF-8菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至产酶培养基中， 28–30℃、150–200r/min振荡培养2–3d，过滤除去菌体，取滤液得粗酶液；向粗酶液中加入过80目筛的土茯苓颗粒，于30–35℃、150–200r/min条件下培养24–36h，过滤弃去粗酶液，滤饼经85–105℃烘干6–10h，即得富含花旗松素的土茯苓。
本发明所述卷枝毛霉MF-8在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶培养，所述卷枝毛霉MF-8产酶发酵培养方法为：
(1)活化培养：将卷枝毛霉MF-8接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养 2–3d，获得卷枝毛霉MF-8孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯蔗糖琼脂培养基) 终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子接种至种子培养基中，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养1–2d，得种子液；所述种子培养基组除不含琼脂外，成分和制备方法同步骤(1)中的PDA培养基；
(3)产酶发酵培养：用步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子，或步骤(2) 制备的种子液按体积浓度3％–5％(优选5％)的接种量接入产酶培养基，于28–30℃、 150–200r/min恒温振荡条件下培养2–3d，获得发酵液；所述产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1–2g/L，葡萄糖20–40g/L，酵母浸粉10–15g/L，蛋白胨5–10g/L，NaNO3 10–16g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，初始pH 5.0–7.0。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明筛选的卷枝毛霉MF-8使土茯苓中的花旗松素含量提高幅度大，最高可达28.1倍，含量由原来的0.247 mg/g提高到7.19mg/g；(2)相比于酸水解法，具有专一性好，产物得率高；相比于纯酶法转化，生物催化剂的成本低，且可使土茯苓中落新妇苷的异构体转化为花旗松素，其含量提高幅度大；(3)实现土茯苓中药效成分原位转化，经处理的土茯苓作为花旗松素提取的原料，也可以作为中药饮片使用。
(四)附图说明
图1落新妇苷及其异构体转化为花旗松素的化学反应式。
图2卷枝毛霉MF-8菌落照片。
图3HPLC法分析土茯苓中花旗松素浓度的标准曲线。
图4对硝基苯酚(pNP)标准曲线。
图5卷枝毛霉MF-8糖苷酶转化处理的土茯苓甲醇提取液HPLC分析图谱。
图6未转化处理的土茯苓甲醇提取液HPLC分析图谱。
图7标准品花旗松素的HPLC分析图谱(溶于甲醇，浓度0.2g/L)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所述的土茯苓(Smilacis Glabrae Rhizoma)为植物光叶菝葜(Smilax glabra Roxb)的干燥根茎，购自广州清平中药材市场，产地广东肇庆。植物光叶菝葜属于被子植物门(Angiospermae)、单子叶植物纲(Monocotyledones)、百合目(Liliales)、百合科(Liliaceae)、菝葜属(Smilax)。
实施例1
250-mL三角瓶中加入约20g经85℃干燥并粉碎过80目筛的土茯苓，再加入少量无菌水润湿，于28℃恒温培养4d。将长满霉菌的富集物用无菌水稀释1×106倍后涂布于PDA平板培养基上，于28℃恒温培养3d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA培养基，置于28℃恒温培养3d，得纯培养菌株10株，分别予以编号MF-1到 MF-10，保藏于4℃冰箱中备用。
所述的PDA平板培养基为马铃薯蔗糖琼脂培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入蔗糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min后倒入无菌培养皿，冷却后备用。
用接种环挑取上述各个菌株平板培养基上孢子，接入100mL初始产酶培养基中，于30℃、150r/min恒温振荡条件下产酶培养3d后，100mL发酵液用布氏漏斗抽滤，收集的滤液即为糖苷酶粗酶液。取50mL粗酶液于250-mL三角瓶中，再加入1g土茯苓粉，于30℃、150r/min振荡24h后过滤，滤饼85℃烘干6h，HPLC分析花旗松素含量。同样条件下，用50mL的未接种微生物的产酶培养基代替粗酶液做阴性对照；用50mL的2mol/L的盐酸水溶液代替粗酶液做盐酸水解对照。
HPLC分析经不同菌株发酵的糖苷酶粗酶液转化的土茯苓中花旗松素含量，结果见表1。10个菌株中，编号为MF-8菌株的糖苷酶转化处理土茯苓后，花旗松素含量提高的幅度最大，由未转化时的0.247mg/g提高到2.79mg/g，提高了10.3倍；相比之下，用2mol/L盐酸水溶液处理土茯苓，土茯苓素的含量提高了6.45倍，远不如MF-8菌株糖苷酶转化后提高的幅度。
表1不同菌株来源的糖苷酶转化提高土茯苓中花旗松素含量
Figure BDA0002362012860000051
所述的初始产酶培养基按如下组成和方法配制：麦芽糖6g/L，酵母浸出粉3g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，初始pH自然(实测为5.9)。250-mL三角瓶装100mL产酶培养基， 8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
菌株MF-8接种在PDA平板培养基上，28℃条件下培养，菌落初期为灰白色绒毛状，1天后灰白色加深，表面产生灰色孢子。光学显微镜下可以观察到分生孢子梗单生，繁密成层，直立，全部顶生孢子囊，孢子囊较大，球形，略带褐色，孢囊孢子球形，大小4–5μm。菌株MF-8在PDA平板培养基上28℃培养2d的菌落照片见图2。
将菌株MF-8交由生工生物工程(上海)有限公司鉴定，测得其核糖体18s rDNA核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，根据菌株MF-8菌落特征和核糖体18s rDNA核苷酸序列比对，确定菌株MF-8为一株卷枝毛霉(Mucor circinelloides)，即为卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)MF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No: 60920，保藏日期2019年12月18日，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
所述的花旗松素HPLC分析方法为：1g土茯苓于20mL的甲醇中，于室温、40KHz、100W条件下超声提取30min；过滤得甲醇提取液，依据提取液中花旗松素含量的高低，用甲醇作适当倍数稀释后，经0.45μm微孔滤膜过滤后HPLC法分析。HPLC分析条件为：LC–20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温；体积比43:57的甲醇和水等度洗脱，流速0.8mL/min，检测波长290nm，进样量15μL。由相同分析条件下的标准品花旗松素浓度—峰面积标准曲线(图3)，计算出土茯苓中的花旗松素的含量。
实施例2
以实施例1筛选获得的卷枝毛霉MF-8菌株为转化菌种，经种子扩大培养，发酵制备糖苷酶粗酶液转化处理土茯苓，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的卷枝毛霉MF-8平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子2环至种子培养基中，于30℃、150r/min振荡条件下培养1d，得到种子液。所述种子培养基组除不含琼脂外，成分和制备方法同步骤(1)中的PDA，250-mL三角瓶装50mL种子培养基，8 层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液按体积浓度5％(5mL)的接种量接入100mL初始产酶培养基，于30℃、150r/min恒温振荡条件下培养2d，得干菌体浓度为5.21g/L，α-葡萄糖苷酶活力为0.833U/mL的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液。所述的初始产酶培养基终浓度组成为：麦芽糖6g/L，酵母浸出粉3g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，初始pH自然(实测为5.9)。250-mL三角瓶装100mL产酶培养基，8 层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)土茯苓(花旗松素含量0.247mg/g)85℃烘干，粉碎后过80目筛，1g加入到50mL步骤(3)制备的卷枝毛霉MF-8糖苷酶粗酶液中，30℃、150r/min振荡24h 后，过滤，滤饼85℃烘干6h，即得富含花旗松素的土茯苓。
HPLC分析表明，按本实施例方法，卷枝毛霉MF-8糖苷酶转化处理的土茯苓中，花旗松素含量为2.67mg/g，是未转化时0.247mg/g的9.81倍。重复3批次实验结果无显著性差异，表明卷枝毛霉MF-8用于转化处理土茯苓以提高花旗松素含量的产酶性能稳定。
所述的α-葡萄糖苷酶活力测定方法为：试管中依次加入粗酶液0.8mL、5mmol/L 的对硝基苯-α-葡萄糖苷(pNPG)0.2mL(pH 6.0、0.2mol/L的磷酸缓冲液配制)，于 35℃下反应15min后，加入2mL的1mol/L Na2CO3溶液摇匀以终止反应。以煮沸灭活的粗酶液相同处理为参比，于410nm波长下测定吸光度(A410)。由对硝基苯酚(pNP) 质量浓度—A410标准曲线(图4)计算出反应体系中pNP浓度。
α-葡萄糖苷酶活力单位(U)的定义：35℃下、pH 6.0缓冲体系中，l min内水解pNPG生成1μg pNP的酶量为1个酶活单位。
酶活按以下公式(1)计算。
Figure BDA0002362012860000071
式(1)中，V1：反应体系总体积；V2：粗酶液体积；C1：pNP浓度；T：反应时间。
实施例3
以卷枝毛霉MF-8菌株为转化菌种，在实施例2的基础上，以提高粗酶液中α-葡萄糖苷酶的活力为指标优化了产酶培养基组成，用优化后的培养基发酵制备卷枝毛霉 MF-8粗酶液原位转化土茯苓，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的卷枝毛霉MF-8斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃生化培养箱中培养2d。所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子2环至种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养1d，得到种子液。所述种子培养基组除不含琼脂外，成分和制备方法同步骤(1)中的PDA，250-mL三角瓶装50mL种子培养基，8 层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液按体积浓度5％(2.5mL)的接种量接入50mL产酶培养基，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为14.5g/L的发酵液，发酵液中α-葡萄糖苷酶活力为17.8U/mL。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液。所述产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1g/L，葡萄糖40g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，NaNO316g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L， MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，溶剂为自来水，pH 6.5。250-mL三角瓶装100mL 产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)土茯苓(花旗松素含量0.247mg/g)85℃烘干，粉碎后过80目筛，1g加入到50mL步骤(3)制备的卷枝毛霉MF-8糖苷酶粗酶液中，30℃、150r/min振荡24h 后，过滤，滤饼85℃烘干6h，即得富含花旗松素的土茯苓。
HPLC分析表明，按本实施例方法，卷枝毛霉MF-8糖苷酶转化处理的土茯苓中，花旗松素含量得到了显著的提高，从未转化时的0.247mg/g提高到7.19mg/g，提高了 28.1倍。
实施例4
以卷枝毛霉MF-8菌株为转化菌种，按实施例2方法制备卷枝毛霉MF-8糖苷酶粗酶液，提高了料液比、转化反应的温度和振荡转速，延长了转化时间，提高了生物转化工艺的时空产率，具体工艺步骤如下：
所述的卷枝毛霉MF-8糖苷酶粗酶液制备方法同实施例3。土茯苓85℃烘干，粉碎后过80目筛，5g加入到50mL上述卷枝毛霉MF-8的糖苷酶粗酶液中，35℃、200r/min 振荡36h后，过滤，滤饼85℃烘干10h，即得富含花旗松素的土茯苓。
HPLC分析表明，按本实施例方法，卷枝毛霉MF-8糖苷酶转化处理的土茯苓中，花旗松素含量得到了显著的提高，从未转化时的0.247mg/g提高到6.39mg/g，提高了 24.9倍。
实施例5
以卷枝毛霉MF-8为转化菌种，在实施例4的基础上，产酶发酵体系放大到300mL，转化体系放大到200mL，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保藏的卷枝毛霉MF-8斜面菌种接种于新鲜PDA平板培养基，于30℃生化培养箱中培养3d。所述的平板培养基组成和制备方法同实施例1。
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子2环至种子培养基中，于30℃、200r/min振荡条件下培养1d，得到种子液。所述种子培养基组除不含琼脂外，成分和制备方法同步骤(1)中的PDA，250-mL三角瓶装50mL种子培养基，8 层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)用步骤(2)制备的种子液按体积浓度5％(15mL)的接种量接入300mL 产酶培养基，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d。发酵液经布氏漏斗过滤除去菌体，得糖苷酶粗酶液。所述产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1g/L，葡萄糖40 g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，NaNO3 16g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L， MgSO4·7H2O 1g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.5。1-L的三角瓶装300 mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)土茯苓85℃烘干，粉碎后过80目筛，20g加入到200mL步骤(3)制备的卷枝毛霉MF-8糖苷酶粗酶液中，35℃、200r/min振荡36h后，过滤，滤饼85℃烘干 10h，即得富含花旗松素的土茯苓。
HPLC分析表明，按本实施例方法，卷枝毛霉MF-8糖苷酶转化处理的土茯苓中，花旗松素含量得到了显著的提高，从未转化时的0.247mg/g提高到6.24mg/g，提高了 24.3倍。
按本实施例方法，制备的土茯苓甲醇提取液HPLC分析图谱见图5，未转化处理的土茯苓甲醇提取液HPLC分析图谱见图6，标准品花旗松素的HPLC分析图谱(溶于甲醇，浓度0.2g/L)见图7。
序列表
<110> 浙江工业大学、舟山市食品药品检验检测研究院
<120> 卷枝毛霉MF-8及其提高土茯苓中花旗松素含量的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1304
<212> DNA
<213> 卷枝毛霉(Mucor circinelloides)
<400> 1
ttactacttg gataaccgtg gtaattctag agctaataca tgcaaaaaaa cccaaactta 60
cgaatgggtg cacttattag ataaagccaa cgctgggtaa aaccagtttc ccttggtgat 120
tcataataat taagcggatc gcatggcctt gtgctagcga cagtccactc gattttctgc 180
cctatcatgg ttgagattgt aagatagagg cttacaatgc ctacaacggg taacggggaa 240
ttagggttcg attccggaga gggagcctga gaaacggcta ccacatccaa ggaaggcagc 300
aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg acaataaata acaatgcagg 360
gcctttaagg tcttgcaatt ggaatgagta caatttaaat cccttaacga ggatcaattg 420
gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccaatagcgt atattaaagt 480
tgttgcagtt aaaacgtccg tagtcaaatt ttagtcttta gatgaggtgg cctggtcttc 540
attgatcaag ctcgctttta tcgagacttt ttttctggtt atgctatgaa tagcttcggt 600
tgtttatagt ctctagccag atgattacca tgagcaaatc agagtgttta aagcaggctt 660
tcaagcttga atgtgttagc atggaataat gaaatatgac tttagtccct atttcgttgg 720
ttcaggaact taagtaatga tgaatagaaa cggttgggga catttgtatt tggtcgctag 780
aggtgaaatt cttggattga ccgaagacaa actactgcga aagcatttga tccaggacgt 840
tttcattgat caaggtctaa agttaaggga tcgaagacga ttagataccg tcgtagtctt 900
aaccacaaac tatgccgact agagattggg cttgtttatt atgactagct cagcatctta 960
gcgaaagtaa agtttttggg ttctgggggg agtatgggac gcaaggctga aacttaaagg 1020
aattgacgga agggcaccac caggagtgga gcctgcggct taatttgact caacacgggg 1080
aaactcacca ggtccagaca tagtaaggat tgacagattg aaagctcttt ctagattcta 1140
tgggtggtgg tgcatggccg ttcttagttc gtggagtgat ttgtctggtt aattccgata 1200
acgaacgaga ccttattctg ctaaataggc aggtcaactt tttagttgat taatagattt 1260
atctatctgg cttcttagag agactatcgc tcagccgaag aatt 1304

Claims (9)

1.卷枝毛霉(Mucor circinelloides)MF-8，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60920，保藏日期2019年12月18日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510070。
2.一种权利要求1所述卷枝毛霉MF-8提高土茯苓中花旗松素含量的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：将卷枝毛霉MF-8经产酶培养的发酵液过滤，取滤液为粗酶液，加入经粉碎的土茯苓粉，在30–35℃的振荡条下转化反应24–36h，过滤除去粗酶液，滤饼经烘干，即得富含花旗松素的土茯苓。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述转化反应条件为30–35℃、150–200r/min条件下振荡24–36h。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述粗酶液体积加入量以土茯苓重量计为10–50mL/g，所述土茯苓在加入前需粉碎过80目筛。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述滤饼干燥条件为85–105℃、6–10h。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述粗酶液的制备方法为：将卷枝毛霉MF-8接种于产酶培养基中，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养2–3d，将发酵液过滤，收集滤液，即为粗酶液；所述的产酶培养基终浓度组成为：落新妇苷1–2g/L，葡萄糖20–40g/L，酵母浸粉10–15g/L，蛋白胨5–10g/L，NaNO3 10–16g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，初始pH 5.0–7.0。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述产酶培养基组成为：落新妇苷1g/L，葡萄糖40g/L，酵母浸粉10g/L，蛋白胨5g/L，NaNO3 16g/L，KH2PO4 5g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O1g/L，MnSO4·H2O 0.5g/L，溶剂为自来水，pH 6.5。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述卷枝毛霉MF-8在发酵前，需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液以体积浓度3％–5％的接种量接入产酶培养基进行产酶培养：
(1)活化培养：将卷枝毛霉MF-8接种于PDA平板培养基，于28–30℃恒温培养2–3d，获得卷枝毛霉MF-8孢子；所述的PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后卷枝毛霉MF-8孢子接种至种子培养基中，于28–30℃、150–200r/min恒温振荡条件下培养1–2d，得种子液；所述种子培养基组除不含琼脂外，成分和制备方法同步骤(1)中的PDA培养基。
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