CN102816751B - 一种高活性壳聚糖酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，提供了一种高活性壳聚糖酶的分离纯化工艺，所涉及的微生物菌株为一株蜡状芽孢杆菌BacilluscereusJBSH-003,保藏号为CGMCC No.6129。本发明以该菌株为出发菌株，经液体或固体发酵制备壳聚糖酶粗酶，在一定条件下分离、纯化制备高纯度、高活力的食品级壳聚糖酶。该酶可应用于水解壳聚糖制备医药级、食品级壳寡糖。纯化的壳聚糖酶制剂酶活达25000U/g以上。该制备工艺简单、条件易控制，酶活收率高，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，提供了一种高活性壳聚糖酶及其分离纯化工艺。
背景技术
甲壳素有“人体生命第六大要素”之美誉，是地球上仅次于纤维素的第二大天然类高分子化合物。壳聚糖是几丁质脱乙酰后的产物，含有游离氨基，是天然多糖中唯一的碱性多糖，但由于壳聚糖水溶性差，难以发挥其应有的生物学活性，大大限制了壳聚糖的应用范围。近年来发现壳聚糖降解产物壳寡糖具有独特的生理功能，生物学活性是相等质量壳聚糖的10倍，因此，有关壳寡糖的研究已经受到各国政府和科研人员的高度重视。我国这方面的研究虽然起步较晚，但经过十几年的努力，在壳寡糖的制备和应用领域取得了丰硕的成果。传统化学方法生产壳寡糖存在环境污染等重大问题，而且反应条件不易控制，产品质量难以保证。
生物酶法制备壳寡糖具有反应条件温和、整个降解过程中无其他反应试剂加入、不至于发生其它副反应、降解过程及降解产物相对分子质量分布易于控制、壳寡糖得率高、不造成环境污染等优点，代表了壳寡糖制备工艺的发展方向。壳聚糖酶广泛分布于细菌、真菌、病毒以及植物等生物群中。国外对壳聚糖酶产生菌的许多菌株做了较多研究，报道较多的主要是酶的纯化、作用机理和理化性质方面。Isabelle Boucher等对链霉菌属菌株产壳聚糖酶进行了分离纯化和特性研究，所得纯化酶分子量为29.5kDa，该酶最适温度为65℃，最适pH值为5.5，能降解脱乙酰度在44％～99％的壳聚糖，但不能降解几丁质和纤维素。国内关于微生物壳聚糖酶的研究仍较少。孙金凤等从自然界中筛选到1株芽孢杆菌产酶活力为0.59U/mL，经硫酸二乙酯(DES)诱变处理后，得到1突变菌株，产酶活力达到1.60U/mL。孙玉英等报道了从土壤中分离得到的1株壳聚糖酶高产菌株，是目前国内报道中产酶量最多的菌株，经鉴定该酶属微杆菌Microbacterium，酶活力达到118U/mL，培养基初始pH值为6.3，培养温度为30℃,培养时间为96h。总之，经过国内外学者不断努力，近年来发现了许多产壳聚糖酶微生物菌株，也对一些重要的产壳聚糖酶菌株进行了深入研究，但总体来说，酶活力还普遍较低，产酶周期长，很难实现商品化，真正产酶量大、适用于工业化大规模生产的菌株尚未见报道。利用生物学方法和基因工程技术，筛选出产酶活性高、易于培养的壳聚糖酶工业菌种是解决制约生物酶法制备壳寡糖的关键所在。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种高活性壳聚糖酶的分离纯化工艺，所涉及的微生物菌株为一株蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus JBSH-003,保藏号为CGMCC No.6129。本发明以该菌株为出发菌株，经液体发酵制备种子液，再经液体发酵或固体发酵方法制备壳聚糖酶粗酶，在一定条件下分离、纯化制备纯度较高的高活力、食品级壳聚糖酶。该酶可应用于水解壳聚糖制备医药级、 食品级壳寡糖。纯化的壳聚糖酶制剂酶活达25000U/g以上。该制备工艺简单、条件易控制，酶活收率高，适合工业化生产。
本发明提供的具体技术方案是：
首先获得了一株新的菌株，该菌株分离自黄河三角洲地区的腐败落叶和浅表层土壤中，经UV和化学诱变剂的反复诱变处理筛选而来，为一株壳聚糖酶高产菌株。发明人最终确定该菌种为蜡状芽胞菌株，Bacillus cereus,并对其进行了生物保藏，其保藏号为CGMCC No.6129。并通过该菌株进行发酵后获得了壳聚糖酶。
经研究发现，该菌株所产壳聚糖酶对酸碱度适应范围较广，在pH值为4.5-6.5均表现很高的酶学活性；且该菌株所产酶在40℃-65℃温度范围内均具有较高的生物学活性；该菌株深层液体发酵粗酶活性为227U/mL，固体发酵粗酶活性高达2732U/g，固体发酵比深层液体发酵产酶水平高10倍以上。在培养基中有无壳聚糖均对其产酶能力不会产生太大的影响，证明该菌株具有非诱导产酶活性。
采用该菌株制备高活性壳聚糖酶精酶的制备方案如下：
（1）菌种发酵产酶：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用发酵方法生产得到壳聚糖酶粗酶液；
其中所述的发酵方法为液体发酵或固体发酵；
所述的粗酶液为液体发酵的发酵液，或固体发酵后的鲜料或干燥粉碎后的干料，用缓冲液抽提出的酶液；
（2）壳聚糖酶纯化：步骤（1）获得的粗酶液，经离心除杂、微滤除菌、超滤膜超滤浓缩得酶浓缩液，将所得到的浓缩液用乙醇醇沉，收集沉淀，得湿固酶；
（3）干燥：对湿固酶进行低温真空干燥，即得高活性壳聚糖精酶；
具体的方法如下：
1.菌种发酵产酶：
（1）菌种活化：将低温保存的CGMCC No.6129试管斜面菌种转移到室温条件下，对菌种活化4-8h；
（2）液体菌种扩繁：取活化的试管菌种，在无菌操作台上，用10mL灭菌蒸馏水将试管斜面表面的菌落冲洗入装有灭菌培养基的三角瓶中，每只试管接种1个三角瓶；33～35℃下振荡培养12-18h，转速50-300r/min得到液体菌种即种子液；
（3）固体发酵产酶：将步骤（2）制备的液体菌种，按0.5-10%（v/w）的接种量接入固体发酵的培养基中，培养温度为25～39℃，发酵时间40～100h，中间每隔15小时翻曲一次；固体发酵培养基原料为廉价易得的农作物副产品，具体按重量份计为：65～80份麸皮，10～20份豆粕，8～15份玉米粉，1～3份硫酸铵，固体物料与水的重量比为1:1.05～1.5；初始pH值自然；
（4）干燥粉碎：固体发酵培养结束后，对发酵湿固料进行低温真空干燥，温度不高于50℃，粉碎过80目筛后，得到高活性固体壳聚糖酶粗酶产品。
2.壳聚糖酶粗酶液的制取：
制取壳聚糖酶粗酶液的原料为干燥粉碎后的固体壳聚糖酶产品或直接用固体发酵完成后不经干燥的鲜料，用pH=4.0的含10-30%（w/w）硫酸铵酸性缓冲液或NaAC-HAC缓冲液或磷酸盐缓冲液在常温下进行提取，料液比1:10-40（w/v）（折合成干品计），时间1h-3h，过滤、离心或压滤去除固体残渣，收集滤液，即为壳聚糖酶的粗酶液。
壳聚糖酶的粗酶液生产还可用菌株直接采用液体三级发酵的方式获得。首先采用液体发酵的方法对活化的CGMCC No.6129试管斜面菌种进行扩繁，并以此为菌种再进行二级、三级液体发酵，逐级放大，放大比例为1:10；对三级发酵罐中的发酵液经高速离心去除固体残渣后即为壳聚糖酶的粗酶液。经检测菌株CGMCC No.6129深层液体发酵粗酶活性为227U/mL，所述三级发酵的方式均采用现有的技术完成。
3.壳聚糖酶的纯化：
（1）对液体发酵获得的发酵液或固体发酵提取获得的壳聚糖酶粗酶液经离心除杂，再进行微滤，进一步去除菌体和微小颗粒杂质，微滤液再经6000Dalton的超滤膜组件超滤浓缩，浓缩倍率为1/5-1/10，收集超滤内液；
（2）用95%的乙醇常温下进行醇沉，乙醇和超滤内液的体积比为2-3:1，过滤、离心或压滤，收集沉淀。
4.干燥：经步骤3沉淀析出的湿固酶在50℃条件下真空干燥，即为纯度较高的精酶。
提取过程中，利用乙酰丙酮法对每个步骤所得产物进行酶活测定，以固体壳聚糖酶粗酶的总活力为100%计算，每步操作完成后分别取样检测酶活，计算出每步操作后酶活力的回收率。结果显示整个工艺过程酶活的综合回收率为35%以上，所制得的精酶活性可以达到25000U/g以上。
本发明采用了自主筛选的高活性壳聚糖酶生产菌株，所制备的壳聚糖酶酶活可达2732U/g。该酶温度和酸碱度适应范围广，在40-65℃范围内均具有较高的生物学活性，在pH值4.5-6.5之间均有很强的酶学活性。而且针对该菌株的特性设计酶提取工艺，该工艺既不需要复杂的设备，也不需要特定的操作环境，大部分生化企业均可以生产。
本发明中采用95%的乙醇常温条件下进行醇沉，不需要对乙醇进行预冷处理和添加保护剂，节约了制冷操作费用和操作时间，且酶活收率没有因此受到显著的影响。一般酶制剂提纯过程中需要控制严格的低温环境、所用有机溶剂和待提取的粗酶液均需要进行低温处理。本发明的制备工艺可大幅度降低处理成本。
综上所述，本发明提供了一种温度和酸碱度适应范围广，在40℃-65℃范围内均具有较高的生物学活性，在pH值4.5-6.5之间均有很强的酶学活性的壳聚糖酶，其生产工艺既不需要复杂的设备，也不需要特定的操作环境，大部分生化企业均可以生产，可以广泛的推广。
保藏信息
保藏时间：2012年5月22日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏编号：CGMCC No.6129
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所
分类命名:蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
酶活性检测：DNS法。
壳聚糖酶配制：取制备的壳聚糖精酶1g，溶解到80ml蒸馏水中，定容到100ml，得到壳聚糖酶溶液。
准确称取0.1g壳聚糖粉末于试管中，加10mL0.2M的乙酸溶液，制成1%的壳聚糖溶液，震荡10min，于50℃水浴中保温10min。准确量取上述配制的壳聚糖酶溶液1mL，加入壳聚糖溶液的试管中，50℃下保温30min，用NaOH溶液调节pH值到8，离心去除沉淀。吸取上清液1mL，加入9mL 2M/mL的盐酸，100℃水解2h，DNS法测定其还原糖含量，计算得到酶活。以每分钟内产生1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活单位U。
实施例2固体发酵
固体发酵产酶培养基组成及培养条件的确定
采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量、装料量和培养时间，确定了液体种子最佳培养条件和固体发酵最佳产酶条件；采用单因子试验和正交试验，通过改变培养的碳氮源和无机盐组成确定该菌株液体种子最佳培养基组成和固体发酵的最佳产酶培养基组成。
通过上述试验方法确定的固体发酵培养基组成和产酶条件：
固体培养基组成成分，按重量份计为：65～80份麸皮，10～20份豆粕，8～15份玉米粉，1～3份硫酸铵，固体物料与水的重量比为1:1.05～1.5；
固体发酵条件：接种量为5%（v/m），pH值自然，培养温度为33～35℃，发酵时间40～50h，中间每隔15h翻曲一次。
具体的固体发酵方法如下：
菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的CGMCC No.6129试管斜面菌种移至室温条件下（20-25℃）活化4-8h；
液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的CGMCC No.6129试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，1只试管菌种接种1个三角瓶，培养温度33～35℃，摇床转速150r/min，培养时间为12～18h，得到种子液；
其中种子培养基组成按重量份计为：1～3份牛肉膏，0.5～1份酵母粉，1～2份葡萄糖，0.5-1份硫酸铵，3～5份豆粕，2～3份玉米粉，85-92份软化水；
将上述获得的种子液，也就是液体菌株，按照确定的固体发酵条件进行固体发酵，固体发酵结束以后，将壳聚糖酶鲜料于50℃条件下真空干燥，粉碎并过 80目筛，得到高活性固体壳聚糖酶粗酶产品。
实施例3液体发酵
液体发酵产酶培养基组成及培养条件的确定
采用单因子试验和正交试验，通过改变温度、初始pH值、接种量、装料量和培养时间，确定了液体种子最佳培养条件和固体发酵最佳产酶条件；采用单因子试验和正交试验，通过改变培养的碳氮源和无机盐组成确定该菌株液体种子最佳培养基组成和固体发酵的最佳产酶培养基组成。
通过上述试验方法确定的种子液培养基组成及发酵条件位：
菌种活化：将4℃条件下保存在营养琼脂培养基上的CGMCC No.6129试管斜面菌种移至室温条件下（20-25℃）活化4-8h；
液体种子制备：在无菌操作台上，用10mL灭菌后的蒸馏水将经过活化的CGMCC No.6129试管斜面菌种制成菌体悬浮液，冲洗入装有灭菌液体培养基的三角瓶中，1只试管菌种接种1个三角瓶，培养温度33～35℃，摇床转速150r/min，培养时间为12～18h，得到种子液；
其中培养基组成按重量份计为：1～3份牛肉膏，0.5～1份酵母粉，1～2份葡萄糖，0.5-1份硫酸铵，3～5份豆粕，2～3份玉米粉，85-92份软化水；。
将上述获得的种子液，也就是液体菌株，按照下列的参数进行液体三级发酵，发酵过程中进行二级、三级液体发酵时，逐级放大，放大比例为1:10；其他均采用现有技术进行发酵；
发酵培养基组成按重量份计为：1～2份葡萄糖，0.5～1份酵母粉，3～5份豆粕，2～3份玉米粉，0.5-1份硫酸铵，0.1-0.5份硫酸镁，0.1-0.5份磷酸二氢钾；85-90份的软化水，pH值自然。
发酵条件：接种量为5%（v/w），培养温度为33℃～35℃，发酵时间40h～50h。
所得的发酵液即含有壳聚糖粗酶，酶活一般在250-500U/ml。
实施例4
壳聚糖酶的提取分离与纯化
（1）缓冲液浸提：将固体酶干粉，加入装有pH值为4.0～4.5的硫酸铵缓冲液的容器中，料液比为1:10-20（w/v），（以干物质计）40～50℃水浴保温，开动搅拌器，15-90r/min搅拌3h；
（2）过滤、离心除杂：用布氏漏斗对上述缓冲液-酶混合液进行过滤，除去大部分固体颗粒，所得滤液经高速离心进一步除去大分子固体杂质和部分菌体，离心转速为6000r/min，时间为10min。
（3）微滤除菌体：用孔径为0.2μm的中空纤维滤膜，于室温下对步骤（2）所得离心上清液进行微滤，微滤操作压力控制在0.12Mpa以下。经过此步处理可以进一步除去菌体和大分子颗粒物质。
（4）超滤浓缩：将步骤（3）所得微滤液进行超滤浓缩，浓缩介质为中空纤维，截留分子量为6000Da以下，超滤操作压控制在0.12Mpa以下，收集超滤 内液，浓缩比例为10～25倍（浓缩前体积：浓缩后体积）。
（5）醇沉：将95%的乙醇缓慢加入超滤内液，并不断搅拌，乙醇与浓缩液的体积比为1：2.5～3.5，随着乙醇的不断加入，溶液开始出现乳白色混浊并进一步絮凝沉淀，醇沉后4000r/min离心5min，收集沉淀。
（6）沉淀于50℃条件下真空干燥或冷冻干燥即为最终产物壳聚糖酶制剂产品，经检测，其酶活达到27650U/g。
此提纯工艺经三次重复，各步骤的酶活收率结果见表1。经各步骤对壳聚糖酶精制后，酶活总收率平均为36.1%。
表1壳聚糖酶提取纯化各步骤的酶活收率
实施例5
取固体酶鲜料400g，酶活1800U/g，水分含量55wt%，加入pH值4.0的酸性硫酸铵缓冲液3600ml，开动搅拌器，搅拌速度80r/min，在50℃的条件下反应3h。
用离心机离心，转速：4000r/min，离心10min，去除大部分固体杂质和菌体，离心清液采用0.22μm的中空纤维膜组件微滤，收集滤过液，然后采用6000Da中空纤维滤膜组件超滤，脱出缓冲液的同时，达到浓缩的目的，直到外液的电导率在100μs/cm以下，收集超滤内液。
取2.5倍超滤内液体积的95%的乙醇缓慢加入超滤内液中，并不断搅拌，4000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀于50℃条件下冷冻干燥即为最终产物壳聚糖酶制剂产品。得到精酶8.5g，酶活达到32000U/g，酶活回收率为37.8%
实施例6
取液体深层发酵的发酵液10L，酶活326U/g，用离心机离心，转速4000r/min，离心10min，去除大部分固体杂质和菌体，离心清液采用0.22μm的中空纤维膜组件微滤，收集滤过液，然后采用6000Da中空纤维滤膜组件超滤，达到浓缩的目的，直到外液的电导率在100μs/cm以下，收集超滤内液。
取3倍超滤内液体积的95%的乙醇缓慢加入超滤内液中，并不断搅拌，4000r/min离心10min，收集沉淀。沉淀于50℃条件下真空干燥即为最终产物壳聚糖酶制剂产品。得到精酶65.6g，酶活达到26000U/g，酶活回收率为52.32%。
试验例1：壳聚糖酶粗酶的酶解实验
取100g壳聚糖（脱乙酰度为95.7%），用醋酸溶胀充分后，配制成1L 10%的壳聚糖溶液，添加适量HAc调节溶液的pH值为5.0，于55℃水浴中保温30min。准备完毕后，添加实施例2制备的固体壳聚糖酶2.0g，开始计时，反应100min左右开始取样检测（每5min取样一次）直到刚好不产生沉淀为止，反应终止，加热煮沸10min灭酶。重复此实验3次，酶解消耗时间分别为145min，150min，145min。酶解产物经乙酰丙酮法检测平均分子量为1736Dalton。
试验例2纯壳聚糖酶酶解实验
取100g壳聚糖（脱乙酰度为95.7%），用醋酸充分溶胀后，配制成1L 10%的壳聚糖溶液，添加适量HAc调节溶液的pH值为5.0，于55℃水浴中保温30min。准备完毕后,添加实施例4制备的壳聚糖酶0.2g，开始计时，反应60min左右开始取样检测（每5min取样一次）。具体方法是取反应物1mL于试管中，加入2mol/L的NaOH一滴，如果有少量絮状沉淀生成，则应继续反应，直到刚好不产生沉淀为止，加热煮沸10min灭酶，终止反应。经三次重复实验，平均酶解时间为127.5min（2.1h）。经乙酰丙酮法检测，产物壳寡糖的平均分子量为1538Dalton。实验结果见表2：
表2粗酶与精酶活性比较
从表2可以看出，精酶的酶活提高了10余倍，反应添加量仅为粗酶的1/10,精酶与粗酶的水解反应时间差异不大，但用精酶避免了活菌体以及培养基成分带入反应体系中，有效的保证了壳寡糖产品的安全性和稳定性，提高产品的品质。
Claims (4)
1.一种高活性壳聚糖酶，其特征在于：是由保藏号为CGMCC No.6129的菌株发酵获得的，其制备方法，包括如下步骤：
（1）菌种发酵产酶：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用发酵方法生产得到壳聚糖酶粗酶液；
其中所述的发酵方法为液体发酵或固体发酵；
所述的粗酶液为液体发酵的发酵液，或固体发酵后的鲜料或干燥粉碎后的干料，用缓冲液抽提出的酶液；
（2）壳聚糖酶纯化：步骤（1）获得的粗酶液，经离心除杂、微滤除菌、超滤膜超滤浓缩得酶浓缩液，将所得到的浓缩液用乙醇醇沉，收集沉淀，得湿固酶；
（3）干燥：对湿固酶进行低温真空干燥，即得高活性壳聚糖精酶；
其中所采用的菌种为蜡状芽胞菌（Bacillus cereus）JBSH-003,其保藏号为CGMCC No.6129；
所述步骤（1）中的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液或酸性硫酸铵缓冲液。
2.一种高活性壳聚糖酶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）菌种发酵产酶：菌种活化后，经液体发酵扩繁种子液，再利用发酵方法生产得到壳聚糖酶粗酶液；
其中所述的发酵方法为液体发酵或固体发酵；
所述的粗酶液为液体发酵的发酵液，或固体发酵后的鲜料或干燥粉碎后的干料，用缓冲液抽提出的酶液；
（2）壳聚糖酶纯化：步骤（1）获得的粗酶液，经离心除杂、微滤除菌、超滤膜超滤浓缩得酶浓缩液，将所得到的浓缩液用乙醇醇沉，收集沉淀，得湿固酶；
（3）干燥：对湿固酶进行低温真空干燥，即得高活性壳聚糖精酶；
其中所采用的菌种为蜡状芽胞菌（Bacillus cereus）JBSH-003,其保藏号为CGMCC No.6129；
所述步骤（1）中的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲液或酸性硫酸铵缓冲液。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的醇沉过程所使用的醇的温度为室温。
4.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的醇沉过程所使用的醇为95wt%的乙醇。
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