CN102337299B

CN102337299B - 一种芽孢杆菌絮凝剂的制备方法

Info

Publication number: CN102337299B
Application number: CN201110326838.6A
Authority: CN
Inventors: 何欢; 郑展望; 荆政; 苏玉刚; 周晓云
Original assignee: Hangzhou Jiangnan Scientific Research Institute Co Ltd
Current assignee: Zhe Jiang Shuangliang Sunda Environment Protection Co ltd
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2031-10-25
Also published as: CN102337299A

Abstract

本发明涉及一种微生物絮凝剂的制备方法，公开了一种芽孢杆菌絮凝剂的制备方法，经培养基培养，选用蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)为生产菌株，保藏编号CGMCC1.447，经培养基培养、发酵，得到的发酵液以板框压滤机压滤，收集滤液，进行浓缩，浓缩液真空干燥后，获得絮凝剂白色固体粉末成品。本发明的蜡状芽孢杆菌絮凝剂性能稳定,常温下储存一年,絮凝剂絮凝效率可达90%以上；以农副产品生产的蜡状芽孢杆菌絮凝剂，方法简便，发酵周期短，成本低，适用于大规模生产。

Description

一种芽孢杆菌絮凝剂的制备方法

技术领域

本发明涉及一种微生物絮凝剂的制备方法，尤其涉及了一种芽孢杆菌絮凝剂的制备方法。

背景技术

具有分泌絮凝剂能力的微生物称为絮凝剂产生菌,微生物絮凝剂的研究早就发现，最早的絮凝剂产生菌是Butterfield从活性污泥中筛选得到。

1976年，Nakamura j.等人从霉菌、细菌、放线菌、酵母菌等菌种中，筛选出19种具有絮凝能力的微生物，其中以酱油曲霉(Aspergillus souae)AJ7002产生的絮凝剂效果最好。1985年，Takagi H等人研究了拟青霉素(Paecilomyces sp.l-1)微生物产生的絮凝剂PF101。PF101对微生物细胞、啤酒酵母、血红细胞、活性污泥、纤维素粉、活性炭、硅藻土、氧化铝等有良好的絮凝效果。1986年，Kurane等人利用红球菌 (Rhodococcuserythropolis)研制成功生物絮凝剂NOC-1，对泥浆水、河水、粉煤灰水、活性碳粉水、膨胀污泥、纸浆废水等均有极好的絮凝和脱色效果，是目前发现的最好的微生物絮凝剂之一。

能产生微生物絮凝剂的微生物种类很多，它们大量存在于土壤和废水处理的活性污泥中。很长时间以来，早就发现一些微生物有细胞絮凝现象，但一直未对其产生重视，近十几年来，细胞絮凝技术才作为一种简便和经济分离技术在连续发酵及产品分离中得到广泛的应用。

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的具有絮凝功能的高分子有机物。其主要成分有糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等。从其来源看，也属于天然有机高分子絮凝剂，因此它具有天然有机高分子絮凝剂的一切优点。同时，微生物絮凝剂的研究工作目前还是主要筛选优良的菌种,以较低的成本获得高效和适应特种要求的各种絮凝剂。

国内类似技术：

1、胡筱敏等人的发明专利“一种制备微生物絮凝剂的方法”(发明专利申请号200810012572.6，公开号CN101327975A),主要以戴尔福特食酸菌为生产菌株制备微生物絮凝剂。该技术以出发菌株以液体培养基进行培养,培养后产物以有机溶剂提取,再经减压浓缩,并冷冻干炼获得微生物絮凝剂成品。

2、清华大学孙燕等3人的发明专利“一种利用发酵行业的副产物菌体制备微生物絮凝剂的方法”(发明专利申请号200810103128.5，公开号CN101254969A),将克雷伯氏杆菌接入含甘油或葡萄糖的种子培养基,继而在发酵罐中进行厌氧或有氧发酵,采用膜过滤和离心手段进行固液分离,所得固体部分可直接作为微生物絮凝剂使用。

本发明涉及一株以蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)作为出发菌株的微生物絮凝剂，该微生物絮凝剂商品名WCF。

发明内容

本发明的目的是提供一种性能稳定，絮凝效率高，制备方法简便，发酵周期短，成本低，适用于大规模生产的芽孢杆菌絮凝剂的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：

芽孢杆菌絮凝剂的制备方法，具体方法如下：

筛选产生微生物絮凝剂的优良菌株;

以二、三十种细菌、酵母菌作为微生物絮凝剂的筛选菌株, 通过对高岭土作为筛选底物,其具体方法为,在Φ18mm×200ml的玻璃试管中加入0.5%的高岭土悬浮液40ml,再加入0.5ml培养成熟的各种微生物培养液,震荡或摇匀5min,静止10 min,对比其各种微生物菌种产生的絮凝效果, 蜡状芽孢杆菌是絮凝效果最好的菌种之一。

本发明选用蜡状芽孢杆菌 (Bacillus Cereus) 为生产菌株，保藏编号CGMCC1.447，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心；本菌种购自于中国科学院微生物研究所（国家菌种保藏委员会）。

a、配制培养基：

1)斜面培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；

2)种子培养基：淀粉1-5%，葡萄糖0.1-1.0%，蛋白胨0.1-1.5%，玉米浆0.5-5%，磷酸氢二钾0.1-1.0%，其余为水，pH7.0；以上百分比为质量百分比。

3)发酵培养基：淀粉1-10%，豆饼粉0.5-1.5%，磷酸氢二钾0.1-1.0%，氯化钙0.5-2.0%，硫酸镁0.001-0.10%，其余为水，pH7.0，灭菌；以上百分比为质量百分比。

b、微生物的培养和发酵条件：

所述1)斜面培养基培养条件: 在30⁰C培养4-5天,培养成熟后放在4⁰C冰箱中保存,一个月后移植一次；

所述2)种子培养基培养条件: 种子培养基在121⁰C灭菌15min, 灭菌后接入斜面培养基菌种，25⁰C-35⁰C通气培养18-38h，通气比为1:0.5-0.8；

所述3)发酵培养基发酵条件: 发酵培养基在121⁰C灭菌20min，灭菌后接入5-15%种子培养基的菌种，25⁰C-35⁰C通气培养30-55h, 通气比为1:1-1.8；

c、絮凝剂的提取：上述发酵液以板框压滤机压滤，收集滤液；

d、絮凝剂成品制备：上述滤液以真空浓缩机进行浓缩, 浓缩比率1-1/ 10；干燥温度前期控制在40℃，中期60-70℃，后期110-115℃，干燥时间80-120分钟，浓缩液真空干燥，获得絮凝剂白色固体粉末成品。

本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：

1、本发明的蜡状芽孢杆菌絮凝剂性能稳定,常温下储存一年, 絮凝剂絮凝效率可达90%以上；

2、以农副产品生产的蜡状芽孢杆菌絮凝剂，方法简便，发酵周期短，成本低，适用于大规模生产。

本发明不但在废水处理方面有广泛的用途,且因微生物絮凝剂高效和安全等优点，在医药、食品加工、生物产品分离等领域也有巨大的潜在应用价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述：

实施例1

选用蜡状芽孢杆菌 (Bacillus Cereus) 为生产菌株，保藏编号CGMCC1.447，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

菌株的培养和发酵条件:

斜面培养基:蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；在30⁰C培养4-5天，培养成熟后放在4⁰C冰箱中保存，一个月后移植一次；

种子培养基：淀粉3%，葡萄糖0.5%，蛋白胨0.5%，玉米浆1%，磷酸氢二钾0.2%，pH自然; 种子培养基在121⁰C灭菌15min，灭菌后接入斜面培养基菌种, 在30⁰C通气培养30h，通气比为1:0.6；

发酵培养基；淀粉8%，豆饼粉1.2%，磷酸氢二钾05%，氯化钙0.8%，硫酸镁0.005%, pH自然，发酵培养基在121⁰C灭菌20min，灭菌后冷却至室温，接入7%种子培养基的菌种，在32⁰C通气培养48h，通气比为1:1；

絮凝剂的提取：

发酵液以板框压滤机压滤，进料压力0.2MPA，进料时间30min，压榨压力0.4MPA，压榨时间20 min，收集滤液；

絮凝剂成品制备：

上述滤液以真空浓缩机进行浓缩, 浓缩后液量为25%；真空干燥, 真空度控制在0.06MPA，干燥温度前期控制在40℃，中期65℃，后期110℃，干燥时间90分钟，获得絮凝剂白色固体粉末成品。

实施例2

菌株的培养和发酵条件:

斜面培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；在30⁰C培养4-5天，培养成熟后放在4⁰C冰箱中保存，一个月后移植一次；

种子培养基：淀粉2.5%，葡萄糖1.0%，蛋白胨0.8 %，玉米浆1.2%，磷酸氢二钾0.5 %，pH自然；种子培养基在121⁰C灭菌15min吗，灭菌后接入斜面培养基菌种，在30⁰C通气培养30h，通气比为1:0.8；

发酵培养基：淀粉6%，豆饼粉1.5%，磷酸氢二钾0.5%，氯化钙0.5%，硫酸镁0.007 %，pH自然；发酵培养基在121⁰C灭菌20min，灭菌后冷却至室温，接入10%种子培养基的菌种，在30⁰C通气培养48h，通气比为1:1.1；

絮凝剂的提取：

发酵液以板框压滤机压滤,进料压力0.3MPA,进料时间35min,压榨压力0.3MPA，压榨时间25 min，收集滤液；

絮凝剂成品制备：

上述滤液以真空浓缩机进行浓缩, 浓缩后液量为18%; 浓缩液真空干燥, 真空度控制在0.07MPA，干燥温度前期控制在50℃，中期70℃，后期105℃，干燥时间95分钟。获得絮凝剂白色固体粉末成品。

实施例3

选用蜡状芽孢杆菌(Bacillus Cereus)为生产菌株，保藏编号CGMCC1.447，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

菌株的培养和发酵条件:

斜面培养基：蛋白胨10.0g,牛肉浸膏3.0g,NaCl5.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1.0L,pH7.0; 在30⁰C培养4-5天,培养成熟后放在4⁰C冰箱中保存,一个月后移植一次;

种子培养基：淀粉2.0%,葡萄糖0.5%,蛋白胨0.5 %,玉米浆1.0%,磷酸氢二钾0.5 %,pH自然; 种子培养基在121⁰C灭菌15min,灭菌后接入斜面培养基菌种, 在28⁰C通气培养35h,通气比为1:1;

发酵培养基：淀粉7%,豆饼粉1.0%,磷酸氢二钾0.5%,氯化钙0.8%,硫酸镁0.01 %, pH自然,发酵培养基在121⁰C灭菌20min,灭菌后冷却至室温,接入12%种子培养基的菌种,在28⁰C通气培养50h, 通气比为1:1.2;

絮凝剂的提取：

发酵液以板框压滤机压滤,进料压力0.3MPA，进料时间30min,压榨压力0.4MPA, 压榨时间25min,收集滤液;

絮凝剂成品制备：

上述滤液以真空浓缩机进行浓缩, 浓缩后液量为22%; 浓缩液真空干燥, 真空度控制在0.07MPA, 干燥温度前期控制在50℃，中期70℃，后期105℃，干燥时间95分钟。获得絮凝剂白色固体粉末成品。

微生物絮凝剂絮凝率测定方法：

向100mL比色管中加入0.5g高岭土、3mL的1%CaCl₂溶液和2mL絮凝剂,然后加蒸馏水至100mL,盖上磨口塞,将比色管上下自然翻转和振荡2min,务必使高岭土和CaCl₂溶液以及絮凝剂完全溶解和充分混合,静止5min;

取比色管中50mL处的处理液,用722型分光光度计测定其在550nm波长处的吸光度OD₅₅₀(A),以其他条件相同但用2mL新鲜培养液代替作为处理液的空白对照(B),絮凝率(FR)的计算公式如下:

FR(%)=(A-B)/A×100；

经测定，上述3个实施例的絮凝剂的絮凝效率均可达90%以上。

总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims

1.一种芽孢杆菌絮凝剂的制备方法，其特征在于，具体方法如下：

选用蜡状芽孢杆菌 (Bacillus Cereus) 为生产菌株，保藏编号CGMCC1.447，保藏地点：中国普通微生物菌种保藏管理中心；

a、配制培养基：

1)斜面培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂15.0g，蒸馏水1.0L，pH7.0；

2)种子培养基：淀粉1-5%，葡萄糖0.1-1.0%，蛋白胨0.1-1.5%，玉米浆0.5-5%，磷酸氢二钾0.1-1.0%，其余为水，pH7.0；

3)发酵培养基：淀粉1-10%，豆饼粉0.5-1.5%，磷酸氢二钾0.1-1.0%，氯化钙0.5-2.0%，硫酸镁0.001-0.10%，其余为水，pH7.0，灭菌；

b、微生物的培养和发酵条件：

所述1)斜面培养基培养条件: 在30℃培养4-5天,培养成熟后放在4℃冰箱中保存,一个月后移植一次；

所述2)种子培养基培养条件: 种子培养基在121℃灭菌15min, 灭菌后接入斜面培养基菌种，25℃-35℃通气培养18-38h，通气比为1:0.5-0.8；

所述3)发酵培养基发酵条件: 发酵培养基在121℃灭菌20min，灭菌后接入5-15%种子培养基的菌种，25℃-35℃通气培养30-55h, 通气比为1:1-1.8；

d、絮凝剂成品制备：上述滤液以真空浓缩机进行浓缩, 浓缩比率1-1/10；干燥温度前期控制在40℃，中期60-70℃，后期110-115℃，干燥时间80-120分钟，浓缩液真空干燥，获得絮凝剂白色固体粉末成品。

2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌絮凝剂的制备方法，其特征在于：所述的发酵液以板框压滤机压滤，进料压力0.2-0.3MPA，进料时间30-35min，压榨压力0.3-0.4MPA，压榨时间20-25min。