CN106929489A - 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法 - Google Patents

一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106929489A
CN106929489A CN201611256575.5A CN201611256575A CN106929489A CN 106929489 A CN106929489 A CN 106929489A CN 201611256575 A CN201611256575 A CN 201611256575A CN 106929489 A CN106929489 A CN 106929489A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glucose oxidase
fermentation
paecilomyces
thermaphila
final product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611256575.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106929489B (zh
Inventor
高兆建
张铁柱
孙会刚
李同祥
刘恩岐
曹建冬
顾强
沈彬彬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CHONGQING FULING ZIZHU FOOD Co.,Ltd.
Original Assignee
Xuzhou University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xuzhou University of Technology filed Critical Xuzhou University of Technology
Priority to CN201611256575.5A priority Critical patent/CN106929489B/zh
Publication of CN106929489A publication Critical patent/CN106929489A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106929489B publication Critical patent/CN106929489B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法，属于微生物技术领域。该发酵制备得到葡萄糖氧化酶具有高的耐热性和耐酸性，解决了在食品及饲料中因高温及酸性环境中使用导致的酶活力低的缺陷。具体步骤如下：将菌种培养成孢子并将孢子清洗后制备单孢子菌悬液；将单孢子菌悬液接入种子培养基中发酵培养；将种子培养液接入摇瓶发酵培养基中发酵培养，将发酵补充营养液加入发酵液中；糊精、可溶性淀粉及山梨酸钾加入发酵液中并搅拌均匀，将发酵液冷冻，干燥并粉碎，得葡萄糖氧化酶。发酵得到的葡萄糖氧化酶粗酶液经过热处理、硫酸铵‑乙醇复合沉淀及离子交换层析和分子筛凝胶过滤层析，得到高回收率高纯度的葡萄糖氧化酶。

Description

一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶是酶技术领域中一种非常重要的酶，它能利用分子氧作为电子受体，专一催化β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢。由于其与生命重要物质葡萄糖和氧的密切关系，导致了它在科研、医药和食品工业生产上广泛的应用。在食品工业中，葡萄糖氧化酶可用于除去食品或药品中的葡萄糖，从而防止食品发生褐变或获得纯度较高的低聚糖；同时，葡萄糖氧化酶凭其天然的优良特性,可作为一个较为理想的溴酸钾取代物，用作一种更为安全的面粉改良剂；在发酵工业中，葡萄糖氧化酶的催化产物-葡萄糖酸，可用于生产葡萄糖酸钙、葡萄糖酸锌等；在医学诊断方面，鉴于葡萄糖氧化酶作用的高度专一性,也被用于一些复杂生化体系中葡萄糖的定量测定,如快速检测血糖、尿糖。
国家知识产权局于2014年8月6日公布的一篇专利申请号为201410228211.0，名称：葡萄糖氧化酶制剂的制备方法及其利用，此专利提出如下技术方案：将特异青霉接种于含有碳源、氮源、无机盐液及微量元素的发酵培养基的发酵罐进行通气发酵制成发酵液，发酵液经固液分离制成葡萄糖氧化酶制剂，该菌种制备的葡萄糖氧化酶存在如下的技术问题：其一，该菌种发酵培养产生的葡萄糖氧化酶的热稳定性差，并且在酸性环境下很容易失活，不具有耐酸性；其二，该菌种发酵培养产生的葡萄糖氧化酶的酶活力低，且生产效率低下；这俩个问题大大限制了该菌种制备的葡萄糖氧化酶的使用范围，因此，该制备方法制备的葡萄糖氧化酶难以在市场上推广和使用。
目前国内外己有许多葡萄糖氧化酶的相关研究报道，其中大部分来源于微生物，微生物中一般对中温菌的产酶研究较多，而对嗜热真菌产耐热葡萄糖氧化酶的研究相对较少。因此，研究嗜热拟青霉产耐热性的葡萄糖氧化酶具有重大的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种热稳定性高、耐酸性好的且酶活力高的葡萄糖氧化酶酶制剂的发酵制备方法及分离纯化方法，本发明通过分段培养及中间补料技术提高葡萄糖氧化酶的产量，并进一步从发酵液中分离纯化到高纯度的葡萄糖氧化酶。该发酵制备的葡萄糖氧化酶耐热性高、耐酸性好，非常适合在食品及饲料中适用。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；
(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；
(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；
(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以4～8％(v/v)的接种量接入装有30～50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160～200r/min、温度为30～45的条件下，摇床培养18～24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；
(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6～10％(v/v)的接种量接入装有150～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160～200r/min、温度为40～45℃的条件下摇床发酵30～48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；
(6)将60～100mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37～40℃时，调节发酵液一的pH为5～6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28～32℃，再次向发酵液一中加入50～80mL的发酵补充营养液，并继续发酵24～48h，即得发酵液二；
(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，得沉淀和上清液，将上清液用超滤膜超滤2次，即得截留液，将所得截留液浓缩3～4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60～70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；
(8)将1～2wt％的糊精、2～4wt％的可溶性淀粉和0.1～0.2wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻6～8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。
进一步地，所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。
进一步地，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。
进一步地，所述步骤(2)中斜面培养基为嗜热拟青霉孢子培养基。
进一步地，所述嗜热拟青霉孢子培养基的成分及配比为土豆浸出液50mL、麸皮浸出液50mL、蔗糖1g及琼脂粉1.5g。
进一步地，所述麸皮浸出液的制备方法如下：称取50g麸皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并过滤，得麸皮滤液，将麸皮滤液定容到200mL，即得麸皮浸出液。
进一步地，所述步骤(5)中的摇瓶发酵培养基的成分及配比为PDA浸出液100mL、麸皮浸出液100mL、蔗糖15～20g、豆粕粉10～15g、谷朊粉10～20g、玉米粉5～10g、蛋白胨5～10g、硫酸铵0.5g、硝酸铵2～5g、尿素2～5g、玉米浆20～30mL、吐温80 2～5mL及复合微量元素1～5mL，并加去离子水至1000mL；所述复合微量元素的成分为MnCl2·4H2O 0.1g、CoCl20.05g、CuSO4 0.02g、MgSO4 0.3g、K2PO4 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、ZnCl2 0.03g、LiCl 0.05g、CaCl2 0.05g、H3BO3 0.01g及KI 0.5g，并加去离子水1000mL。
进一步地，所述步骤(6)中发酵补充营养液的成分及配比为蔗糖20～50g、豆饼粉20～50g、尿素5g、NH4NO3 5g、补充去离子水至1000mL。
进一步地，所述步骤(7)中第一次采用截留分子质量为100～120kDa的超滤膜；第二次采用截留分子质量为20～30kDa的超滤膜。
本发明还提供了一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉发酵培养液在8000r/min的条件下，离心20～30min，弃沉淀保留上清液，将上清液加热至80℃，保温20～30min，待上清液冷却至室温后放置4℃的条件下静置6～8h，将静置后的上清液置于8000r/min的条件下，离心20～30min，去掉沉淀下的杂蛋白；
(2)向热处理后的葡萄糖氧化酶粗酶液中加入硫酸铵，至饱和度达到30～40％，并调节其pH为6.5～7.0，在4℃下的条件下，静置24～28h后，在8000r/min的条件下，离心20～40min，弃沉淀保留上清液，向上清液中加入50～70％的无水乙醇，并调节其pH为5.5～6.0，4℃下静置24h后，于8000r/min的条件下，冷冻离心20～35min，弃上清液，将沉淀用去离子水溶解，并充分透析脱盐；
(3)透析脱盐后的酶液，上样至经Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱，上样后用Tris-HCl缓冲液充分淋洗至A280不发生变化，然后采用含0～0.5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液以1～1.5mL/min流速进行线性梯度洗脱，每管收集3mL；
(4)将上述分离纯化的酶液，上样至经0.05mo1/L pH为6.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex G-100凝胶层析柱，采用0.05mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液以0.5mL/min流速进行洗脱，每管收集2mL。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果：
(1)本发明中使用嗜热拟青霉发酵培养产生葡萄糖氧化酶，该菌种对营养的要求较低、发酵周期短且繁殖速度快，在很短时间内，即可产生大量的葡萄糖氧化酶产品，嗜热拟青霉的发酵产物易于提取分离，简化了分离提取步骤，因此，节省了大量的人力和财力；嗜热拟青霉需要在较高的温度下发酵培养，因此培养基中一般不会感染其他杂菌，保证了葡萄糖氧化酶的纯度。
(2)本发明中嗜热拟青霉产生的葡萄糖氧化酶具有较高的热稳定性，葡萄糖氧化酶具有热稳定性，一方面葡萄糖氧化酶在催化底物时，较高的温度可以提高整个反应的反应速率和水解速率，缩短反应时间，另一方面还有利于运输、储藏和使用，更适合于工业化应用等。
(3)本发明中嗜热拟青霉产生的葡萄糖氧化酶具有耐酸性，当pH范围为2～8时，在24h内葡萄糖氧化酶的活性基本不发生变化，且相对酶活均在80％以上。
(4)本发明中发酵培养基的科学配方、发酵过程的补料控制技术以及分阶段控制参数可使嗜热拟青霉发酵培养产生的葡萄糖氧化酶经优化摇瓶产量可达216U/mL，制备得到的固态酶活达到456U/g，并且生产的葡萄糖氧化酶的活力高，稳定性好，易于储存，可用于制备饲料酶制剂；本发明中的发酵补充营养液分两次加入，可以防止一次性加入发酵补充营养液带来的渗透压过大，从而抑制菌体生长弊端；同时本发明中培养基的科学配方可以提高发酵的产量。
(5)本发明中摇瓶发酵培养基碳源氮源搭配合理，速效碳源和迟效碳源配合使用，不仅能充分供给具体生长所需的能量还会在产物合成阶段提供具体足够碳源，还不会发生碳源浓度高而出现的菌体早衰现象。另外氮源使用了不同种类的天然农副产物，提供足够氮源还能够提供不同类别的生长因子，酶活力激活因子。
(6)本发明的葡萄糖氧化酶的分离纯化方法避免使用强酸强碱，能有效分离杂蛋白色素等杂质，同时保证酶不被破坏，分离效果好，收率高。
(7)本发明分离得到电泳纯葡萄糖氧化酶纯品、该酶的比活力为11806.96U/mg，回收率为55.75％，纯化倍数为273.24倍。本发明流程简单，便于操作，回收率高，且生产成本较低，可用于大规模生产，具有较好的经济发展前景。这为该酶的高效分离纯化提供了技术支持。
综上所述，本发明中制备的葡萄糖氧化酶具有酶活力高、稳定性好等优点，并且该制备方法的生产工艺简单，生产效率高，具有极大的市场推广价值。
附图说明
图1为本发明中葡萄糖氧化酶DEAE-Sephadex A-50离子交换层析；
图2为本发明中葡萄糖氧化酶的Sephadex G-100分子筛凝胶过滤层析；
图3为本发明中葡萄糖氧化酶系列纯化电泳图；
图4为温度对葡萄糖氧化酶活性的影响示意图；
图5为pH对发酵制备的葡萄糖氧化酶活性的影响示意图；
图6为发酵制备的葡萄糖氧化酶热稳定性示意图；
图7为发酵制备的葡萄糖氧化酶酸碱稳定性示意图。
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明筛选得到一株嗜热拟青霉菌株，该菌株于2016年11月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO.13182，分类学命名：嗜热拟青霉XZPT6(Paecilomyces thermophila XZPT6)。
实施例1
一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于35℃的恒温培养箱中活化培养50h，即得嗜热拟青霉丝；
(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于嗜热拟青霉孢子培养基，并将嗜热拟青霉孢子培养基置于35℃的条件下培养3d，即得孢子；
(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡40min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；
(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以6％(v/v)的接种量接入装有40mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为180r/min、温度为40的条件下，摇床培养20h，即得嗜热拟青霉种子培养液；
(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以8％(v/v)的接种量接入装有180mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为180r/min、温度为40℃的条件下摇床发酵40h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；
(6)将80mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至38℃时，调节发酵液一的pH为5，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至30℃，再次向发酵液一中加入60mL的发酵补充营养液，并继续发酵30h，即得发酵液二；
(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心30min，得沉淀和上清液，将上清液用截留分子质量为110kDa的超滤膜超滤，得滤液一，将滤液一用截留分子质量为25kDa的超滤膜超滤，即得截留液，将所得截留液浓缩3倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在65℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；
(8)将1wt％的糊精、3wt％的可溶性淀粉和0.1wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻7h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度40Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥18h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。
在本实施例中，所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。
在本实施例中，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。
在本实施例中，所述嗜热拟青霉孢子培养基的成分及配比为土豆浸出液50mL、麸皮浸出液50mL、蔗糖1g及琼脂粉1.5g。
在本实施例中，所述麸皮浸出液的制备方法如下：称取50g麸皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并过滤，得麸皮滤液，将麸皮滤液定容到200mL，即得麸皮浸出液。
在本实施例中，所述步骤(5)中的摇瓶发酵培养基的成分及配比为PDA浸出液100mL、麸皮浸出液100mL、蔗糖15g、豆粕粉10g、谷朊粉10g、玉米粉5g、蛋白胨5g、硫酸铵0.5g、硝酸铵2g、尿素2g、玉米浆20mL、吐温80 2mL及复合微量元素1mL，并加去离子水至1000mL；所述复合微量元素的成分为MnCl2·4H2O 0.1g、CoCl20.05g、CuSO4 0.02g、MgSO40.3g、K2PO4 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、ZnCl2 0.03g、LiCl 0.05g、CaCl2 0.05g、H3BO3 0.01g及KI 0.5g，并加去离子水1000mL。
在本实施例中，所述步骤(6)中发酵补充营养液的成分及配比为蔗糖20g、豆饼粉20g、尿素5g、NH4NO3 5g、补充去离子水至1000mL。
实施例2
一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30℃的恒温培养箱中活化培养48h，即得嗜热拟青霉丝；
(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于嗜热拟青霉孢子培养基上，并将嗜热拟青霉孢子培养基置于30℃的条件下培养2d，即得孢子；
(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；
(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以4％(v/v)的接种量接入装有30mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160r/min、温度为30的条件下，摇床培养18h，即得嗜热拟青霉种子培养液；
(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6％(v/v)的接种量接入装有150mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160r/min、温度为40℃的条件下摇床发酵30h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；
(6)将60mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37℃时，调节发酵液一的pH为5，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28℃，再次向发酵液一中加入50mL的发酵补充营养液，并继续发酵24h，即得发酵液二；
(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20min，得沉淀和上清液，将上清液用截留分子质量为100kDa的超滤膜超滤，得滤液一，将滤液一用截留分子质量为20kDa的超滤膜超滤，即得截留液，将所得截留液浓缩3倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；
(8)将1wt％的糊精、2wt％的可溶性淀粉和0.1wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻6h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥15h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。
在本实施例中，所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。
在本实施例中，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。
在本实施例中，所述嗜热拟青霉孢子培养基的成分及配比为土豆浸出液50mL、麸皮浸出液50mL、蔗糖1g及琼脂粉1.5g。
在本实施例中，所述麸皮浸出液的制备方法如下：称取50g麸皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并过滤，得麸皮滤液，将麸皮滤液定容到200mL，即得麸皮浸出液。
在本实施例中，所述步骤(5)中的摇瓶发酵培养基的成分及配比为PDA浸出液100mL、麸皮浸出液100mL、蔗糖18g、豆粕粉12g、谷朊粉15g、玉米粉8g、蛋白胨8g、硫酸铵0.5g、硝酸铵4g、尿素3g、玉米浆25mL、吐温80 4mL及复合微量元素3mL，并加去离子水至1000mL；所述复合微量元素的成分为MnCl2·4H2O 0.1g、CoCl2 0.05g、CuSO4 0.02g、MgSO40.3g、K2PO4 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、ZnCl2 0.03g、LiCl 0.05g、CaCl2 0.05g、H3BO3 0.01g及KI 0.5g，并加去离子水1000mL。
在本实施例中，所述步骤(6)中发酵补充营养液的成分及配比为蔗糖40g、豆饼粉40g、尿素5g、NH4NO3 5g、补充去离子水至1000mL。
实施例3
一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于40℃的恒温培养箱中活化培养72h，即得嗜热拟青霉丝；
(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于嗜热拟青霉孢子培养基上，并将嗜热拟青霉孢子培养基置于40℃的条件下培养4d，即得孢子；
(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；
(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以8％(v/v)的接种量接入装有50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为200r/min、温度为45的条件下，摇床培养24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；
(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以10％(v/v)的接种量接入装有200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为200r/min、温度为45℃的条件下摇床发酵48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；
(6)将100mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至40℃时，调节发酵液一的pH为6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至32℃，再次向发酵液一中加入80mL的发酵补充营养液，并继续发酵48h，即得发酵液二；
(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心30min，得沉淀和上清液，将上清液用截留分子质量为120kDa的超滤膜超滤，得滤液一，将滤液一用截留分子质量为30kDa的超滤膜超滤，即得截留液，将所得截留液浓缩4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；
(8)将2wt％的糊精、4wt％的可溶性淀粉和0.2wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度45Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。
在本实施例中，所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。
在本实施例中，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。
在本实施例中，所述嗜热拟青霉孢子培养基的成分及配比为土豆浸出液50mL、麸皮浸出液50mL、蔗糖1g及琼脂粉1.5g。
在本实施例中，所述麸皮浸出液的制备方法如下：称取50g麸皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并过滤，得麸皮滤液，将麸皮滤液定容到200mL，即得麸皮浸出液。
在本实施例中，所述步骤(5)中的摇瓶发酵培养基的成分及配比为PDA浸出液100mL、麸皮浸出液100mL、蔗糖20g、豆粕粉15g、谷朊粉20g、玉米粉10g、蛋白胨5～10g、硫酸铵0.5g、硝酸铵5g、尿素5g、玉米浆30mL、吐温80 5mL及复合微量元素5mL，并加去离子水至1000mL；所述复合微量元素的成分为MnCl2·4H2O 0.1g、CoCl2 0.05g、CuSO4 0.02g、MgSO40.3g、K2PO4 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、ZnCl2 0.03g、LiCl 0.05g、CaCl2 0.05g、H3BO3 0.01g及KI 0.5g，并加去离子水1000mL。
在本实施例中，所述步骤(6)中发酵补充营养液的成分及配比为蔗糖50g、豆饼粉50g、尿素5g、NH4NO3 5g、补充去离子水至1000mL。
实施例4
一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶粗酶液的分离纯化方法，具体步骤如下：
1、热处理去除热变性杂蛋白
将上述步骤中制备的嗜热拟青霉发酵培养液在8000r/min的条件下，离心20min，弃沉淀保留上清液，将上清液加热至80℃，保温20min，冷却至室温后放置4℃静置6h，再次将上清液置于8000r/min的条件下，离心20min，去掉沉淀下的杂蛋白。上清液为葡萄糖粗酶液，接着进行下一步纯化。在保持温度为80℃，经过20分钟的热处理，不仅可以杀灭菌体，而且可以脱去大量的蛋白质，因葡萄糖氧化酶耐高温，对酶的回收率却没有影响。
2、硫酸铵-乙醇复合沉淀
取一定体积的葡萄糖粗酶液，向其中加入研细的固体硫酸铵，使其饱和度达到30％，并调节其pH为6.5，在4℃下的条件下，静置24h后，将加有硫酸铵的葡萄糖粗酶液在8000r/min的条件下，离心20min，弃沉淀保留上清液，向上清中加入50％的无水乙醇，调节其pH为5.5，4℃下静置24h后，将加有无水乙醇的上清液置于8000r/min的条件下，冷冻离心20min，弃上清液，将沉淀用去离子水溶解，并充分透析脱盐。
3、DEAE-Sephadex A-50纯化葡萄糖氧化酶
将经无水乙醇沉淀所得酶液透析过夜后，上样至经缓冲液A(缓冲液A：0.05mol/lpH7.2 Tris-HCl缓冲液)平衡的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱。上样后用缓冲液A充分淋洗至A280不发生变化，然后采用洗脱剂B(含0.2mol/L NaCl的Tris-HCl缓冲液)以1mL/min流速进行线性梯度洗脱，每管收集3mL，并在280nm下测定蛋白峰，同时测定酶活。洗脱曲线如图1所示。结果出现大的4个蛋白峰，经测定蛋白峰2有葡萄糖苷酶活性，收集高酶活组分，超滤浓缩浓缩，进行下一步纯化。
4、Sephadex G-100凝胶层析分离纯化葡萄糖酶
将上述分离纯化的酶液，上样至经0.05mo1/L pH6.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex G-100凝胶层析柱，采用0.05mol/L pH 6.0磷酸盐缓冲液以0.5mL/min流速进行洗脱，每管收集2mL，并在280nm下测定蛋白峰，同时测定酶活。如图2所示。结果出现四个蛋白峰，经测得第三个峰有酶活性且与蛋白峰接近，收集酶活组分高的酶液透析浓缩，进行SDS-PAGE电泳，检测纯度及分子量；测定酶活力和蛋白质含量，计算葡萄糖苷酶总活力、比活力及蛋白回收率。如表1所示。纯化后，该酶比活达到11806.96U/mg，纯化倍数为273.24，酶的总回收率为55.75％。
表1 葡萄糖氧化酶纯化情况
5、葡萄糖氧化酶电泳纯度鉴定
将乙醇-硫酸铵沉淀透析后酶液、DEAE-Sephadex A-50阴离子交换柱层析所得组分以及Sephadex G-100凝胶柱层析所得组分行SDS-PAGE电泳鉴定。电泳条件：10％的分离胶和4％的浓缩胶，初始电压80V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压到130V，当溴酚蓝指示剂到达距电泳槽底部约1cm时结束电泳。由SDS-PAGE电泳鉴定，如图3所示，未经层析处理粗酶液约有16个条带，经DEAE-Sephadex A-50分离后杂蛋白显著降低，杂蛋白量进一步减少；而经Sephadex G-100分子筛凝胶过滤色谱柱分离后的酶液仅有1条条带，说明采用以上分离纯化后已获得纯度较高的葡萄糖氧化酶。经计算其分子质量约55.34kDa。
将实施例4分离纯化的葡萄糖氧化酶分别置于35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃下测定葡萄糖氧化酶的相对酶活。结果如图4所示，随着温度的升高，酶活性逐渐增加，当达到65℃时，酶活性达到最大值，65℃以后温度升高，酶活性逐渐降低，因此温度在50～70℃之间时，酶活性都在80％以上，说明发酵制备的葡萄糖氧化酶具有耐高温的特性。
将实施例4制备的葡萄糖氧化酶分别在pH为2、3、4、5、6、7、8、9下测定葡萄糖氧化酶的相对酶活。结果如图5所示，随着pH升高，相对酶活逐渐提高，当pH为5时，酶活性达到最高，当pH大于5时，相对酶活呈现下降趋势，由图5可知，葡萄糖氧化酶在pH为3～7时，相对酶活性都在80％以上，说明发酵制备的葡萄糖氧化酶具有耐酸性。
将实施例4制备的葡萄糖氧化酶分别置于60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃条件下保温不同的时间，然后立即将葡萄糖氧化酶置于4℃的环境中复性2h以上，最后测定并计算葡萄糖氧化酶的酶活保存率，如图6所示，随着温度和热处理时间的延长，酶活力逐渐降低，葡萄糖氧化酶在75℃以下，保温3小时以内酶活保存率都在80％以上；65℃以下，热处理3小时酶活都在90％以上，说明发酵发酵制备的葡萄糖氧化酶具有耐高温特性。
将实施例4制备的葡萄糖氧化酶分别置于pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11的条件下，并将其置于40℃保温24h，然后转移至pH为4.5的环境中测定其相对酶活。如图7所示，葡萄糖氧化酶在pH为2.0～8.0范围内，在24h内葡萄糖氧化酶的活性基本不发生变化，相对酶活均在80％以上；但在碱性条件下，酶活下降比较严重，随着pH增加，酶活逐渐降低。说明发酵制备的葡萄糖氧化酶具有较强的酸碱稳定性，在酸性条件下性质更为稳定。
将发酵制备的固体酶制剂分别在4℃和室温下保存，每月测定一次酶活力并记录，4℃下葡萄糖氧化酶酶活保存率都在90％以上，室温条件下酶活也在80％以上，由此说明发酵制备的葡萄糖氧化酶具有良好的稳定性。
综上所述，上述实施方式并非是本发明的限制性实施方式，凡本领域的技术人员在发明的实质内容的基础上所进行的修饰或者等效变形，均在本发明的技术范畴。

Claims (10)

1.一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉菌种在PDA活化培养基平板上划线活化，并将PDA活化培养基平板置于30～40℃的恒温培养箱中活化培养48～72h，即得嗜热拟青霉丝；
(2)用接种环刮取步骤(1)中所制备的嗜热拟青霉丝接种于斜面培养基上，并将斜面培养基置于30～40℃的条件下培养2～4d，即得孢子；
(3)将步骤(2)中所制备的孢子用含有0.01％(v/v)吐温80的0.75％无菌生理盐水清洗孢子，将清洗后的孢子放入盛有50～55mL无菌生理盐水和无菌玻璃珠的锥形瓶中并充分振荡30～45min，待孢子充分分散后，制备孢子含量为1.0×108CFU/mL的孢子悬液，即得单孢子菌悬液；
(4)将步骤(3)中所制备的单孢子菌悬液以4～8％(v/v)的接种量接入装有30～50mL种子培养基的三角瓶中，三角瓶在转速为160～200r/min、温度为30～45的条件下，摇床培养18～24h，即得嗜热拟青霉种子培养液；
(5)将步骤(4)中所制备的嗜热拟青霉种子培养液以6～10％(v/v)的接种量接入装有150～200mL摇瓶发酵培养基的三角瓶中，三角瓶采用6层纱布封口，将封口的三角瓶在转速为160～200r/min、温度为40～45℃的条件下摇床发酵30～48h，即得嗜热拟青霉发酵培养液；
(6)将60～100mL的发酵补充营养液加入步骤(5)中所制备的嗜热拟青霉发酵培养液中，即得发酵液一，待发酵液一温度降至37～40℃时，调节发酵液一的pH为5～6，并继续振动发酵，待发酵时间达72h时、温度降至28～32℃，再次向发酵液一中加入50～80mL的发酵补充营养液，并继续发酵24～48h，即得发酵液二；
(7)将步骤(6)中所制备的发酵液二经4层纱布过滤，得菌丝和滤液，将滤液在转速为8000r/min的条件下离心20～30min，得沉淀和上清液，将上清液用超滤膜超滤2次，即得截留液，将所得截留液浓缩3～4倍，即得浓缩液，将所得浓缩液在60～70℃条件下旋转蒸发仪抽真空浓缩，即得粗酶液；
(8)将1～2wt％的糊精、2～4wt％的可溶性淀粉和0.1～0.2wt％的山梨酸钾加入步骤(7)中所制备的粗酶液中，并搅拌均匀，即得葡萄糖氧化酶溶液，将葡萄糖氧化酶溶液置于-20℃冷冻6～8h，将冷冻后的葡萄糖氧化酶溶液置于真空度35～45Pa、温度为-35℃的条件下，冷冻干燥15～20h并粉碎，即得葡萄糖氧化酶酶制剂。
2.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中PDA活化培养基的成分及配比为土豆浸出液100mL、无机盐液1mL、蔗糖2g及琼脂粉1.5g。
3.根据权利要求2所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，所述土豆浸出液的制备方法如下：将土豆削皮切成1cm3小块，称取200g土豆小块放入容器中，向容器中加1000mL水煮沸30min并过滤，得土豆滤液，将土豆滤液定容到1000mL，即得土豆浸出液。
4.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中斜面培养基为嗜热拟青霉孢子培养基。
5.根据权利要求4所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述嗜热拟青霉孢子培养基的成分及配比为土豆浸出液50mL、麸皮浸出液50mL、蔗糖1g及琼脂粉1.5g。
6.根据权利要求5所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，所述麸皮浸出液的制备方法如下：称取50g麸皮置于容器中，向容器中加入300mL水煮沸30min并过滤，得麸皮滤液，将麸皮滤液定容到200mL，即得麸皮浸出液。
7.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中的摇瓶发酵培养基的成分及配比为PDA浸出液100mL、麸皮浸出液100mL、蔗糖15～20g、豆粕粉10～15g、谷朊粉10～20g、玉米粉5～10g、蛋白胨5～10g、硫酸铵0.5g、硝酸铵2～5g、尿素2～5g、玉米浆20～30mL、吐温802～5mL及复合微量元素1～5mL，并加去离子水至1000mL；所述复合微量元素的成分为MnCl2·4H2O 0.1g、CoCl20.05g、CuSO4 0.02g、MgSO4 0.3g、K2PO4 1g、FeSO4·7H2O 0.1g、ZnCl2 0.03g、LiCl 0.05g、CaCl2 0.05g、H3BO3 0.01g及KI 0.5g，并加去离子水1000mL。
8.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中发酵补充营养液的成分及配比为蔗糖20～50g、豆饼粉20～50g、尿素5g、NH4NO3 5g、补充去离子水至1000mL。
9.根据权利要求1所述的一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的发酵制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中第一次采用截留分子质量为100～120kDa的超滤膜；第二次采用截留分子质量为20～30kDa的超滤膜。
10.一种嗜热拟青霉产耐热耐酸的葡萄糖氧化酶的分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)将嗜热拟青霉发酵培养液在8000r/min的条件下，离心20～30min，弃沉淀保留上清液，将上清液加热至80℃，保温20～30min，待上清液冷却至室温后放置4℃的条件下静置6～8h，将静置后的上清液置于8000r/min的条件下，离心20～30min，去掉沉淀下的杂蛋白；
(2)向热处理后的葡萄糖氧化酶粗酶液中加入硫酸铵，至饱和度达到30～40％，并调节其pH为6.5～7.0，在4℃下的条件下，静置24～28h后，在8000r/min的条件下，离心20～40min，弃沉淀保留上清液，向上清液中加入50～70％的无水乙醇，并调节其pH为5.5～6.0，4℃下静置24h后，于8000r/min的条件下，冷冻离心20～35min，弃上清液，将沉淀用去离子水溶解，并充分透析脱盐；
(3)透析脱盐后的酶液，上样至经Tris-HCl缓冲液平衡的DEAE-Sephadex A-50离子交换柱，上样后用Tris-HCl缓冲液充分淋洗至A280不发生变化，然后采用含0～0.5mol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液以1～1.5mL/min流速进行线性梯度洗脱，每管收集3mL；
(4)将上述分离纯化的酶液，上样至经0.05mo1/L pH为6.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex G-100凝胶层析柱，采用0.05mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液以0.5mL/min流速进行洗脱，每管收集2mL。
CN201611256575.5A 2017-03-08 2017-03-08 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法 Active CN106929489B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611256575.5A CN106929489B (zh) 2017-03-08 2017-03-08 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611256575.5A CN106929489B (zh) 2017-03-08 2017-03-08 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106929489A true CN106929489A (zh) 2017-07-07
CN106929489B CN106929489B (zh) 2020-09-04

Family

ID=59444696

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611256575.5A Active CN106929489B (zh) 2017-03-08 2017-03-08 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106929489B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107502598A (zh) * 2017-10-19 2017-12-22 蒋文明 一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法
CN109652390A (zh) * 2019-02-25 2019-04-19 大连大学 一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101012457A (zh) * 2007-01-29 2007-08-08 中国农业大学 制备耐热木聚糖酶、耐热β－木糖苷酶或耐热β－葡萄糖苷酶的方法
CN102477417A (zh) * 2010-11-24 2012-05-30 中国农业大学 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
CN106978404A (zh) * 2016-12-30 2017-07-25 徐州工程学院 一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法及应用
CN107201315A (zh) * 2016-12-30 2017-09-26 徐州工程学院 一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101012457A (zh) * 2007-01-29 2007-08-08 中国农业大学 制备耐热木聚糖酶、耐热β－木糖苷酶或耐热β－葡萄糖苷酶的方法
CN102477417A (zh) * 2010-11-24 2012-05-30 中国农业大学 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
CN106978404A (zh) * 2016-12-30 2017-07-25 徐州工程学院 一种深层液体发酵制备葡萄糖氧化酶酶制剂的方法及应用
CN107201315A (zh) * 2016-12-30 2017-09-26 徐州工程学院 一种嗜热拟青霉诱变菌株及其诱变方法和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107502598A (zh) * 2017-10-19 2017-12-22 蒋文明 一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法
CN109652390A (zh) * 2019-02-25 2019-04-19 大连大学 一种海洋低温葡萄糖氧化酶及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN106929489B (zh) 2020-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104388514B (zh) 利用复合菌种发酵制备γ‑氨基丁酸的方法
CN109439552B (zh) 一株米曲霉blcy-006及其在制备低聚半乳糖中的应用
CN105176883B (zh) 一株高产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其液体发酵方法
CN112760271B (zh) 一种负压条件下高密度发酵生产丁酸梭菌的工艺及应用
CN102559523A (zh) 一种富硒酵母、富硒酵母酶解物及其制备方法
CN106754411B (zh) 一株高产β-D-呋喃果糖苷酶的黑曲霉菌株及其液态发酵产酶方法
CN108034599A (zh) 一株源自白酒酿造体系的高效合成γ-氨基丁酸的短乳杆菌
CN104099385B (zh) 一种深层液态发酵生产桦褐孔菌胞外多糖的方法
CN111517860A (zh) 富含海藻活性寡糖的植物营养剂及其制备方法
CN116200433A (zh) 一种冬虫夏草菌属真菌生物合成制备麦角硫因的方法
CN113321580B (zh) 一种生产苹果酸的方法
CN106929489A (zh) 一种耐热耐酸葡萄糖氧化酶的发酵制备及分离纯化方法
CN108949713B (zh) 一种米曲霉菌体发酵液的制备方法及其在低聚果糖生产中的应用
CN102559802A (zh) 一种培养基发酵高产银耳多糖的方法
CN108251476B (zh) 从酶制剂废水中提取维生素b12的方法
CN102127515B (zh) 一株高产l-脯氨酸短波单胞杆菌(jnpp-1)的筛选及应用
CN101654697B (zh) 一种混菌发酵制备菜籽肽的方法
CN107201347B (zh) 一种固态发酵制备耐热耐酸葡萄糖氧化酶的方法及应用
CN100463961C (zh) 一种富铬酿酒酵母、富铬酵母产品及其生产方法
CN112522118A (zh) 杂色曲霉在制备单宁酶和降解单宁中的应用
CN101575579B (zh) 一种富铁酵母及其生产方法
CN103146769A (zh) 一种发酵制备柠檬酸的方法
CN102174194B (zh) 从发酵液中提取γ-聚二氨基丁酸和聚赖氨酸的方法
CN104774794A (zh) 一株产d-甘露糖异构酶的菌株及用其生产d-甘露糖的方法
CN109456898A (zh) 一种球毛壳菌右旋糖酐酶的发酵制备及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20210129

Address after: 408000 group 3, Zizhu village, Baisheng Town, Fuling District, Chongqing

Patentee after: CHONGQING FULING ZIZHU FOOD Co.,Ltd.

Address before: Xuzhou Institute of engineering, No.1 Lishui Road, Xincheng District, Xuzhou City, Jiangsu Province

Patentee before: Xuzhou University of Technology

TR01 Transfer of patent right