CN107201315A - 一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用 - Google Patents

一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)诱变菌株及其诱变方法和应用，该菌株以高温发酵的堆肥中筛选出的产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉为出发菌株，经原生质体紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变后，筛选出的菌株再通过出芽孢子硫酸二乙酯‑微波复合诱变获得的。本发明的诱变菌株已于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13182。本发明中菌株诱变方法比常规诱变方法效率高，筛选过程简单快速，诱变菌株的生产能力更高，产量为嗜热拟青霉出发菌株产量的277.65％，发酵液酶活达到185U/ml，降低了生产成本，且该菌株生产的葡萄糖氧化酶耐高温、耐酸性好，可作为饲用酶应用于饲料行业。

Description

一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉及其筛选方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，简称GOD)是酶技术领域中一种非常重要的酶，它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。由于其与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了它在科研、医药和食品工业生产上广泛的应用。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品或药品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖；可脱掉食品中的氧，以达到改善食品品质、延长食品货架期的目的；同时，葡萄糖氧化酶凭其天然的优良特性,可作为一个较为理想的溴酸钾取代物，用作一种更为安全的面粉改良剂。在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物-葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等。在医学诊断方面，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性,也被用于一些复杂生化体系中葡萄糖的定量测定，如快速检测血糖、尿糖。
目前国内外己有许多葡萄糖氧化酶的相关研究报道，其中大部分来源于微生物，微生物中通常对中温菌的产酶进行研究，而本发明嗜热拟青霉是一类能够在较高温度下正常生长代谢的微生物，该菌株产耐热葡萄糖氧化酶与一般普通微生物产酶相比具有许多明显的优势，如较高温度下发酵培养一般不容易感染杂菌；该菌株产耐热葡萄糖氧化酶具有较高的温度稳定性和较高的反应温度，而较高的反应温度能够提高酶的反应速率和水解效率。另外，热稳定的酶更有利于运输、储藏和使用，更适合于工业化应用等。目前国内外关于嗜热拟青霉产葡萄糖氧化酶还未见报道。因此，嗜热拟青霉开发耐热性的葡萄糖氧化酶就有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术不足提供一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉及其筛选方法，该筛选方法操作简单、快速，该菌株具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到性质稳定的葡萄糖氧化酶，该复合酶耐高温、耐酸性好，特别适合用做饲料酶。
本发明所提供的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株(Paecilomyces thermophila)，其于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13182。
本发明还提供了上述高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，先将嗜热拟青霉出发菌株通过紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变得到突变菌株，再将突变菌株筛选后，进行硫酸二乙酯和微波复合诱变和第二次筛选得到嗜热拟青霉诱变菌株。
作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
(1)采样及样品处理：采用多点混合土样采集方法，从正处于高温发酵的堆肥中取土样，取样深度为15-20cm，土样为由若干样点组成的混合样品，每个点的取土深度及质量均匀一致，混合样品取500g，采样季节为夏季，称取混合样品内固体土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，180r/min振荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入50-70℃恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样浑浊液；
(2)菌株初筛：将以上处理后的土样浑浊液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的浑浊液各0.1-0.2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，待该培养基培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于30-40℃恒温培养箱中倒置培养18-72h，然后将平板置于30-45℃恒温培养箱中继续倒置培养1-3d，将平板上长出的菌落点种到葡萄糖氧化酶初筛培养基上，接种好的培养皿30-45℃恒温培养箱中倒置培养2-4d，然后置于4℃冰箱中静置1-2d，接着在室温下存放1-2d，挑取透明圈较大的菌株接种至斜面培养基，进一步复筛；
(3)菌株纯化：将步骤(2)初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于30-45℃恒温培养箱中培养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化；
(4)菌株复筛：将初筛得到的纯化后各菌株分别接种到固体种子培养基上，30-40℃下培养3-5d，待孢子充分成熟后，加入无菌水，将孢子充分洗下，无菌水稀释孢子液至浓度为104-6个/ml，取孢子稀释液5-10ml接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/min转速下30-40℃进行液体震荡培养，培养2-3d后，按照6-10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下30-45℃进行液体震荡发酵培养，发酵培养3-7d，取发酵液12000r/min，10min离心后收集上清液测定葡萄糖氧化酶酶活性，选取酶活性较高的菌株进行划线传代培养，直至得到一株产酶稳定且有较高酶活的耐高温葡萄糖氧化酶产生菌株，即为嗜热拟青霉出发菌株；
其中，霉菌筛选培养基成分为：PDA培养基800mL，孟加拉红0.01-0.025g，氯霉素0.1-0.15g，无机盐营养液0.5-1mL，补水至1000mL，琼脂粉15g，该培养基中孟加拉红和氯霉素灭菌后加入，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min；葡萄糖氧化酶初筛培养基由底层培养基和上层培养基构成，底层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO4 0.388g/L、KH2PO4 0.188g/L、MgSO4·7H2O 0.156g/L、CaCO3 3.5g/L、琼脂15g/L；上层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、可溶性淀粉10g/L、KI 1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，并控制pH为4.0-5.0。
作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述固体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL、无机盐营养液1mL、琼脂粉1.5g，并控制pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL，pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
作为对上述诱变方法的进一步说明，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体发酵培养基的成分如下：PDA培养基80mL、无机盐营养液1mL、蛋白胨1g、吐温800.5mL、(NH4)2SO4 1g，pH为4.0-5.0，补充去离子水至100mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
作为对上述诱变方法的进一步说明，所述无机盐营养液为：NaNO3 2.0g，K2PO41.5g，CaCl2 1.5g，MgSO4 0.3g，FeSO4·7H2O 0.1g，MnSO4·H2O 1.6mg，ZnSO4·H2O 0.05g，CoCl2 0.5mg，(NH4)2SO4 5g，去离子水1000mL。
作为对上述诱变方法的进一步说明，其具体步骤为：
(1)将嗜热拟青霉出发菌株接到固态营养活化培养基斜面上，于28-34℃培养3-4天；从活化的斜面上刮取孢子接种到摇瓶培养基，于28-34℃，200r/min培养28-32h；
(2)选取步骤(1)所得的菌丝体制备原生质体：按100mg菌丝加入复合酶液1ml进行酶解，复合酶液含1.0％蜗牛酶、1.5％溶菌酶、2.0％纤维素酶，酶解温度为28-34℃。并向其中加入终浓度为1-5％的L-半胱氨酸作为脱壁促进剂，酶解2-4h后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，除去菌丝体碎片，滤液3000r/min离心10min，两次离心洗涤，用渗透压稳定剂重悬，得到纯化的原生质体，其中，所述渗透压稳定剂为：0.8mol/L NaCl和0.8mol/L山梨醇溶液，两者按照1:1体积比混合，混合溶液用作渗透压稳定剂，并以此渗透压稳定剂配制酶解液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
(3)紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变：将无菌培养皿置于磁力搅拌器上，紫外预热20min，然后吸取10mL原生质体悬液置于培养皿中，用功率为15W的紫外灯照射，在15-25cm的距离下照射，照射时间分别为60-80s，紫外照射以后暗处理一段时间以避免光复活，然后置于4℃冰箱冷藏2-3h以降低回复突变；取10ml经过紫外诱变后的原生质体于无菌三角瓶中，并加入渗透压稳定剂10mL，再加甲基磺酸乙酯至终浓度为20-40mg/L，吹打细胞使原生质体充分悬浮于甲基磺酸乙酯溶液中，30-35℃振荡处理30-50min，加入O.5mL 2％的硫代硫酸钠溶液终止反应，适当稀释后，取100μl涂布于再生培养基平板上，置于培养箱中28-30℃黑暗培养2-3d，其中，再生培养基为：含有0.6mol/L甘露醇土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO4 0.1，KCl 0.05，MgSO4 0.05g，琼脂粉15g，补充去离子水至1000ml，pH 4.0-5.0；
(4)突变菌株筛选：用接种钩挑再生培养基上的单菌落，分别接种于平板初筛培养基上，置于培养箱中28-34℃培养2-3d后观察透明圈，根据透明圈直径与菌落直径比值HC的大小初筛，将HC值大于嗜热拟青霉出发菌株的突变株的孢子接种到固态营养活化培养基培养，并根据菌株的酶活力进行复筛；
(5)孢子出芽：将筛选后的突变菌株接种到固态营养活化培养基，于28-34℃培养3-4天后，无菌水洗下孢子，制成单孢子悬液，再接种到接种到摇瓶培养基中，在28-34℃、180-200r/min的条件下振荡培养，培养8-10h后，绝大部分孢子萌发，停止震荡培养，收集培养液；
(6)硫酸二乙酯和微波复合诱变：取5mL出芽孢子，5000r/min离心5min，用无菌生理盐水洗涤沉淀，离心后向沉淀中加入pH为7.2的0.2mol/L磷酸缓冲液，调整孢子浓度为107个/mL，取0.2ml硫酸二乙酯，加入0.2ml无水乙醇使其溶解，再加入9.6ml无菌水，配制成浓度为2％的DES溶液，将DES溶液加入到出芽孢子悬浮液中，使其终浓度达到1-1.5％，混匀后于28℃振荡诱变30-60min，取出5000r/min离心5min，倒去上清液，用磷酸缓冲液洗涤3次，最后得到的出芽孢子适当稀释后进一步微波诱变；
取10ml以上诱变后的出芽孢子适当稀释悬液于100ml无菌三角瓶中，封口，三角瓶置于装有冰水混合物的大烧杯中，调微波炉功率700W，脉冲功率为2450Hz，对孢子悬液进行辐照处理，处理时间40-60s，每10-20s取出一次，震荡冷却，再放入微波炉中，累计计算时间；照射完毕后适当稀释，取0.1ml涂布于固态营养活化培养基上，28-34℃培养2-3d；
(7)第二次筛选：用接种钩挑固态营养活化培养基上选择200个单菌落，接种于平板初筛培养基上，置于培养箱中28-34℃培养2-3d后观察透明圈，将HC值大于出发菌株的突变菌株菌落接种到固态营养活化培养基培养，并根据菌株的酶活力进行复筛；
其中，所述平板初筛培养基为：葡萄糖80g，蛋白胨3g，(NH4)2HP04 0.39g，KH2P04O.19g，MgS04·7H20 0.16g，CaC03 3.5g，可溶性淀粉10g，KI 1.7g，脱氧胆酸钠0.2g，琼脂15g，磷酸缓冲液0.1mol/L，pH 4.0-5.0；
所述固态营养活化培养基为：土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO30.2g，K2HPO4 0.1g，KCl 0.05g，MgSO4 0.05g，琼脂粉15g，补充去离子水至1000ml，pH4.0-5.0；
所述摇瓶培养基为：土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO40.1g，KCl 0.05g，MgSO4 0.05g，补充去离子水至1000ml，pH4.0-5.0。
本发明中所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株能够用于制备在仔猪饲料中添加的葡萄糖氧化酶饲料酶。
本发明所述高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株用作制备饲料酶的优选，所述由嗜热拟青霉诱变菌株所产葡萄糖氧化酶在仔猪饲料中的添加方法为：将葡萄糖氧化酶发酵液8000r/min，离心20min，取上清，得到葡萄糖氧化酶粗酶液，在饲喂仔猪前将葡萄糖氧化酶粗酶液稀释10倍后均匀喷洒到固态饲料中，按照每公斤干饲料喷洒稀释后的葡萄糖氧化酶粗酶液1-3ml施用。
本发明所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉菌株具有以下特征：在PDA平板上菌落呈浅褐色，短绒毛状且较致密，菌落背面深褐色，边缘毛糙。分生孢子梗有横隔，分生孢子梗顶端生有帚状枝，分生孢子梗呈近球形，在菌丝端或短茎上轮生，生成较长的纠结链状，瓶梗基部膨大，上部逐渐变尖，形成一个产生分生孢子的管状体，略弯曲。
本发明的有益效果在于：
1、本发明中所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法简单、快速；
2、本发明中所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉具有营养要求低、繁殖快、发酵产物易于提取分离、发酵周期短的优点，且其发酵能够得到性质稳定的葡萄糖氧化酶，该复合酶耐高温、耐酸性好，特别适合用做饲料酶。
3、本发明所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉所制得的酶制剂能达到以下指标：产品热稳定性好，35℃下，保存6个月后酶活力仍大于80％，酶催化活性强，最适作用温度在50℃-70℃之间，最适作用pH值范围在3.0-7.0。
4、本发明诱变方法经过四次诱变，两次筛选，诱变效率高，筛选采用初筛和复筛，只有达到葡萄糖氧化酶产量高的突变株才被作为筛选对象，加快了育种的方向性，复筛在初筛基础上进行，显著降低了筛选工作量，而且复筛正突变率达到50％以上，而传统的随机挑选阳性率小于1％。
5、本发明还采用透明圈实验进行初筛，可根据透明圈直径和菌落直径比值初步淘汰大部分的负突变株和非突变株。一般地，透明圈直径越大，酶活力也越大，直观、简便易行。
6、本发明提供所述的诱变菌株生产耐热耐酸葡萄糖氧化酶，酶活单位明显提高，最高可提高2倍以上。
附图说明
图1为本发明所述高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法的流程示意图；
图2为实施例2所得的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的菌落形态图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1 产耐热耐酸葡萄糖氧化酶的原始菌株嗜热拟青霉的筛选
本实施例说明生产耐热耐酸葡萄糖氧化酶的原始菌株嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法，具体步骤如下：
步骤1采样及样品处理：
采用多点混合土样采集方法，从江苏省徐州市云龙区农村正处于高温发酵的堆肥中取土样，取样深度为15-20cm；土样由30个样点组成，每个点的取土深度及质量均匀一致，每个混合样品取500g，采样季节为夏季，称取固体土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，180r/min振荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入50-70℃恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样浑浊液。
步骤2菌株初筛：
将以上处理后的土样浑浊液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的培养液0.1-0.2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于30-40℃恒温培养箱中倒置培养18-72h，然后将平板置于30-45℃恒温培养箱中继续倒置培养1-3d；将平板上长出的菌落点种到葡萄糖氧化酶初筛培养基上，接种好的培养皿30-45℃恒温培养箱中倒置培养2-4d，然后置于4℃冰箱中静置1-2d，接着在室温下存放1-2d，挑取如下表1所示的透明圈较大的菌株接种至斜面培养基，进一步复筛。
步骤3菌株纯化：
将步骤2初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于30-45℃恒温培养箱中培养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化。
步骤4菌株复筛：
将初筛得到的纯化后各菌株分别接种到固体种子培养基上，30-40℃下培养3-5d，待孢子充分成熟后，加入无菌水，将孢子充分洗下，无菌水稀释孢子液至浓度为104-6个/ml，取孢子稀释液5-10ml接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/min转速下30-40℃进行液体震荡培养，培养2-3d后，按照6-10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下30-45℃进行液体震荡发酵培养，发酵培养3-7d，取发酵液12000r/min，10min离心后收集上清液测定葡萄糖氧化酶酶活性如下表2所示，选取酶活性较高的菌株XZ36进行划线传代培养，最终得到一株产酶稳定且有较高酶活的耐高温葡萄糖氧化酶产生菌株，纯化的菌株接种于PDA斜面培养基上，4℃保藏。
在实施例中，霉菌筛选培养基成分为：PDA培养基800mL，孟加拉红0.01-0.025g，氯霉素0.1-0.15g，无机盐营养液0.5-1mL，补水至1000mL，琼脂粉15g，该培养基中孟加拉红和氯霉素灭菌后加入，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
葡萄糖氧化酶初筛培养基由底层培养基和上层培养基构成，底层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO4 0.388g/L、KH2PO4 0.188g/L、MgSO4·7H2O0.156g/L、CaCO3 3.5g/L、琼脂15g/L；上层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、可溶性淀粉10g/L、KI 1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，并控制pH为4.5-5.0。
本实例所述的筛选方法中，所述固体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL、无机盐营养液1mL、琼脂粉1.5g，并控制pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
无机盐营养液：NaNO3 2.0g，K2PO4 1.5g，CaCl2 1.5g，MgSO4 0.3g，FeSO4·7H2O0.1g，MnSO4·H2O 1.6mg，ZnSO4·H2O 0.05g，CoCl2 0.5mg，(NH4)2SO4 5g，去离子水1000mL。
本实例所述的筛选方法中，所述液体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
本实例所述的筛选方法中，葡萄糖氧化酶的测定方法如下：发酵液的葡萄糖氧化酶活力测定：
在有氧条件下，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2，H2O2和邻联茴香胺在辣根过氧化物酶作用下显色。利用分光光度计在525nm处测定其吸光值，根据酶活和吸光值的关系测定葡萄糖氧化酶的活性。取0.20mmol/L邻联茴香胺溶液2.4mL(pH5.0、50mmol/L的磷酸缓冲溶液配制)、10％(w/w)葡萄糖溶液0.5mL、60U/mL辣根过氧化物酶溶液100μL，混匀后置于40℃恒温水浴摇床震荡孵育10min；加入适当稀释后的粗酶液样品200μL，颠倒混匀后继续40℃水浴摇床震荡温育60s，再加入2mL浓盐酸(5mol/L)终止反应。置于凉水使得反应颜色稳定。在460nm波长处测定吸光度，用预先灭活的酶液作空白对照。葡萄糖氧化酶的活力单位(U)定义为：在上述条件下每分钟催化葡萄糖氧化产生1μmoL H2O2所需的酶量为1个活力单位。
本实例所述的筛选方法中，所述液体发酵培养基的成分如下：PDA培养基80mL、无机盐营养液1mL、蛋白胨1g、吐温800.5mL、(NH4)2SO41g，pH为4.0-5.0补充去离子水至100mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
本实例所述的筛选方法中，所述PDA培养基的成分如下：马铃薯200g、蔗糖20g、其余为蒸馏水并定容至1000mL。
表1 产葡萄糖氧化酶初筛选择培养基霉菌平板初筛结果
表2 各菌株上清液葡萄糖氧化酶酶活性
本实例所得菌株XZ36，在PDA平板上菌落呈浅褐色，短绒毛状且较致密，菌落背面深褐色，边缘毛糙，分生孢子梗有横隔，分生孢子梗顶端生有帚状枝，分生孢子梗呈近球形，在菌丝端或短茎上轮生，生成较长的纠结链状，瓶梗基部膨大，上部逐渐变尖，形成一个产生分生孢子的管状体，略弯曲，对照《真菌鉴定手册》初步确定该菌株是嗜热拟青霉。
提取本实例中菌株XZ36基因组，依据真菌18SrDNA中最保守的序列设计引物，扩增采用上游引物：5'-CCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，下游引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性40S，52℃退火40S，72℃延伸lmin，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物连接pMD18-T载体。PCR反应体系为：10×Buffer2μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，上游引物1μL，下游引物1μL，template10～50ng，Taq酶(2.5U)0.3μL，加水补足20μL。经PCR扩增得到其18S rDNA片段712bp。将该扩增片段凝胶回收并测序，提交GenBank进行核酸同源性分析，测得序列与从NCBI中比对获得的相近霉菌的18SrDNA序列采用ClustalX1.83进行多序列比对，然后采用MEGA4.0生物学软件构建系统进化树，结果显示菌株XZ36的18S rDNA核苷酸序列与Paecilomyces thermophila的18S rDNA核苷酸序列同源性最高，最大相似性(maxident)达到99％。综合结合其形态特征、培养特征观察，将菌株XZ36鉴定为嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)。
实施例2 利用嗜热拟青霉出发菌株进行诱变育种
筛选获得的原始菌株XZ36作为出发菌株，进一步复合诱变。诱变流程如图1所示。包括以下步骤：
1、将实施例1中筛选到的嗜热拟青霉(Paecilomyces thermophila)XZ36作为诱变出发菌株接到固态营养活化培养基斜面上，于28-34℃培养3-4天。固态营养活化培养基为：土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO4 0.1，KCl 0.05，MgSO4 0.05g，琼脂粉15g，补充去离子水至1000ml，pH4.0-5.0。
2、从活化的斜面上刮取孢子接种到摇瓶培养基，28-34℃，200r/min培养28-32h，其中摇瓶培养基为：土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO4 0.1，KCl0.05，MgSO4 0.05g，补充去离子水至1000ml，pH4.0-5.0。
3、制备原生质体
选取以上培养了28-32h的菌丝体制备原生质体。然后按100mg菌丝加入复合酶液1ml进行酶解，复合酶配比为1.0％蜗牛酶、1.5％溶菌酶、2.0％纤维素酶。酶解温度为28-34℃。并向其中加入终浓度为1-5％的L-半胱氨酸作为脱壁促进剂。酶解2-4h后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，除去菌丝体碎片，滤液3000r/min离心10min，两次离心洗涤，用渗透压稳定剂重悬，得到纯化的原生质体。渗透压稳定剂：分别配制0.8mol/L NaCl和0.8mol/L山梨醇溶液，两者按照1:1体积比混合，混合溶液用作渗透压稳定剂。以此渗透压稳定剂配制酶解液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用。
4、对原生质体紫外线诱变
将无菌培养皿置于磁力搅拌器上，紫外预热20min，然后吸取10mL原生质体悬液置于培养皿中，用功率为15W的紫外灯照射，在15-25cm的距离下照射，照射时间分别为60-80s。紫外照射以后暗处理一段时间以避免光复活，然后置于4℃冰箱冷藏2-3h以降低回复突变。紫外诱变后的原生质体用于甲基磺酸乙酯诱变。
5、甲基磺酸乙酯诱变
取10ml经过紫外诱变后的原生质体于无菌三角瓶中，并加入渗透压稳定剂10mL，再加甲基磺酸乙酯至终浓度为20-40mg/L，吹打细胞使原生质体充分悬浮于甲基磺酸乙酯溶液中。30-35℃振荡处理30-50min，加入O.5mL 2％的硫代硫酸钠溶液终止反应。适当稀释后，取100μl涂布于再生培养基平板上，置于培养箱中28-30℃黑暗培养2-3d。再生培养基为：土豆浸出液800ml(含有0.6mol/L甘露醇)、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO40.1，KCl 0.05，MgSO4 0.05g，琼脂粉15g，补充去离子水至1000ml，pH4.0-5.0。
6、诱变菌株平板初筛
将经过紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变后的原生质体涂布于再生培养基上生长，用接种钩挑再生培养基上的单菌落，分别接种于平板初筛培养基上，置于培养箱中28-34℃培养2-3d后观察透明圈，根据透明圈直径与菌落直径比值(HC)的大小初筛。将HC值大于出发菌株的突变株的孢子接种固态营养活化培养基培养。平板初筛培养基为：葡萄糖80，蛋白胨3，(NH4)2HP04 0.39，KH2P04 O.19，MgS04·7H20 0.16，CaC03 3.5，可溶性淀粉10，KI 1.7，脱氧胆酸钠0.2，琼脂15，磷酸缓冲液0.1mol/L，pH4.0-5.0。
嗜热拟青霉原生质体经过紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变后，从固态营养活化培养基上选取菌落生长较快的180个菌落接种到平板初筛培养基进行透明圈初筛，得到透明圈大于出发菌株的菌株28株，对这28株菌进行第一轮复筛(见下表3)。由表3中可得，相对酶活力(以诱变菌株的酶活力同出发菌株酶活力的比值)小于100％的负突变株比例28.57％，相对酶活力大于150％的突变株占14.29％，相对酶活力介于120％～150％比例为35.71％。其中菌株XZP70酶活力最大，为136U/ml,为出发菌株酶活力的181.33％。因此，选取该菌株XZP70作为第二轮诱变的出发菌株在进行硫酸二乙酯与微波复合诱变。
表3 第一轮复筛葡萄糖氧化酶活力
7、嗜热拟青霉XZP70出芽孢子硫酸二乙酯-微波复合诱变
1)孢子出芽
第一轮诱变得到的突变菌株XZP89接种到固态营养活化培养基，于28-34℃培养3-4天后，无菌水洗下孢子，制成单孢子悬液。再接种到接种到摇瓶培养基中，在28-34℃、180-200r/min的条件下振荡培养，培养8-10h后，绝大部分孢子萌发，停止震荡培养，收集培养液。
2)出芽孢子硫酸二乙酯诱变
取5mL出芽孢子，5000r/min离心5min，用无菌生理盐水洗涤沉淀，离心后向沉淀中加入0.2mol/L磷酸缓冲液(pH为7.2)，调整孢子浓度为107个/mL。取0.2ml硫酸二乙酯，加入0.2ml无水乙醇使其溶解，再加入9.6ml无菌水，配制成浓度为2％的DES溶液。将DES溶液加入到出芽孢子悬浮液中，使其终浓度达到1-1.5％，混匀后于28℃振荡诱变30-60min，取出5000r/min离心5min，倒去上清液，用磷酸缓冲液洗涤3次，最后得到的出芽孢子适当稀释后进一步微波诱变。
3)出芽孢子微波诱变
取10ml诱变后的出芽孢子适当稀释悬液于100ml无菌三角瓶中，封口，三角瓶置于装有冰水混合物的大烧杯中，调微波炉功率700W，脉冲功率为2450Hz，对孢子悬液进行辐照处理，处理时间40-60s。每10-20s取出一次，震荡冷却，再放入微波炉中，累计计算时间。
照射完毕后适当稀释，取0.1ml涂布于固态营养活化培养基上，28-34℃培养2-3d。用接种钩挑固态营养活化培养基上选择200个单菌落，接种于平板初筛培养基上，置于培养箱中28-34℃培养2-3d后观察透明圈，根据透明圈直径与菌落直径比值的大小初筛。将HC值大于出发菌株的突变株36个菌落接种到摇瓶培养基中进行第二次复筛(见表4)。相对酶活力(以诱变菌株的酶活力同出发菌株XZP70酶活力的比值)小于100％的负突变株比例33.33％，相对酶活力大于100％的突变株占27.78％，相对酶活力介于100％～120％比例为38.89％。
8、菌株遗传稳定性测定
以上复筛后将产量较高的菌株进行遗传稳定性考察。将每个菌株连传10代，每代均先接入种子液，每株菌每代培养3个液体摇瓶，以种子液按照6-10％的接种量接种摇瓶培养基，30-34℃，发酵3-4d。发酵结束，菌株显示稳定的发酵性能。其中产量较高、稳定性最好的菌株为XZPT6。该菌株传10代后，产量为185U/ml左右,为出发菌株XZP89酶活力的136.03％,是初筛菌株XZ36酶活力的246.67％。将诱变菌株XZPT6保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13182。
表4 第二轮复合诱变复筛葡萄糖氧化酶活力
9、诱变菌株诱变菌株XZPT6的特性
(1)菌体形态：分生孢子梗有横隔，分生孢子梗顶端生有帚状枝，分生孢子梗呈近球形，在菌丝端或短茎上轮生，生成较长的纠结链状，瓶梗基部膨大，上部逐渐变尖，形成一个产生分生孢子的管状体，略弯曲。
(2)菌落形态：在PDA平板上菌落呈浅褐色，短绒毛状且较致密，菌落背面深褐色，边缘毛糙。菌落形态如图2所示。
(3)培养特征：适宜培养温度30-40℃。
(4)以诱变得到的菌株XZPT6为菌种，发酵制备得到葡萄糖氧化酶，酶学性质研究发现，该酶热稳定性好，35℃下，保存6个月后酶活力仍大于80％，酶催化活性强，最适作用温度在50℃-70℃之间，本产品最适作用pH值范围在3.0-7.0。
实施例3 嗜热拟青霉诱变菌株XZPT6产葡萄糖氧化酶在断奶仔猪中的应用
选择健康、体重约为8kg的断奶仔猪60头，按体重相近，公母各半的原则将其分为2组，每组30头。其中对照组是基础饲粮原料，不添加葡萄糖氧化酶，试验组是在基础饲粮原料中添加由嗜热拟青霉诱变菌株XZPT6所产葡萄糖氧化酶，添加方法如下：将葡萄糖氧化酶发酵液8000r/min，离心20min，取上清，得到葡萄糖氧化酶粗酶液。在饲喂仔猪前将葡萄糖氧化酶粗酶液稀释10倍后均匀喷洒到固态饲料中，按照每公斤干饲料喷洒稀释后的葡萄糖氧化酶粗酶液1-3ml。试验猪的饲养管理按生产常规进行，自由饮水，自由采食，试验期间腹泻猪不用药物治疗。试验期为30天。在试验过程中，测定每个猪的日采食量；在试验始、末，对供试猪个体称重；测定猪日增重、日耗料量、料重比。观测记录猪群健康指标，记录每天每组每头猪的腹泻次数和持续时间。结果如表5所示，在试验期中，对照组有2头猪发生腹泻，共腹泻7天。试验组猪健康状况良好，未发生腹泻现象。对照组存活率为90％，而添加葡萄糖氧化酶的试验组存活率为100％。
在试验过程中，与对照组相比，试验组仔猪饲养过程未发生任何不良状况，猪外观皮肤、毛色、健康状况及行为均正常。
表5 试验猪健康状况测定结果
注：腹泻频率次数＝腹泻猪头数×腹泻天数
葡萄糖氧化酶对仔猪生产性能的影响：
表6 葡萄糖氧化酶对仔猪生产性能的影响
由表6可见，始重：对照组同试验组猪的始重没有显著差异；未重：试验组猪的平均增重较对照组提高了7.32％；日均增重：试验组猪的日均增重较对照组提高了12.80％，增重效果非常明显；说明葡萄糖氧化酶能促进猪的生长，提高猪的生产性能。综上得出结论：本发明嗜热拟青霉诱变菌株XZPT6所产葡萄糖氧化酶能不仅能够显著增强仔猪机体免疫力，杀灭肠道内有害致病菌，还能促进生长，在提高仔猪日增重及降低料肉，能较大程度的提高饲料的转化利用率，提高仔猪的生产性能。
以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。

Claims (10)

1.一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株Paecilomycesthermophila，其于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13182。
2.如权利要求1所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，先将嗜热拟青霉出发菌株通过紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变得到突变菌株，再将突变菌株筛选后，进行硫酸二乙酯和微波复合诱变和第二次筛选得到嗜热拟青霉诱变菌株。
3.根据权利要求2所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法具体包括以下步骤：
(1)采样及样品处理：采用多点混合土样采集方法，从正处于高温发酵的堆肥中取土样，取样深度为15-20cm，土样为由若干样点组成的混合样品，每个点的取土深度及质量均匀一致，混合样品取500g，采样季节为夏季，称取混合样品内固体土样5g，放入装有玻璃珠及50mL已灭菌生理盐水的三角瓶中，180r/min振荡30min，制成悬液，然后将此三角瓶放入50-70℃恒温震荡水浴锅中，100r/min震荡处理20-30min，得土样浑浊液；
(2)菌株初筛：将富集后的培养液逐级稀释到10-3、10-4、10-5、10-6，取各级稀释的培养液各0.1-0.2mL分别涂布于霉菌筛选培养基上，待该培养基培养皿晾至表面没有流动液体时，用保鲜膜将培养皿口封好，并置于30-40℃恒温培养箱中倒置培养18-72h，然后将平板置于30-45℃恒温培养箱中继续倒置培养1-3d，将平板上长出的菌落点种到葡萄糖氧化酶初筛选择培养基上，接种好的培养皿30-45℃恒温培养箱中倒置培养2-4d，然后置于4℃冰箱中静置1-2d，接着在室温下存放1-2d，挑取透明圈较大的菌株接种至斜面培养基，进一步复筛；
(3)菌株纯化：将步骤(2)初筛得到的菌株于PDA培养基平板上划线，置于30-45℃恒温培养箱中培养2-3d，重复划线培养三次以上，如连续多次观察到菌落形态一致则认为菌株已纯化；
(4)菌株复筛：将初筛得到的纯化后各菌株分别接种到固体种子培养基上，30-40℃下培养3-5d，待孢子充分成熟后，加入无菌水，将孢子充分洗下，无菌水稀释孢子液至浓度为104-6个/ml，取孢子稀释液5-10ml接种到装有30-50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，在160-180r/min转速下30-40℃进行液体震荡培养，培养2-3d后，按照6-10％(v/v)的接种量，将液体种子接种到液体发酵培养基中，在160-180r/min转速下30-45℃进行液体震荡发酵培养，发酵培养3-7d，取发酵液12000r/min，10min离心后收集上清液测定葡萄糖氧化酶酶活性，选取酶活性均较高的菌株进行划线传代培养，直至得到一株产酶稳定且有较高酶活的耐高温葡萄糖氧化酶产生菌株，即为嗜热拟青霉出发菌株；
其中，霉菌筛选培养基成分为：PDA培养基800mL，孟加拉红0.01-0.025g，氯霉素0.1-0.15g，无机盐营养液0.5-1mL，调节pH4.0-5.0，补水至1000mL，琼脂粉15g，该培养基中孟加拉红和氯霉素灭菌后加入，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min；葡萄糖氧化酶初筛培养基由底层培养基和上层培养基构成，底层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、蛋白胨3g/L、(NH4)2HPO4 0.388g/L、KH2PO4 0.188g/L、MgSO4·7H2O 0.156g/L、CaCO3 3.5g/L、琼脂15g/L；上层培养基的成分为：葡萄糖80g/L、可溶性淀粉10g/L、KI 1.7g/L、去氧胆酸钠0.2g/L、磷酸缓冲液0.1mol/L、琼脂20g/L，并控制pH为4.0-5.0。
4.根据权利要求3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述固体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL、无机盐营养液1mL、琼脂粉1.5g，并控制pH为4.0-5.0，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
5.根据权利要求3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体种子培养基的成分如下：PDA培养基99mL，无机盐营养液1mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
6.根据权利要求3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述嗜热拟青霉出发菌株的筛选方法中所述液体发酵培养基的成分如下：PDA培养基80mL、无机盐营养液1mL、蛋白胨1g、吐温80 0.5mL、(NH4)2SO4 1g，pH为4.0-5.0，补充去离子水至100mL，且该培养基使用前于121℃下恒温灭菌15min。
7.根据权利要求3-6任一项所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，所述无机盐营养液为：NaNO3 2.0g，K2PO4 1.5g，CaCl2 1.5g，MgSO4 0.3g，FeSO4·7H2O 0.1g，MnSO4·H2O 1.6mg，ZnSO4·H2O 0.05g，CoCl2 0.5mg，(NH4)2SO4 5g，去离子水1000mL。
8.根据权利要求2或3所述的一种高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的诱变方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)将嗜热拟青霉出发菌株接到固态营养活化培养基斜面上，于28-34℃培养3-4天；从活化的斜面上刮取孢子接种到摇瓶培养基，于28-34℃，200r/min培养28-32h；
(2)选取步骤(1)所得的菌丝体制备原生质体：按100mg菌丝加入复合酶液1ml进行酶解，复合酶液含1.0％蜗牛酶、1.5％溶菌酶、2.0％纤维素酶，酶解温度为28-34℃。并向其中加入终浓度为1-5％的L-半胱氨酸作为脱壁促进剂，酶解2-4h后，酶解液用3层无菌镜头纸过滤，除去菌丝体碎片，滤液3000r/min离心10min，两次离心洗涤，用渗透压稳定剂重悬，得到纯化的原生质体，其中，所述渗透压稳定剂为：0.8mol/L NaCl和0.8mol/L山梨醇溶液，两者按照1:1体积比混合，混合溶液用作渗透压稳定剂，并以此渗透压稳定剂配制酶解液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，保存于4℃冰箱备用；
(3)紫外线和甲基磺酸乙酯复合诱变：将无菌培养皿置于磁力搅拌器上，紫外预热20min，然后吸取10mL原生质体悬液置于培养皿中，用功率为15W的紫外灯照射，在15-25cm的距离下照射，照射时间分别为60-80s，紫外照射以后暗处理一段时间以避免光复活，然后置于4℃冰箱冷藏2-3h以降低回复突变；取10ml经过紫外诱变后的原生质体于无菌三角瓶中，并加入渗透压稳定剂10mL，再加甲基磺酸乙酯至终浓度为20-40mg/L，吹打细胞使原生质体充分悬浮于甲基磺酸乙酯溶液中，30-35℃振荡处理30-50min，加入O.5mL 2％的硫代硫酸钠溶液终止反应，适当稀释后，取100μl涂布于再生培养基平板上，置于培养箱中28-30℃黑暗培养2-3d，其中，再生培养基为：含有0.6mol/L甘露醇土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO4 0.1，KCl 0.05，MgSO4 0.05g，琼脂粉15g，补充去离子水至1000ml，pH 4.0-5.0；
(4)突变菌株筛选：用接种钩挑再生培养基上的单菌落，分别接种于平板初筛培养基上，置于培养箱中28-34℃培养2-3d后观察透明圈，根据透明圈直径与菌落直径比值HC的大小初筛，将HC值大于嗜热拟青霉出发菌株的突变株的孢子接种到摇瓶培养基发酵培养，并根据菌株的酶活力进行复筛；
(5)孢子出芽：将筛选后的突变菌株接种到固态营养活化培养基，于28-34℃培养3-4天后，无菌水洗下孢子，制成单孢子悬液，再接种到接种到摇瓶培养基中，在28-34℃、180-200r/min的条件下振荡培养，培养8-10h后，绝大部分孢子萌发，停止震荡培养，收集培养液；
(6)硫酸二乙酯和微波复合诱变：取5mL出芽孢子，5000r/min离心5min，用无菌生理盐水洗涤沉淀，离心后向沉淀中加入pH为7.2的0.2mol/L磷酸缓冲液，调整孢子浓度为107个/mL，取0.2ml硫酸二乙酯，加入0.2ml无水乙醇使其溶解，再加入9.6ml无菌水，配制成浓度为2％的DES溶液，将DES溶液加入到出芽孢子悬浮液中，使其终浓度达到1-1.5％，混匀后于28℃振荡诱变30-60min，取出5000r/min离心5min，倒去上清液，用磷酸缓冲液洗涤3次，最后得到的出芽孢子适当稀释后进一步微波诱变；
取10ml以上诱变后的出芽孢子适当稀释悬液于100ml无菌三角瓶中，封口，三角瓶置于装有冰水混合物的大烧杯中，调微波炉功率700W，脉冲功率为2450Hz，对孢子悬液进行辐照处理，处理时间40-60s，每10-20s取出一次，震荡冷却，再放入微波炉中，累计计算时间；照射完毕后适当稀释，取0.1ml涂布于固态营养活化培养基上，28-34℃培养2-3d；
(7)第二次筛选：用接种钩挑固态营养活化培养基上选择200个单菌落，接种于平板初筛培养基上，置于培养箱中28-34℃培养2-3d后观察透明圈，将HC值大于出发菌株的突变菌株菌落接种到摇瓶培养基中培养，并根据菌株的酶活力进行复筛；
其中，所述平板初筛培养基为：葡萄糖80g，蛋白胨3g，(NH4)2HPO4 0.39g，KH2PO4 O.19g，MgSO4·7H2O 0.16g，CaCO3 3.5g，可溶性淀粉10g，KI 1.7g，脱氧胆酸钠0.2g，琼脂15g，磷酸缓冲液0.1mol/L，pH 4.0-5.0；
所述固态营养活化培养基为：土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO4 0.1g，KCl 0.05g，MgSO4 0.05g，琼脂粉15g，补充去离子水至1000ml，pH 4.0-5.0；
所述摇瓶培养基为：土豆浸出液800ml、蔗糖20g、酵母粉5-8g，NaNO3 0.2g，K2HPO40.1g，KCl 0.05g，MgSO4 0.05g，补充去离子水至1000ml，pH 4.0-5.0。
9.如权利要求1所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株用于制备在仔猪饲料中添加的葡萄糖氧化酶饲料酶。
10.根据权利要求9所述的高产耐高温耐酸的葡萄糖氧化酶的嗜热拟青霉诱变菌株的应用，其特征在于，所述由嗜热拟青霉诱变菌株所产葡萄糖氧化酶在仔猪饲料中的添加方法为：将葡萄糖氧化酶发酵液8000r/min，离心20min，取上清，得到葡萄糖氧化酶粗酶液，在饲喂仔猪前将葡萄糖氧化酶粗酶液稀释10倍后均匀喷洒到固态饲料中，按照每公斤干饲料喷洒稀释后的葡萄糖氧化酶粗酶液1-3ml施用。
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