CN103710286A - 一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物，所述丁酸梭菌活菌制剂加工方法，包括以下步骤：活化和扩大培养菌种；种子罐培养菌种；发酵罐发酵培养。其中，所述发酵培养基的成分包括：玉米粉，蛋白胨，牛肉浸粉，酵母抽提物，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钙，硫酸镁，硫酸锰，硫酸亚铁，乙酸钠，半胱氨酸盐。本发明通过优化培养基和加工流程，使发酵培养时间更短，芽孢成熟率更高。而且，本发明中还优化了菌体收集方法，大大简化地简化了生产流程并能大幅度节约能耗，而且能提高活性菌体的收得率。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物。
背景技术
丁酸梭菌是梭状芽孢杆菌属的其中一种，主要存在于奶酪、天然酸奶、人与动物的肠道与粪便中、某些树叶、土壤等自然环境中。丁酸梭菌是一种直的或弯曲的革兰氏阳性厌氧内生芽孢杆菌，对环境的变化有一定的抗性，这些特定使丁酸梭菌具有良好益生菌的潜力。另一方面，丁酸梭菌通过动物肠道时，能耐胃酸及胆汁酸盐，很好地保证了其性能的发挥。在临床医学和畜牧业方面广泛应用于整肠药物、保健食品、饲料添加剂、微生物肥料等，是一种较理想的具有广泛开发前景的生物态制剂。
在丁酸梭菌活菌剂的制备过程中，培养基的配方是关键，直接影响丁酸梭菌的发酵时间和芽孢率。而现有丁酸梭菌活菌剂的加工技术，就培养基的培养效果而言，发酵所需要的时间很长，或发酵液中芽孢率很低。
因此，现有技术还有待发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物，旨在解决现有丁酸梭菌活菌制剂的制备过程中发酵所需要的时间很长，或发酵液中芽孢率很低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，包括以下步骤：
S1、活化和扩大培养菌种；
S2、种子罐培养菌种：
一级种子罐培养：将经过扩大培养的菌种接种到种子罐的一级种子罐培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养16~22小时，转入二级种子罐培养；
二级种子罐培养：将一级种子罐培养基的菌种接种到种子罐的二级种子罐培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养12~16小时，移种到发酵罐；
S3、发酵罐发酵培养：
按照8-10%的接种量将二级种子罐中的菌种接入发酵罐的发酵培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养28-32小时；
S4、对发酵液进行后处理加工，制成丁酸梭菌活菌制剂；
其中，所述发酵培养基的成分包括：玉米粉25~35克/升，蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.5~1.1克/升，硫酸镁0.2~0.6克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐0.5~1克/升，PH调节至7.0-7.5。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，所述一级种子罐培养基的成分包括：所述一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，葡萄糖5~15克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5；
所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，玉米粉20~30克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.3~0.7克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，步骤S2中，所述一级种子罐培养过程中是按照接种量1~3%将经过扩大培养的菌种接种到种子罐的一级种子罐培养基中；
所述二级种子罐培养过程中是按照接种量3~10%将一级种子罐培养基的菌种接种到种子罐的二级种子罐培养基中；
步骤S3中所述发酵罐发酵培养过程是按照8-10%的接种量将二级种子罐中的菌种接入发酵罐的发酵培养基中。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，所述步骤S1具体包括以下步骤：
活化菌种：将丁酸梭菌菌种在RCM固体培养基上划线分离，纯化；
扩大培养菌种：挑选RCM固体培养基上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中37°C厌氧培养48小时。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，所述步骤S4具体包括以下步骤：
将丁酸梭菌发酵液的pH值调节至6.5-7.0；依次加入占发酵液重量0~4.0%的硅藻土，0.7~3.0%的磷酸氢二钠，0.5~2.0%的氯化钙，搅拌混合均匀；加入20-100ppm的聚丙烯酰胺，使用空气混匀，静置10分钟以上；将絮凝成团的菌体分离出来，得到活性菌泥；干燥所述活性菌泥，得到菌粉。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，将絮凝成团的菌体分离出来的过程为用压缩空气将发酵液从罐中压入板框，进行过滤，进料结束后用压缩空气通过隔膜施压压滤，待滤饼成型后，收集滤饼。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，所述干燥活性菌泥的过程采用烘干的方式；所述烘干的过程要将温度控制在40~65℃。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其中，硅藻土占菌体发酵液重量的1-2%，磷酸氢二钠占1.5%，氯化钙占1.0%，聚丙烯酰胺占30ppm。
一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法的培养基组合物，其中，所述培养基组合物包括发酵培养基；
所述发酵培养基的成分包括：玉米粉25~35克/升，蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.5~1.1克/升，硫酸镁0.2~0.6克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐0.5~1克/升，PH调节至7.0-7.5。
所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法的培养基组合物，其中，所述培养基组合物还包括一级种子罐培养基和二级种子罐培养基；
所述一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，葡萄糖5~15克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5；
所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，玉米粉20~30克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.3~0.7克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。
有益效果：本发明中提供一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物，通过优化培养基和加工流程，使发酵培养时间更短，芽孢成熟率更高。而且，本发明中还优化了菌体收集方法，大大简化地简化了生产流程并能大幅度节约能耗，而且能提高活性菌体的收得率。
具体实施方式
本发明提供一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中提供一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及其所涉及的培养基组合物，采用本发明所述丁酸梭菌活菌制剂加工方法，发酵培养时间更短，芽孢成熟率更高。
具体地，所述丁酸梭菌活菌制剂加工方法，包括以下步骤：
第一，活化和扩大培养菌种：
1）活化菌种：将丁酸梭菌菌种在RCM固体培养基上划线分离，纯化。所述RCM固体培养基（梭菌强化增殖培养基），为青岛海博生物技术有限公司生产，其成分为：胰蛋白胨10g/L，牛肉粉10g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，琼脂粉20克/升，PH6.8-7.0。
2）扩大培养菌种：挑选RCM固体培养基上的单菌落，接种于200毫升的RCM液体培养基中，置于厌氧袋中37°C厌氧培养48小时。所述RCM液体培养基同上，但不添加琼脂。
第二，种子罐培养菌种：
在本发明中，种子罐种子培养分为两级：
一级种子罐培养：按照接种量1~3%，将RCM液体培养基中的菌种接种到种子罐的一级种子罐培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养16~22小时，至OD600值达到6-10或以上时，可以转入二级种子罐培养。
其中，一级种子罐培养基的成分包括：所述一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，葡萄糖5~15克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。优选地，一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨：10克/升（广东环凯），牛肉浸粉：5克/升（广东环凯），酵母抽提物：3克/升(广东环凯)，葡萄糖：10克/升，磷酸氢二钾：1克/升，磷酸二氢钾：0.5克/升，氯化钙：0.2克/升，硫酸镁：0.5克/升，硫酸锰：0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠：2克/升，半胱氨酸盐酸盐：0.75克/升。
二级种子罐培养：按照接种量3~10%将一级种子罐培养基的菌种接种到种子罐的二级种子罐培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养12~16小时，菌体生长旺盛，OD值达到8~12，PH下降到4~5，镜检正常，即可移种到发酵罐。
其中，所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，玉米粉20~30克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.3~0.7克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。优选地，所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨：10克/升（广东环凯），牛肉浸粉：5克/升（广东环凯），酵母抽提物：3克/升 (广东环凯)，玉米粉：25克/升（玉米粉需要用淀粉酶水解），磷酸氢二钾：1克/升，磷酸二氢钾：0.5克/升，氯化钙：0.2克/升，硫酸镁：0.5克/升，硫酸锰：0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠：2克/升，半胱氨酸盐酸盐：0.75克/升。
第三，发酵罐发酵培养：
按照8-10%的接种量将二级种子罐中的菌种接入发酵罐的发酵培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，每2小时取样观察，测PH值，镜检菌体生长情况和芽孢形成情况，培养28-32小时，镜检观察菌体芽孢率基本不再增加（发酵后期多取样观察比较），即可将发酵罐中的发酵液放罐进入后处理工段。
其中，所述发酵培养基的成分包括：玉米粉25~35克/升，蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.5~1.1克/升，硫酸镁0.2~0.6克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐0.5~1克/升，PH调节至7.0-7.5。优选地，所述发酵培养基的成分包括：玉米粉30克/升（用淀粉酶水解液化），蛋白胨10克/升（安琪公司生产），牛肉浸粉5克/升（广东环凯），酵母抽提物3克/升（广东环凯），磷酸氢二钾1克/升，磷酸二氢钾0.5克/升，氯化钙0.8克/升，硫酸镁0.4克/升，硫酸锰0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠2克/升，半胱氨酸盐0.75克/升。
活菌芽孢数的检测方法是采用半固体培养基计数方法：取1毫升菌样，加入到80度左右的半固体培养基试管中，摇匀后吸取1毫升转入到另一支80度左右的半固体培养基中，依次稀释，根据样品浓度选择稀释到1010不等。加样后的半固体试管做好浓度记号后自然冷却，置于37度恒稳培养箱中培养12-24小时，观察菌落生长情况。由此可以准确计算出样品含有的芽孢菌浓度（营养体不能计算出来，只能计算出耐热的芽孢菌）。
在丁酸梭菌活菌制剂的生产中，丁酸梭菌活菌培养液中菌体的收集也是生产中遇到的困难之一。由于丁酸梭菌不能耐受高速离心力，通过离心收集活性菌体时必须采用低速离心，发酵培养液直接低速离心式不可能分离出菌体细胞的。现有技术中，在使用喷雾干燥的方法时，由于菌体不能耐受高速离心力，产品的加工收率往往很低，一般只有40%左右。而采用冷冻干燥的方法时，由于水分蒸发量大，动力成本往往很高。因此，本发明所述丁酸梭菌活菌制剂加工方法，还包括以下步骤：
第四，丁酸梭菌的后处理过程：
将丁酸梭菌发酵液的pH值调节至6.5-7.0；依次加入占发酵液重量0~4.0%的硅藻土，0.7~3.0%的磷酸氢二钠，0.5~2.0%的氯化钙，待上述物质成分搅拌混合，菌体可以絮凝聚集在一起，形成小的絮凝体；再加入20-100ppm的聚丙烯酰胺，使用空气混匀，静置10分钟以上，在此静置过程中，通过絮凝架桥作用，将小的菌体絮凝体连接在一起，形成大的絮凝团；将絮凝成团的菌体分离出来，得到活性菌泥；干燥所述活性菌泥，得到菌粉。
其中，在调节发酵液pH值时，优选为采用液碱调节，采用液态酸碱能快速地融入发酵液中，节省调节酸碱的时间。所述液碱优选为使用液体氢氧化钠。优选的方案中，硅藻土占菌体发酵液重量的1-2%，磷酸氢二钠占1.5%，氯化钙占1.0%，聚丙烯酰胺占30ppm，采用此最优选方案的絮凝剂添加量，剂量低，且菌体絮凝效果最好。在所添加的絮凝剂中，硅藻土、磷酸氢二钠和无水氯化钙为无机絮凝剂，聚丙烯酰胺溶液为高分子有机絮凝剂。所述使用空气混合均匀的过程是将空气通入装有发酵液的容器内(发酵罐或絮凝罐)，由空气带动液体翻动，由于空气翻动的剪切力远小于机械搅拌的剪切力，不会造成絮凝体的破碎。
将絮凝成团的菌体分离出来的过程可以通过压滤或低速度离心的方式，轻易地收集得到活性菌泥。所述压滤的过程可以为用压缩空气将发酵液从罐中压入板框，进行过滤，进料结束后用压缩空气通过隔膜施压压滤，待滤饼成型后，收集滤饼。
所述干燥活性菌泥的过程，可以根据菌体的特性，采取冷冻干燥或加热烘干的方式进行。所述烘干的过程要将温度控制在40~65℃。烘干过程中温度不能过高，否则容易影响菌体的活性。
在本发明所述丁酸梭菌活菌制剂加工方法过程中，需要注意以下控制要点：
1、种子罐和发酵罐的培养基消毒前使用氨水调节PH值7.0-7.5之间，PH值超高时需加盐酸或硫酸调低至7.0-7.5，加消泡剂少量。
2、50升一级种子罐消毒后培养基装液量为总体积的40~60%，500升二级种子罐消毒后培养基装液量为体积为总体积的50~80%，5000升发酵罐消毒后培养基装液量为总体积的60~80%。
3、一级种子罐和二级种子罐的消毒温度为116-118°C，消毒时间为20-25分钟。发酵罐的消毒温度116-118°C，时间为30分钟。
4、种子罐培养和发酵罐培养均采用厌氧发酵，培养基在高温消毒后不允许通入空气。种子罐培养和发酵罐培养过程中氮气从罐顶通入，注意氮气压力，控制在0.05-0.15Mpa范围之内，不能超压。在发酵中后期，由于罐内产生氢气，应每隔2小时排一次罐内气体。
5、种子罐和发酵罐搅拌转速控制在50-120转/分钟。
6、种子罐培养和发酵罐培养过程中控制培养温度37°C，并每两小时记录一次，有特殊情况随时记录。
7、发酵罐培养过程中每两小时取样测定PH值、OD值并记录，培养或发酵10小时开始做镜检涂片，观察菌体及芽孢生长情况。
8、发酵罐培养结束时间由工艺管理员通知，发酵罐内发酵结束后记录发酵液体积并取样送检，转入另外的发酵罐或絮凝罐中存放及絮凝。
9、发酵液絮凝：先用液碱调节发酵液PH值至6.5-7.0，按先后次序加入占发酵液重量0~4.0%的硅藻土，0.7~3.0%的磷酸氢二钠，0.5~2.0%的氯化钙和20-100ppm的聚丙烯酰胺，使用空气混匀（磷酸氢二钠溶解需要时间，待充分溶解后再加入氯化钙）。
10、过滤：用压缩空气将发酵液从罐中压入板框，进行过滤，进料结束后用压缩空气通过隔膜施压压滤。待滤饼成型后，收集滤饼，称重。
11、烘干：控制温度40~65℃左右，烘干，烘干后包装、称重并取样送检。
本发明中提供一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法的培养基组合物，所述培养基组合物包括发酵培养基；
所述发酵培养基的成分包括：玉米粉25~35克/升（用淀粉酶水解液化），蛋白胨5~15克/升（安琪公司生产），牛肉浸粉3~7克/升（广东环凯），酵母抽提物1~5克/升（广东环凯），磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.5~1.1克/升，硫酸镁0.2~0.6克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐0.5~1克/升，PH调节至7.0-7.5。
所述培养基组合物还包括一级种子罐培养基和二级种子罐培养基；二级种子培养基与发酵培养基更为接近，有利于缩短培养周期，同时提高培养密度。当然，如果采用二级发酵工艺，直接使用一级种子培养液到发酵罐也可以，发酵时间会更长些，芽孢密度会低些。
所述一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨： 5~15克/升（广东环凯），牛肉浸粉： 3~7克/升（广东环凯），酵母抽提物： 1~5克/升(广东环凯)，葡萄糖： 5~15克/升，磷酸氢二钾： 0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾： 0.3~0.7克/升，氯化钙： 0.1~0.3克/升，硫酸镁： 0.3~0.7克/升，硫酸锰： 0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠： 1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐： 0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。
所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨： 5~15克/升（广东环凯），牛肉浸粉： 3~7克/升（广东环凯），酵母抽提物： 1~5克/升 (广东环凯)，玉米粉： 20~30克/升（玉米粉需要用淀粉酶水解），磷酸氢二钾： 0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾： 0.3~0.7克/升，氯化钙： 0.1~0.3克/升，硫酸镁：0.3~0.7克/升，硫酸锰：0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.3~0.7克/升，乙酸钠： 1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐： 0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。
以下通过实施例对本发明做进一步说明。
实施例1
1、活化和扩大培养菌种：
1）活化菌种：将丁酸梭菌菌种在RCM固体培养基上划线分离，纯化。所述RCM固体培养基（梭菌强化增殖培养基），为青岛海博生物技术有限公司生产，其成分为：胰蛋白胨10g/L，牛肉粉10g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，琼脂粉20克/升，PH6.8-7.0。
2）扩大培养菌种：挑选RCM固体培养基上的单菌落，接种于200毫升的RCM液体培养基中，置于厌氧袋中37°C厌氧培养48小时。所述RCM液体培养基同上，但不添加琼脂。
2、种子罐培养菌种：
50升的一级种子罐中接入200毫升RCM液体培养基，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50转/分钟，控制温度37°C，培养20小时，至OD600值达到10时，按照接种量5%转入500升二级种子罐培养基中。使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50转/分钟，控制温度37°C，培养16小时后，菌体生长旺盛，至OD600值达到10，镜检正常，移种到发酵罐。
其中，一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨：10克/升（广东环凯），牛肉浸粉：5克/升（广东环凯），酵母抽提物：3克/升(广东环凯)，葡萄糖：10克/升，磷酸氢二钾：1克/升，磷酸二氢钾：0.5克/升，氯化钙：0.2克/升，硫酸镁：0.5克/升，硫酸锰：0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠：2克/升，半胱氨酸盐酸盐：0.75克/升， PH调节至7.5。
二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨：10克/升（广东环凯），牛肉浸粉：5克/升（广东环凯），酵母抽提物：3克/升 (广东环凯)，玉米粉：25克/升（玉米粉需要用淀粉酶水解），磷酸氢二钾：1克/升，磷酸二氢钾：0.5克/升，氯化钙：0.2克/升，硫酸镁：0.5克/升，硫酸锰：0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠：2克/升，半胱氨酸盐酸盐：0.75克/升， PH调节至7.5。
3、发酵罐发酵培养：
按照8%的接种量将二级种子罐中的菌种接入500升发酵罐的发酵培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速80-100转/分钟，控制温度37°C，每2小时取样观察，测PH值，镜检菌体生长情况和芽孢形成情况，培养28小时。镜检观察菌体芽孢率基本不再增加，即可将发酵罐中的发酵液放罐进入后处理工段。其中，在培养28小时后，镜检观察菌体密度很高，而且90%以上的菌体形成芽孢，经过半固体培养基计数，检测到芽孢浓度达到20×108。
其中，所述发酵培养基的成分包括：玉米粉30克/升（用淀粉酶水解液化），蛋白胨10克/升（安琪公司生产），牛肉浸粉5克/升（广东环凯），酵母抽提物3克/升（广东环凯），磷酸氢二钾1克/升，磷酸二氢钾0.5克/升，氯化钙0.8克/升，硫酸镁0.4克/升，硫酸锰0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠2克/升，半胱氨酸盐0.75克/升，PH调节至7.5。
4、丁酸梭菌发酵液的絮凝：
取350升的丁酸梭菌发酵液，发酵液芽孢浓度为12亿CFU/毫升。调节丁酸梭菌发酵液的pH值至6.5，依次加入适量的硅藻土3.5公斤，磷酸氢二钠5.25公斤，氯化钙3.5公斤，待前述物质搅拌混合均匀，菌体充分絮凝后，加入3%聚丙烯酰胺溶液350毫升，向絮凝罐中通入空气使液体翻动约5分钟后，静置十分钟以上，使菌体絮凝成团，即可进行压滤或离心。本实施例中采用压滤的方式分离菌体絮凝团，其中，所得滤饼的湿重为24公斤。将所述滤饼在50℃下烘干5个小时，得到菌粉重量10.5公斤，经检测，菌粉的含菌量为300亿CFU/毫升，其收得率在75%以上。
实施例2
1、活化和扩大培养菌种：
1）活化菌种：将丁酸梭菌菌种在RCM固体培养基上划线分离，纯化。所述RCM固体培养基（梭菌强化增殖培养基），为青岛海博生物技术有限公司生产，其成分为：胰蛋白胨10g/L，牛肉粉10g/L，酵母粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，醋酸钠3g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，琼脂粉20克/升，PH6.8-7.0。
2）扩大培养菌种：挑选RCM固体培养基上的单菌落，接种于200毫升的RCM液体培养基中，置于厌氧袋中37°C厌氧培养48小时。所述RCM液体培养基同上，但不添加琼脂。
2、种子罐培养菌种：
50升的一级种子罐中接入200毫升RCM液体培养基，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速120转/分钟，控制温度37°C，培养16小时，至OD600值达到8时，按照接种量10%转入500升二级种子罐培养基中。使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速120转/分钟，控制温度37°C，培养16小时后，菌体生长旺盛， OD值达到9，PH下降到4.5左右，镜检正常，移种到发酵罐。
其中，一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨：10克/升（广东环凯），牛肉浸粉：5克/升（广东环凯），酵母抽提物：3克/升(广东环凯)，葡萄糖：10克/升，磷酸氢二钾：1克/升，磷酸二氢钾：0.5克/升，氯化钙：0.2克/升，硫酸镁：0.5克/升，硫酸锰：0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠：2克/升，半胱氨酸盐酸盐：0.75克/升， PH调节至7.5。
二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨：10克/升（广东环凯），牛肉浸粉：5克/升（广东环凯），酵母抽提物：3克/升 (广东环凯)，玉米粉：25克/升（玉米粉需要用淀粉酶水解），磷酸氢二钾：1克/升，磷酸二氢钾：0.5克/升，氯化钙：0.2克/升，硫酸镁：0.5克/升，硫酸锰：0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠：2克/升，半胱氨酸盐酸盐：0.75克/升， PH调节至7.5。
3、发酵罐发酵培养：
按照10%的接种量将二级种子罐中的菌种接入5000升发酵罐的发酵培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速100转/分钟，控制温度37°C，每2小时取样观察，测PH值，镜检菌体生长情况和芽孢形成情况，培养32小时。镜检观察菌体芽孢率基本不再增加，即可将发酵罐中的发酵液放罐进入后处理工段。其中，在培养28小时后，镜检观察菌体密度很高，而且90%以上的菌体形成芽孢，经过半固体培养基计数，检测到芽孢浓度达到20×108。
其中，所述发酵培养基的成分包括：玉米粉30克/升（用淀粉酶水解液化），蛋白胨10克/升（安琪公司生产），牛肉浸粉5克/升（广东环凯），酵母抽提物3克/升（广东环凯），磷酸氢二钾1克/升，磷酸二氢钾0.5克/升，氯化钙0.8克/升，硫酸镁0.4克/升，硫酸锰0.5克/升，硫酸亚铁0.05克/升，乙酸钠2克/升，半胱氨酸盐0.75克/升，PH调节至7.5。
4、丁酸梭菌发酵液的絮凝：
取3500升的丁酸梭菌发酵液，发酵液芽孢浓度为15亿CFU/毫升。
调节丁酸梭菌发酵液的pH值至6.5，依次加入适量的硅藻土70公斤，磷酸氢二钠52.5公斤，氯化钙35公斤，待前述物质搅拌混合均匀，菌体充分絮凝后，加入3%聚丙烯酰胺溶液3500毫升，向絮凝罐中通入空气使液体翻动约5分钟后，静置十分钟以上，使菌体絮凝成团，即可进行压滤或离心。本实施例中采用压滤的方式分离菌体絮凝团，其中，所得滤饼的湿重为290公斤。将所述滤饼在50℃下烘干5个小时，得到菌粉重量136公斤，经检测，菌粉的含菌量为300亿CFU/毫升，其收得率在77%以上。
综上所述，本发明中提供一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法及培养基组合物，通过优化培养基和加工流程，使发酵培养时间更短，芽孢成熟率更高。而且，本发明中还优化了菌体收集方法，大大简化地简化了生产流程并能大幅度节约能耗，而且能提高活性菌体的收得率。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、活化和扩大培养菌种；
S2、种子罐培养菌种：
一级种子罐培养：将经过扩大培养的菌种接种到种子罐的一级种子罐培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养16~22小时，转入二级种子罐培养；
二级种子罐培养：将一级种子罐培养基的菌种接种到种子罐的二级种子罐培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养12~16小时，移种到发酵罐；
S3、发酵罐发酵培养：
按照8-10%的接种量将二级种子罐中的菌种接入发酵罐的发酵培养基中，使用氮气从罐顶通入罐中，保持罐压，开动搅拌，转速50-120转/分钟，控制温度37°C，培养28-32小时；
S4、对发酵液进行后处理加工，制成丁酸梭菌活菌制剂；
其中，所述发酵培养基的成分包括：所述发酵培养基的成分包括：玉米粉25~35克/升，蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.5~1.1克/升，硫酸镁0.2~0.6克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐0.5~1克/升，PH调节至7.0-7.5。
2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，所述一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，葡萄糖5~15克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5；
所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，玉米粉20~30克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.3~0.7克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。
3.根据权利要求1所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，步骤S2中，所述一级种子罐培养过程中是按照接种量1~3%将经过扩大培养的菌种接种到种子罐的一级种子罐培养基中；
所述二级种子罐培养过程中是按照接种量3~10%将一级种子罐培养基的菌种接种到种子罐的二级种子罐培养基中；
步骤S3中所述发酵罐发酵培养过程是按照8-10%的接种量将二级种子罐中的菌种接入发酵罐的发酵培养基中。
4.根据权利要求1所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，所述步骤S1具体包括以下步骤：
活化菌种：将丁酸梭菌菌种在RCM固体培养基上划线分离，纯化；
扩大培养菌种：挑选RCM固体培养基上的单菌落，接种于RCM液体培养基中，置于厌氧袋中37°C厌氧培养48小时。
5.根据权利要求1所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，所述步骤S4具体包括以下步骤：
将丁酸梭菌发酵液的pH值调节至6.5-7.0；依次加入占发酵液重量0~4.0%的硅藻土，0.7~3.0%的磷酸氢二钠，0.5~2.0%的氯化钙，搅拌混合均匀；加入20-100ppm的聚丙烯酰胺，使用空气混匀，静置10分钟以上；将絮凝成团的菌体分离出来，得到活性菌泥；干燥所述活性菌泥，得到菌粉。
6.根据权利要求5所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，将絮凝成团的菌体分离出来的过程为用压缩空气将发酵液从罐中压入板框，进行过滤，进料结束后用压缩空气通过隔膜施压压滤，待滤饼成型后，收集滤饼。
7.根据权利要求5所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，所述干燥活性菌泥的过程采用烘干的方式；所述烘干的过程要将温度控制在40~65℃。
8.根据权利要求5所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法，其特征在于，硅藻土占菌体发酵液重量的1-2%，磷酸氢二钠占1.5%，氯化钙占1.0%，聚丙烯酰胺占30ppm。
9.一种丁酸梭菌活菌制剂加工方法的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物包括发酵培养基；
所述发酵培养基的成分包括：玉米粉25~35克/升，蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.5~1.1克/升，硫酸镁0.2~0.6克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐0.5~1克/升，PH调节至7.0-7.5。
10.根据权利要求9所述的丁酸梭菌活菌制剂加工方法的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物还包括一级种子罐培养基和二级种子罐培养基；
所述一级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，葡萄糖5~15克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.03~0.07克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5；
所述二级种子罐培养基的成分包括：胰蛋白胨5~15克/升，牛肉浸粉3~7克/升，酵母抽提物1~5克/升，玉米粉20~30克/升，磷酸氢二钾0.5~1.5克/升，磷酸二氢钾0.3~0.7克/升，氯化钙0.1~0.3克/升，硫酸镁0.3~0.7克/升，硫酸锰0.3~0.7克/升，硫酸亚铁0.3~0.7克/升，乙酸钠1~3克/升，半胱氨酸盐酸盐0.5~1克/升， PH调节至7.0-7.5。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 528515 Guangdong province Foshan Gaoming Cangjiang Industrial Park West Sand Water District Heyuan Yang Road Applicant after: GUANGDONG HINABIOTECH CO., LTD. Address before: 528515 Guangdong province Foshan Gaoming Cangjiang Industrial Park West Sand Water District Heyuan Yang Road Applicant before: Hinapharm Pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: HINAPHARM PHARMACEUTICAL CO., LTD. TO: GUANGDONG HINAPHARM BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
|
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |