CN107189949B - 米根霉ljh3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用 - Google Patents

米根霉ljh3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种米根霉LJH3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用，所述的应用是将米根霉LJH3经发酵培养后获得的发酵液，或发酵液过滤除去菌体的滤液和等体积蒸馏水的混合液为生物催化剂，以槐角苷为底物，构成转化体系，于30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得染料木素；本发明在底物投料浓度为1g/L时，染料木素的转化得率为84.2％，纯度为92.5％。本发明把低活性的槐角苷转化活性更好的染料木素，是一种可选的生产染料木素生产方法，工艺具有生产成本低、转化率高、环境污染小等优点。

Description

米根霉LJH3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用
(一)技术领域
本发明涉及一种以槐角苷为原料生物转化制备染料木素的方法。
(二)背景技术
染料木素(genistein)又称染料木黄酮、染料木因和金雀异黄素等，化学名5,7,4′-三羟基异黄酮(CAS号为446-72-0，分子式为C15H10O55，分子量为270.24)，属于异黄酮类化合物。染料木素具有雌激素样作用，并具有抗炎、抗生育和预防骨质疏松症的疗效，近年来不少学者对染料木素的生物活性进行了研究，发现其还具有抗氧化、降血脂、抗肿瘤和防治骨质疏松等生物活性。
染料木素以游离状态存在于一些豆科植物之中，如槐角、大豆、葛根、山豆根和金雀花等，因此可以从这些植物中分离获得，但其含量相对较低，如槐角中的染料木素含量在0.23～3.2mg/g之间。在上述植物中，染料木素更多的与葡萄糖结合成苷，即槐角苷(sophoricoside，CAS号为152-95-4，分子式为C21H20O10，分子量为432.37)，又名为槐苷、槐黄苷、染料木素-4′-葡萄糖苷(genistein 4′-β-D-glucopyranoside)，含量相对较高。如产自河北的槐角中，槐角苷的含量为69mg/g，而染料木素含量仅为3.2mg/g，相差20多倍(高秀叶，尹海龙，陈恒文，等.高效液相色谱法同时测定不同产地槐角中槐角苷和染料木素的含量.现代中药研究与实践，2013(2):73-76)。虽然槐角苷也具有多种生物活性，如清热泻火、凉血止血、清肝明目的功效等药理作用，但是其口服吸收效果较差。有研究报道，槐角苷在体内转化为染料木素后才能发挥效用。
可以看出，染料木素具有多重的药理活性，作为药物应用于临床疾病治疗的前景广阔，但缺乏经济有效的生产方法。如果以槐角苷为原料，水解切除葡萄糖残基而转化为染料木素，则是一条可行的生产方法。目前，已有酶法转化的研究报道，如采用β-糖苷酶水解大豆异黄酮的水解工艺，在大豆异黄酮浓度为0.5mmol/L时，染料木素的水解率可达94.2％(张永忠，李木子，孙艳梅，等.“Amano”β-糖苷酶水解大豆异黄酮技术的研究.食品科学，2008,29(5):254-258.)，但该方法使用日本产的商品级β-糖苷酶，成本无疑较高，且底物投料浓度较低，工业化应用存在一定困难；如果采用酸水解法，则存在母核结构容易被破坏，产生较多的副产物，导致产物收率低，分离纯化困难等问题。
为了开发一种经济有效的染料木素生产方法，本发明采用微生物法转化槐角苷为染料木素(反应式见图1)，筛选获得了一株转化能力高、专一性好的微生物菌株，经培养获得发酵液，以含菌体的发酵液或过滤除去菌体的滤液为生物催化剂，将槐角苷转化为染料木素，在底物浓度为1g/L时，转化得率可达80％以上。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株产糖苷酶的微生物新菌株—米根霉(Rhizopus oryzae)LJH3，及其在转化槐角苷制备染料木素中的应用。本工艺具有成本低、流程简单、转化得率高和副产物少等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新菌株—米根霉(Rhizopus oryzae)LJH3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
本发明所述米根霉LJH3，是从中药材槐角的富集培养物，经过筛选得到的优良菌株。所述米根霉LJH3的形态特征如下：在马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基上，28℃条件下培养2d，即长出菌落。菌落初期为白色细绒毛状，初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色；假根发达，分枝呈指状或根状，呈褐色；孢囊梗直立或稍弯曲，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色。
所述米根霉LJH3的18s rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供一种所述米根霉LJH3在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用，所述的应用是将米根霉LJH3经发酵培养后获得的发酵液，或发酵液过滤除去菌体的滤液和等体积蒸馏水的混合液为生物催化剂，以槐角苷为底物，构成转化体系，于30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得染料木素；所述槐角苷是以溶解于0.1mol/L的NaOH水溶液的形式加入，槐角苷在NaOH水溶液中的浓度为1～100g/L，优选100g/L。
进一步，所述催化剂用量以抽滤前发酵液中干菌体重量计为4～5g/L转化体系；所述底物槐角苷的终浓度为0.01～1g/L转化体系(优选1g/L)，其中转化体系的体积以发酵液或发酵液过滤后滤液与等体积蒸馏水混合液的体积计。
进一步，所述的转化反应条件为：在30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化20～24h。
进一步，所述发酵液按如下方法制备：将米根霉LJH3接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～10g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 5～7。
所述的米根霉LJH3菌株在发酵前，通常需要先经平板培养基活化培养制备孢子，或经过种子培养基扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养，所述米根霉LJH3发酵培养方法为：
(1)活化培养：将米根霉LJH3接种于PDA平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3d，获得米根霉LJH3孢子；所述的PDA平板培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然(实测6.5)；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，得种子液；所述种子培养基组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 5～7。优选的种子培养基组成为：酵母浸出粉9g/L，蛋白胨5g/L，麦芽糖8g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 6。
(3)发酵培养：用步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度2～5％的接种量接入发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液。所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 5～7。
进一步，优选所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7。
本发明所述的染料木素分离纯化的方法为：在生物转化反应结束后，转化体系用等体积的乙酸乙酯萃取1～3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，加入原转化体系体积1/4～1/5的甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，于45℃下减压干燥，(优选滤液转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加少量甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后)，即得染料木素。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种利用米根霉LJH3发酵获得生物催化剂，槐角苷为底物制备染料木素的方法。以槐角苷为底物，米根霉LJH3发酵制备粗酶液为催化剂，在底物投料浓度为1g/L时，染料木素的转化得率为84.2％，纯度为92.5％。本发明的技术优势有：(1)相比于从植物中提取染料木素，产物得率高，生产成本低；(2)相比于纯酶法转化，生物催化剂的制备成本低，底物投料浓度高，产物得率高；(3)相比于酸水解法转化，转化专一性好，转化效率高，副产物少。本发明把低活性的槐角苷转化活性更好的染料木素，是一种可选的生产染料木素生产方法，工艺具有生产成本低、转化率高、环境污染小等优点。
(四)附图说明
图1槐角苷转化为染料木素的化学反应式；
图2HPLC法分析染料木素浓度的标准曲线；
图3米根霉LJH3菌落照片；
图4转化样品的HPLC分析图谱，A为标准品槐角苷和染料木素的HPLC图谱；B为槐角苷转化0h的HPLC图谱；C为槐角苷经生物转化24h的HPLC图谱(实施例6样品)。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1转化菌种的分离与筛选
将中药材槐角粉碎过60目筛，10g槐角粉于三角瓶中，加入少量无菌水润湿，于28℃恒温培养4d，再加入90mL无菌水制成悬液，稀释1×106倍后涂布于马铃薯葡萄糖琼脂平板培养基(PDA)上，于28℃恒温培养4d，挑取颜色和形态不同的霉菌菌落转接新鲜PDA平板培养基，置于28℃恒温培养3d，得孢子丰富的菌株10株(菌株编号见表1)，保存于4℃冰箱中备用。
接种环分别挑取上述各个菌株的平板培养基上的孢子2环，接种到装有100mL初始发酵培养基中(250mL三角瓶装)，于30℃、200r/min振荡培养5d，1mg的槐角苷溶于1mL、0.1mol/L的NaOH水溶液中，再加入发酵液中，使转化体系中槐角苷浓度为10mg/L。转化体系于30℃、200r/min恒温振荡18h。转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用1mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中染料木素的浓度。
HPLC分析不同菌株发酵液转化样品中的染料木素浓度，计算染料木素的转化得率(表1)，由此比较不同菌株产酶转化槐角苷为染料木素的能力。10个菌株中，编号为LJH3的霉菌转化槐角苷生成染料木素得率最高，转化液中染料木素的浓度为1.49mg/L，转化得率为23.9％。
表1不同菌株转化槐角苷生成染料木素的浓度和得率
Figure BDA0001320316200000051
所述的中药材槐角(Sophorae Fructus)，是豆科植物槐(Sophora japonica)的干燥成熟果实，质量符合中国药典(2015版)要求。
所述的PDA平板培养基，按如下组成和方法配制：马铃薯洗净去皮切成小块，称取200g，加自来水1000mL，煮沸30min，4层纱布过滤去渣，滤液补足到1000mL，再加入葡萄糖20g、琼脂20g，pH自然(实测6.5)，加热至琼脂溶化后分装于三角瓶中，经高压蒸汽121℃灭菌20min，凝固前倒入无菌培养皿，每皿20～25mL。
所述的初始发酵培养基按如下组成和方法配制：蔗糖30g/L，NH4Cl 4g/L，NaCl5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，pH 7，溶剂为自来水，250mL的三角瓶装100mL初始发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
所述HPLC分析方法为：LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津仪器有限公司)，色谱柱为Phenomenex Luna C18柱(5μm，250mm×4.6mm)，柱温为室温；体积比60:40的甲醇和水等度洗脱，流速0.8mL/min，检测波长260nm，进样量15μL。由相同分析条件下的标准品染料木素浓度-峰面积标准曲线(图2)，计算出转化样品中的染料木素的浓度。
所述的染料木素转化得率按以下公式计算：
Figure BDA0001320316200000052
式中，270.24为染料木素的分子量，437.34为槐角苷的分子量。
实施例2：菌株LJH3转化稳定性验证
以菌株LJH3为转化菌种，在100mL摇瓶发酵规模下制备发酵液，用含菌体的发酵液转化槐角苷，验证菌种的转化稳定性，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的菌株LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后菌株LJH3孢子2次接种至100mL初始发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养5d，得干菌体浓度为4.18g/L的发酵液。1mg的槐角苷溶于1mL、0.1mol/L的NaOH水溶液中，再加入发酵液中，使转化体系中槐角苷的浓度为10mg/L。转化体系于30℃、200r/min恒温振荡20h。所述的初始发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例1。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用1mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中染料木素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，菌株LJH3发酵液转化槐角苷，重复3批次实验，转化样品中染料木素平均浓度为1.58mg/L，转化得率平均为25.6％，3批次实验结果无显著性差异，表明菌株LJH3发酵转化槐角苷为染料木素的性能稳定。
实施例3：菌株LJH3的分类鉴定
将LJH3菌株接于马铃薯琼脂平板培养基，置于30℃培养箱中培养3d，菌落稠密，最初呈白色，后变为灰褐色或黑褐色，菌丝匍匐爬行，假根发达，分枝呈指状或根状，呈褐色；孢囊梗直立或稍弯曲，与假根对生，有时膨大或分枝，呈褐色；囊轴呈球形或近球形或卵圆形，呈淡褐色。
将菌株LJH3交由生工生物工程(上海)有限公司进行18S rDNA测序，测得序列大小为600bp，具体序列(SEQ ID NO:1所示)如下：
CGGAAGGATCATTAATTATGTTAAAGCGCCTTACCTCTTAGGGTTTCCTCTGGGGTAAGTGATTGCTTCTACACTGTGAAAATTTGGCTGAGAGACTCAGACTGGTCATGGGTAGACCTATCTGGGGTTTGATCGATGCCACTCCTGGTTTCAGGAGCACCCTTCATAATAAACCTAGAAATTCAGTATTATAAAGTTTAATAAAAAACAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAGCTTGCACTCTATGGTTTTTCTATAGAGTACGCCTGCTTCAGTATCATCACAAACCCACACATAACATTTGTTTATGTGGTAATGGGTCGCATCGCTGTTTTATTACAGTGAGCACCTAAAATGTGTGTGATTTTCTGTCTGGCTTGCTAGGCAGGAATATTACGCTGGTCTCAGGATCTTTTTCTTTGGTTCGCCCAGGAAGTAAAGTACAAGAGTATAATCCAGCAACTTTCAAACTATGATCTGAAGTCAGGTGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATC。
将上述序列与Genbank中的序列进行BLAST比对，结果表明该菌株与5株米根霉同源性较高，相似度达到99％及以上。依据18SrDNA序列，绘制的LJH3菌株与米根霉其他种代表菌株系统发育树，表明LJH3菌株与已知的5株米根霉亲缘关系较近，而与根霉属的其他种亲缘关系较远，因此可以判断菌株LJH3是1株米根霉(Rhizopus oryzae)，命名为米根霉(Rhizopus oryzae)LJH3。该菌株已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCCNo:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
实施例4：优选转化工艺
以米根霉LJH3为转化菌种，在实施例2的基础上，优化了发酵培养基组成和pH，提高了底物浓度和转化温度，染料木素的转化得率有显著提高，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的米根霉LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子2次接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养5d后，得干菌体浓度为4.43g/L的发酵液。0.1g的槐角苷溶于1mL、0.1mol/L的NaOH水溶液加入100mL发酵液中，使转化体系中槐角苷的浓度为1g/L(转化体系体积按100mL计)。转化体系于38℃、250r/min恒温振荡20h。所述的发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7。250mL的三角瓶装100mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(4)转化反应结束后，转化液经布氏漏斗抽滤除去菌体，用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，再用甲醇稀释100倍后用HPLC分析样品中染料木素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，用米根霉LJH3菌株发酵液转化槐角苷，转化样品中染料木素浓度为0.520g/L，转化得率为84.1％。
实施例5：发酵滤液体系转化
以米根霉LJH3为转化菌种，在实施例4的基础上，发酵液经过滤后得到滤液为粗酶液，并加蒸馏水稀释1倍后用于槐角苷的生物转化，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的米根霉LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子2次接种至100mL发酵培养基中，于30℃、250r/min恒温振荡条件下培养5d后，得干菌体浓度为4.38g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤，取50mL滤液和50mL蒸馏水于250mL三角瓶中混合。0.1g的槐角苷溶于1mL、0.1mol/L的NaOH水溶液中，再加入100mL发酵液混合液中，使转化体系中槐角苷的浓度为1g/L(转化体系体积按100mL计)。转化体系于38℃、250r/min恒温振荡24h。所述的发酵培养基终浓度组成和配制方法同实施例4。
(3)转化反应结束后，转化液用100mL乙酸乙酯萃取1次，乙酸乙酯分液于圆底烧瓶中，减压蒸干乙酸乙酯后用5mL甲醇溶解残留物，经0.45μm微孔滤膜过滤，用甲醇稀释100倍后用HPLC分析样品中染料木素的浓度。
HPLC分析表明，按本实施例方法，用米根霉LJH3菌株发酵液转化槐角苷，转化样品中染料木素浓度为0.496g/L，转化得率为80.2％。相比于实施例4方法，转化得率略有降低，但发酵滤液稀释了1倍，节省了发酵液的使用，且转化体系不含菌体，有利于后续产物的分离。
实施例6：工艺放大与染料木素的分离
在实施例5的基础上，发酵体系放大到400mL，增加了LJH3种子扩大培养步骤。制备发酵液用于槐角苷的生物转化，转化体系放大到400mL，具体工艺步骤如下：
(1)将4℃冰箱中保存的米根霉LJH3平板菌种接种于新鲜PDA平板培养基，平板于30℃恒温培养2d，所述的PDA平板培养基组成和制备方法同实施例1；
(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子2次至50mL种子培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养3d，得干菌体浓度为3.67g/L的种子液。所述种子培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9g/L，蛋白胨5g/L，麦芽糖8g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，NaCl5g/L，溶解为自来水，初始pH 6，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
(3)步骤(2)种子液以体积浓度5％(即20mL)的接种量接种至400mL发酵培养基中，于30℃、200r/min恒温振荡条件下培养5d后，得干菌体浓度为5.03g/L的发酵液。发酵液经布氏漏斗过滤，取200mL滤液和200mL蒸馏水于1L三角瓶中混合，加入0.4g的槐角苷溶于4mL、0.1mol/L的NaOH水溶液中，再加入400mL发酵液混合液中，使转化体系中槐角苷的浓度为1g/L(转化体系体积按400mL计)。转化体系于38℃、250r/min恒温振荡24h。所述的发酵培养基终浓度组成同实施例4，1L的三角瓶装400mL发酵培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌25min。
(4)转化反应结束后，转化液用400mL乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液于圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，再加入50mL甲醇溶解残留物；甲醇溶液用滤纸过滤后，转入另一洁净圆底烧瓶中，45℃下减压蒸干甲醇后，加10mL甲醇溶解残留物，甲醇溶液转入洁净培养皿中，减压干燥后得0.225g干燥品。
称取步骤(4)制备的染料木素样品1mg溶解于5mL甲醇中，经0.45μm微孔滤膜过滤后，用HPLC分析样品中染料木素的浓度。分析结果表明，按本实施例方法，制备的染料木素纯度为92.5％，转化得率为84.2％。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江工业大学
<120> 米根霉LJH3及在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> Rhizopus oryzae
<400> 1
cggaaggatc attaattatg ttaaagcgcc ttacctctta gggtttcctc tggggtaagt 60
gattgcttct acactgtgaa aatttggctg agagactcag actggtcatg ggtagaccta 120
tctggggttt gatcgatgcc actcctggtt tcaggagcac ccttcataat aaacctagaa 180
attcagtatt ataaagttta ataaaaaaca acttttaaca atggatctct tggttctcgc 240
atcgatgaag aacgtagcaa agtgcgataa ctagtgtgaa ttgcatattc agtgaatcat 300
cgagtctttg aacgcagctt gcactctatg gtttttctat agagtacgcc tgcttcagta 360
tcatcacaaa cccacacata acatttgttt atgtggtaat gggtcgcatc gctgttttat 420
tacagtgagc acctaaaatg tgtgtgattt tctgtctggc ttgctaggca ggaatattac 480
gctggtctca ggatcttttt ctttggttcg cccaggaagt aaagtacaag agtataatcc 540
agcaactttc aaactatgat ctgaagtcag gtgggattac ccgctgaact taagcatatc 600

Claims (9)

1.米根霉(Rhizopus oryzae)LJH3，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60145，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
2.一种权利要求1所述米根霉LJH3在生物转化槐角苷制备染料木素中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将米根霉LJH3经发酵培养后获得的发酵液，或发酵液过滤除去菌体的滤液与蒸馏水等体积混合液作为生物催化剂，以槐角苷为底物构成转化体系，于30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下进行转化反应，转化反应结束后，将转化液分离纯化，获得染料木素；所述槐角苷是以溶解于0.1mol/L的NaOH水溶液的形式加入。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述生物催化剂用量以过滤前发酵液中干菌体重量计为4～5g/L转化体系；所述底物槐角苷的终浓度为0.01～1g/L转化体系。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的转化反应条件为：在30～38℃、200～250r/min恒温振荡条件下转化20～24h。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵液按如下方法制备：将米根霉LJH3接种至发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～10g/L，NaCl5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 5～7。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述米根霉LJH3在发酵前，先经平板培养活化制备孢子，或经种子扩大培养制备种子液，然后用孢子或种子液接入发酵培养基进行产酶培养：
(1)活化培养：将米根霉LJH3接种于PDA平板培养基，于28～30℃恒温培养2～3d，获得米根霉LJH3孢子；所述PDA平板培养基终浓度组成为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，溶剂为自来水，pH自然；
(2)种子扩大培养：挑取步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子接种至种子培养基中，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养2～3d，得种子液；所述种子培养基组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 5～7；
(3)发酵培养：用步骤(1)活化培养后米根霉LJH3孢子，或步骤(2)制备的种子液按体积浓度2～5％的接种量接入发酵培养基，于28～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养3～5d，获得发酵液；所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉9～12g/L，蛋白胨5～7g/L，麦芽糖8～11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，初始pH 5～7。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成为：酵母浸出粉12g/L，蛋白胨7g/L，麦芽糖11g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溶剂为自来水，pH 7。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化的方法为：在转化反应结束后，转化液用等体积的乙酸乙酯萃取1～3次，合并萃取液于45℃下减压蒸干乙酸乙酯后，加入原转化液体积1/4～1/5的甲醇溶解残留物；过滤，滤液于45℃下减压干燥，即得染料木素。
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