CN107502598A - 一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法 - Google Patents

一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品保鲜食品添加剂领域，具体涉及一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法。从土壤中分离筛选出的一种真菌菌株用于发酵葡萄糖氧化酶，获取途径简便，绿色环保，极易获取，本发明采用包埋法和交联法两种方法共同作用，以聚乙烯醇作为载体，加入浓度为10%的双重氮联苯胺实现葡萄糖氧化酶的固定化，使固定化葡萄糖氧化酶可以被重复利用，节约成本，减少了葡萄糖氧化酶细胞的破损率，提高了其机械强度，并且提高了酶活性，延长了酶活性的保持时间。

Description

一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法
技术领域
本发明属于食品保鲜食品添加剂领域，具体涉及一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法。
背景技术
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶。葡萄糖氧化酶是从特异青霉等霉菌和蜂蜜中发现的酶。葡萄糖氧化酶以氧为电子接受体，能专一地氧化β-D-葡萄糖为葡萄 糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶是酶应用技术领域中一种非常重要的酶，作为 国家允许使用的酶制剂之一，它在食品、医药、饲料等行业中得到了广泛应用。
葡萄糖氧化酶在生物界分布很广泛，其工业化生产是利用微生物发酵法生产，最常见的葡萄糖氧化酶来源是通过黑曲霉、青霉以及酵母菌属的发酵得来。多数商业化的葡萄糖氧化酶是从黑曲霉的菌丝体中分离得到的。但是由于黑曲霉的发酵主要是用作生产葡萄糖酸或者葡萄糖酸盐的，比如葡萄糖酸钠、葡萄糖酸钙，因此葡萄糖氧化酶主要是作为一种副产物出现，而这导致葡萄糖氧化酶 的生产酶活并不高，很多都是只有个位数的酶活，因此微生物发酵法存在发酵活力低、产量低、生产成本高等限制性因素。
因此，有必要发明一种酶活高，稳定性高，回收率高的固定化葡萄糖氧化酶。以此来适应于市场的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题：本发明的目的是针对一般葡萄糖氧化酶的机械强度差，酶活性不高，不能重复利用的问题，利用一种环保的葡萄糖氧化酶的获取途径，通过包埋法和交联法的共同作用，得到一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明采用如下所述的技术方案是：
一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
（1）取田园土放入装有生理盐水的锥形瓶中振荡混匀，取质量分数为0.9%生理盐水稀释土样至10-5稀释度，移液管吸取稀释浑浊液，涂布于筛选平板培养，挑取菌落与生理盐水按质量比1:9混合，得混合菌液，取菌液接种至真菌平板培养基上培养，通过菌落，种子菌株；
（2）挑取上述的种子菌株划线接种于斜面培养基培养，得培养物，将培养物加入聚山梨酯80与pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液混合均匀，将孢子洗脱，得去孢子混合菌液，将去孢子混合菌液接种至真菌种子液培养基中，培养得一级种子液；
（3）将一级种子液接种至发酵培养液中，发酵得二级种子液，在发酵罐中加入发酵液，通入蒸汽进行实罐灭菌，降温，倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合均匀，进行发酵，发酵完成后，得葡萄糖氧化酶发酵液；
（4）葡萄糖氧化酶的分离与提纯：将葡萄糖氧化酶发酵液离心去除菌丝体收取上清液，并过微滤膜去除残留的颗粒和菌体，取上清液，透析1天后收集粗酶液，取粗酶液上离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥，将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，再次放入离子交换层析柱中，用DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末；
（5）葡萄糖氧化酶的固定化:将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合均匀，过滤，取过滤液，将聚乙烯醇、甲苯、氯仿、滤液混合均匀后加入反应容器，在反应容器中分别加入二氨基丙腈和过硫酸钾， 用搅拌器持续搅拌，在20～40℃的水浴中反应，加入N2作为保护气，反应，过滤，滤液，收集滤渣，分别用PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液对滤渣进行洗涤，再用双重氮联苯胺溶液对滤渣交联处理40min，再使用蒸馏水冲洗，干燥，即得到固定化葡萄糖氧化酶。
所述步骤（1）中田园土与生理盐水混合的质量比为1:9。
所述步骤（2）中种子菌株接种于斜面培养基的培养条件为在20~25℃温度条件下，培养5~7天，培养物、聚山梨酯80与pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的质量比为100:15:300，一级种子液的培养条件是在23~28 ℃温度条件下，培养18~24 h。
所述步骤（3）中一级种子液与发酵培养液的质量比为1:6，发酵条件为pH3.5~6.5，23~ 28℃，发酵60~72h，发酵罐中加入的发酵液与发酵罐的体积比为1:2，倒入的二级种子液的接种量为10%，二级种子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三种物质的质量比为2:1:1，在25~28℃的温度条件下，发酵36~72h得到葡萄糖氧化酶发酵液，测定含有酶活为4.5~5.6U。
所述步骤（4）中平衡溶液为pH7.1±0.2，浓度为0.05mol/L的DTT缓冲溶液，进行梯度洗脱的是浓度为0.1~1mol/L NaCl溶液，冷冻干燥葡萄糖氧化酶与水混合的质量比为1:2。
所述步骤（5）干燥的葡萄糖氧化酶粉末与pH4.5~5.6，浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合的质量比为1:5，将聚乙烯醇作为载体对游离酶进行包埋，聚乙烯醇、甲苯、氯仿、滤液的质量比2:5:8:5，二氨基丙腈和过硫酸钾的质量比为1:2，反应形成的固定化酶颗粒直径为100μm～200μm，用作交联处理的物质为质量分数为10%的双重氮联苯胺溶液。
本发明与其他方法相比，有益技术效果是：
（1）从田园土壤中分离筛选出的一种真菌菌株用于发酵葡萄糖氧化酶，获取途径简便，绿色环保，极易获取；
（2）采用包埋法和交联法两种方法共同作用，以聚乙烯醇作为载体，加入浓度为10%的双重氮联苯胺实现葡萄糖氧化酶的固定化，使固定化葡萄糖氧化酶可以被重复利用，节约成本，减少了葡萄糖氧化酶细胞的破损率，提高了其机械强度，并且提高了酶活性，延长了酶活性的保持时间。
具体实施方式
原料：从田园土中分离筛选鉴定，取菌径最大的菌落作为种子菌株，用于发酵培养得到葡萄糖氧化酶。
接种斜面培养基的配制：按质量份数计，取蔗糖20~30份，胰酪胨15~20份，NaNO32~5份，K2HPO4 0.6~1份，FeSO4 0.01~0.03份，琼脂10~ 20份，121℃灭菌20min，pH5.4±0.2。
筛选平板培养基的配制：按质量份数计，取葡萄糖50~80份，蛋白胨 1~3份，(NH4)2HPO40.2~0.4份，KH2PO4 0.1~0.4份，Mg SO4·7H2O 0.04~ 0.1份，马铃薯粉6~ 10份，KI0.8~1.7份，脱氧胆酸钠0.07~ 0.2份，琼脂10~20份，磷酸缓冲液0.05~0.1份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌平板培养基的配制：按质量份数计，取蛋白胨2~5份，葡萄糖8~10份，KH2PO40.8~1.2份，Mg SO4 0.2~0.5份，孟加拉红0.01~0.35份，氯霉素0.1~0.4份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌斜面培养基：PDA培养基。
真菌种子液培养基：按质量份数计，取葡萄糖40~50份、KCl 0.01~0.02份、KH2PO40.01~0.015份、MgSO4•7H2O 0.01~0.012份、(NH4)2HPO4 0.04~0.06份、酵母膏0.2~0.3份、蛋白胨0.1~0.4份，115 ℃灭菌15 min，pH值自然。
发酵培养液的配制：按质量份数计，取葡萄糖80~100份，蛋白胨2~8份，硝酸钠5~8份，KH2PO42~4份，Mg SO4 0.4~0.8份，CaCO3 1.5~3.5份，KCl 0.3~0.5份，121℃灭菌20min，pH5.2±0.3。
（1）选取田园土，用灭菌瓶取土壤样品50~200份，置于 4℃冰箱内备用，按质量份数计，称取10~15份采集来的土样置于经过灭菌处理的装有质量分数为0.9%生理盐水的锥形瓶中振荡30 min，混合均匀，按质量分数计，取1份灭菌生理盐水稀释至10-5稀释度，用灭菌的移液管吸取，涂布于预先配制并且灭菌的筛选平板培养基中，在 25~28℃下培养5天后置于5℃冰箱中静置3天，然后在23~30℃下存放至出现蓝色颜色圈。挑取蓝色圈中单个菌落接种至接种斜面培养基上培养，培养基上长出菌落后用接种环挑取少菌丝加入质量分数为0.9%生理盐水，接种于灭菌后的真菌平板培养基上，23~28℃培养36~48小时，选定菌径最大的菌落作为提取葡萄糖氧化酶的种子菌株；
（2）挑取上述培养出的种子菌株划线接种于斜面培养基，20~25℃培养5~7天，取培养物加入聚山梨酯80与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，培养物、聚山梨酯80、氯化钠-蛋白胨缓冲液的体积比为100:15:300，将孢子洗脱，将去孢子培养物接种至真菌种子液培养基中，23~28℃培养18~24 h，得到一级种子液；
（3）将一级种子液接种至发酵培养液中，一级种子液和发酵培养液的质量比为1:6，调节混合发酵液的pH至3.5~6.5，培养温度为23~ 28℃，振荡器转速为 200r/min条件下摇瓶发酵60~72h，得到二级种子液。在发酵罐中加入发酵液，发酵液与发酵罐的体积比为1:2，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌，完成后开循环水阀门降温，降温后，按质量分数为10%的接种量倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合，二级种子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三种物质按质量比2:1:1混合均匀，在25~28℃的温度条件下，发酵36~72h，发酵完成后，即可得到含有酶活为5.3U以上葡萄糖氧化酶发酵液；
（4）葡萄糖氧化酶的分离与提纯：将上述发酵液（离心条件8000rpm，20min），去除菌丝体收取上清液，过微滤膜去除残留的微小颗粒和菌体，取上清液，得粗酶液，透析1天后收集备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的 DTT缓冲溶液平衡，DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用浓度为0.1～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的DTT缓冲溶液平衡，放置在Superdex-200凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，按质量比1:2混合均匀，用浓度为0.05mol/L的DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末。
（5）葡萄糖氧化酶的固定化：将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与pH4.5~5.6 浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液按质量比1:5混合均匀，过滤，取过滤液，测定游离酶酶活为5.6~12.2U/g，将聚乙烯醇作为载体，将聚乙烯醇，甲苯，氯仿，滤液按质量比2:5:8:5混合均匀后加入反应容器，在反应容器中分别加入按质量比1:2的二氨基丙腈和过硫酸钾，用搅拌器持续搅拌，转数为240r /min，在20～40℃的水浴中反应 30min，加入N2作为保护气，反应形成的固定化酶颗粒直径为100μm～200μm，结束后将固定化酶过滤，收集滤渣，分别用pH6.0的PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液洗涤，用质量分数为10%的双重氮联苯胺溶液交联处理40min，用蒸馏水反复冲洗后再用甘氨酸将残留的双重氮联苯胺反应掉，充分洗涤，即得到固定化葡萄糖氧化酶，测定固定酶活性为53~68U/g，根据公式测得固定化葡萄糖氧化酶的回收率达到了56.7%~64.8%。
实施例1
原料：从田园土中分离筛选鉴定，取菌径最大的菌落作为种子菌株，用于发酵培养得到葡萄糖氧化酶。
接种斜面培养基的配制：按质量份数计，取蔗糖20~30份，胰酪胨15份，NaNO32份，K2HPO4 0.6份，FeSO4 0.01份，琼脂10份，121℃灭菌20min，pH5.4±0.2。
筛选平板培养基的配制：按质量份数计，取葡萄糖50份，蛋白胨1份，(NH4)2HPO40.2份，KH2PO4 0.1份，MgSO4·7H2O 0.04份，马铃薯粉6份，KI0.8份，脱氧胆酸钠0.07份，琼脂10份，磷酸缓冲液0.05份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌平板培养基的配制：按质量份数计，取蛋白胨2份，葡萄糖8份，KH2PO4 0.8份，Mg SO4 0.2份，孟加拉红0.01份，氯霉素0.1份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌斜面培养基：PDA培养基。
真菌种子液培养基：按质量份数计，取葡萄糖40份、KCl 0.01份、KH2PO4 0.01份、MgSO4•7H2O 0.01份、(NH4)2HPO4 0.04份、酵母膏0.2份、蛋白胨0.1份，115 ℃灭菌15 min，pH值自然。
发酵培养液的配制：按质量份数计，取葡萄糖80份，蛋白胨2份，硝酸钠5份，KH2PO42份，Mg SO4 0.4份，CaCO3 1.5份，KCl 0.3份，121℃灭菌20min，pH5.2±0.3。
（1）选取田园土，用灭菌瓶取土壤样品50份，置于 4℃冰箱内备用。按质量份数计，称取10份采集来的土样置于经过灭菌处理的装有质量分数为0.9%生理盐水的锥形瓶中振荡30 min，混合均匀，按质量分数计，取1份灭菌生理盐水稀释至10-5稀释度，用灭菌的移液管吸取混合液，涂布于预先配制并且灭菌的筛选平板培养基中，在 25℃下培养5天后置于5℃冰箱中静置3天，然后在23℃下存放至出现蓝色颜色圈。挑取蓝色圈中单个菌落接种至接种斜面培养基上培养，培养基上长出菌落后用接种环挑取少菌丝加入质量分数为0.9%生理盐水，接种于灭菌后的真菌平板培养基上，23℃培养36小时，选取菌径最大的菌落作为提取葡萄糖氧化酶种子菌株。
（2）挑取上述培养出的种子菌株划线接种于斜面培养基，20℃培养5天，取培养物加入聚山梨酯80与pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，培养物、聚山梨酯80、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的体积比为100:15:300，将孢子洗脱，将去孢子培养物接种至真菌种子液培养基中，23℃培养18 h，得到一级种子液。
（3）将一级种子液接种至发酵培养液中，一级种子液和发酵培养液的质量比为1:6，调节混合发酵液的pH至3.5，培养温度为23℃，振荡器转速为 200r/min条件下摇瓶发酵6h，得到二级种子液。在发酵罐中加入发酵液，发酵液与发酵罐的体积比为1:2，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌，完成后开循环水阀门降温，降温后，按质量分数为10%的接种量倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合，二级种子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三种物质按质量比2:1:1混合均匀，在25℃的温度条件下，发酵36~72h，发酵完成后，即可得到含有酶活为5.3U(酶活定义：每分钟催化氧化1μmol葡萄糖的酶量的定义为一个酶活力单位)以上葡萄糖氧化酶发酵液。
（4）葡萄糖氧化酶的分离与提纯
将上述发酵液(离心条件8000rpm，20min)，去除菌丝体收取上清液，过微滤膜去除残留的微小颗粒和菌体，取上清液，得粗酶液，透析1天后收集备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的 DTT缓冲溶液平衡，DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用浓度为0.1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥后备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的DTT缓冲溶液平衡，放置在Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，按质量比1:2混合均匀，用浓度为0.05mol/L的DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末。
（5）葡萄糖氧化酶的固定化
将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与pH4.5 浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液按质量比1:5混合均匀，过滤，取过滤液，测定游离酶酶活为5.6U/g，将聚乙烯醇作为载体，将聚乙烯醇，甲苯，氯仿，滤液按质量比2:5:8:5混合均匀后加入反应容器，在反应容器中分别加入按质量比1:2的二氨基丙腈和过硫酸钾，用搅拌器持续搅拌，转数为240r /min，在20℃的水浴中反应 30min，加入N2作为保护气，反应形成的固定化酶颗粒直径为100μm，结束后将固定化酶过滤，收集滤渣，分别用pH6.0的PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液洗涤，再用质量分数为10%的双重氮联苯胺溶液交联处理40min，用蒸馏水反复冲洗后再用甘氨酸将残留的双重氮联苯胺反应掉，充分洗涤，即得到固定化葡萄糖氧化酶，测定固定酶活性为53U/g，根据公式测得固定化葡萄糖氧化酶的回收率达到了56.7%。
实施例2
原料：从田园土中分离筛选鉴定，取菌径最大的菌落作为种子菌株，用于发酵培养得到葡萄糖氧化酶。
接种斜面培养基的配制：按质量份数计，取蔗糖25份，胰酪胨17份，NaNO33份，K2HPO4 0.8份，FeSO4 0.02份，琼脂15份，121℃灭菌20min，pH5.4±0.2。
筛选平板培养基的配制：按质量份数计，取葡萄糖65份，蛋白胨 2份，(NH4)2HPO40.2~0.4份，KH2PO4 0.3份，Mg SO4·7H2O 0.08份，马铃薯粉8份，KI1.6份，脱氧胆酸钠0.15份，琼脂15份，磷酸缓冲液0.07份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌平板培养基的配制：按质量份数计，取蛋白胨3份，葡萄糖9份，KH2PO4 1.0份，Mg SO4 0.4份，孟加拉红0.25份，氯霉素0.3份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌斜面培养基：PDA培养基。
真菌种子液培养基：按质量份数计，取葡萄糖45份、KCl 0.01份、KH2PO4 0.013份、MgSO4•7H2O 0.011份、(NH4)2HPO4 0.05份、酵母膏0.25份、蛋白胨0.3份，115 ℃灭菌15 min，pH值自然。
发酵培养液的配制：按质量份数计，取葡萄糖90份，蛋白胨6份，硝酸钠6份，KH2PO43份，Mg SO4 0.6份，CaCO3 2.5份，KCl 0.4份，121℃灭菌20min，pH5.2±0.3。
（1）选取土壤，用灭菌瓶取土壤样品50~200份，置于 4℃冰箱内备用。按质量份数计，称取10~15份采集来的土样置于经过灭菌处理的装有质量分数为0.9%生理盐水的锥形瓶中振荡30 min，混合均匀，按质量分数计，取1份灭菌生理盐水稀释至10-5稀释度，用灭菌的移液管吸取，涂布于预先配制并且灭菌的筛选平板培养基中，在 25~28℃下培养5天后置于5℃冰箱中静置3天，然后在23~30℃下存放至出现蓝色颜色圈。挑取蓝色圈中单个菌落接种至接种斜面培养基上培养，培养基上长出菌落后用接种环挑取少菌丝加入质量分数为0.9%生理盐水，接种于灭菌后的真菌平板培养基上，23~28℃培养36~48小时，选定菌径最大的菌落作为提取葡萄糖氧化酶的种子菌株。
（2）挑取上述培养出的种子菌株划线接种于斜面培养基，20~25℃培养5~7天，取培养物加入聚山梨酯80与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，培养物、聚山梨酯80、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的体积比为100:15:300，将孢子洗脱，将去孢子培养物接种至真菌种子液培养基中，23~28℃培养18~24 h，得到一级种子液。
（3）将一级种子液接种至发酵培养液中，一级种子液和发酵培养液的质量比为1:6，调节混合发酵液的pH至3.5~6.5，培养温度为23~ 28℃，振荡器转速为 200r/min条件下摇瓶发酵60~72h，得到二级种子液。在发酵罐中加入发酵液，发酵液与发酵罐的体积比为1:2，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌，完成后开循环水阀门降温，降温后，按质量分数为10%的接种量倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合，二级种子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三种物质按质量比2:1:1混合均匀，在25~28℃的温度条件下，发酵36~72h，发酵完成后，即可得到含有酶活为5.3U(酶活定义：每分钟催化氧化1μmol葡萄糖的酶量的定义为一个酶活力单位)以上葡萄糖氧化酶发酵液。
（4）葡萄糖氧化酶的分离与提纯
将上述发酵液(离心条件8000rpm，20min)，去除菌丝体收取上清液，过微滤膜去除残留的微小颗粒和菌体，取上清液，得粗酶液，透析1天后收集备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的 DTT缓冲溶液平衡，DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用浓度为0.1～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥后备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的DTT缓冲溶液平衡，放置在Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，按质量比1:2混合均匀，用浓度为0.05mol/L的DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末。
（5）葡萄糖氧化酶的固定化
将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与pH5.0 浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液按质量比1:5混合均匀，过滤，取过滤液，测定游离酶酶活为7.6U/g，将聚乙烯醇作为载体，将聚乙烯醇，甲苯，氯仿，滤液按质量比2:5:8:5混合均匀后加入反应容器，在反应容器中分别加入按质量比1:2的二氨基丙腈和过硫酸钾，用搅拌器持续搅拌，转数为240r /min，在30℃的水浴中反应 30min，加入 N2作为保护气，反应形成的固定化酶颗粒直径为150μm，结束后将固定化酶过滤，收集滤渣，分别用pH6.0的PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液洗涤，再用质量分数为10%的双重氮联苯胺溶液交联处理40min，用蒸馏水反复冲洗后再用甘氨酸将残留的双重氮联苯胺反应掉，充分洗涤，即得到固定化葡萄糖氧化酶，测定固定酶活性为53~68U/g，根据公式测得固定化葡萄糖氧化酶的回收率达到了60.7%。
实施例3
原料：从田园土中分离筛选鉴定，取菌径最大的菌落作为种子菌株，用于发酵培养得到葡萄糖氧化酶。
接种斜面培养基的配制：按质量份数计，取蔗糖30份，胰酪胨20份，NaNO35份，K2HPO4 1份，FeSO4 0.03份，琼脂20份，121℃灭菌20min，pH5.4±0.2。
筛选平板培养基的配制：按质量份数计，取葡萄糖80份，蛋白胨 3份，(NH4)2HPO40.4份，KH2PO40.4份，Mg SO4·7H2O0.1份，马铃薯粉10份，KI1.7份，脱氧胆酸钠 0.2份，琼脂20份，磷酸缓冲液0.1份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌平板培养基的配制：按质量份数计，取蛋白胨5份，葡萄糖10份，KH2PO4 1.2份，Mg SO40.5份，孟加拉红0.35份，氯霉素0.4份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2。
真菌斜面培养基：PDA培养基。
真菌种子液培养基：按质量份数计，取葡萄糖50份、KCl 0.02份、KH2PO4 0.015份、MgSO4•7H2O 0.012份、(NH4)2HPO40.06份、酵母膏0.3份、蛋白胨0.4份，115 ℃灭菌15 min，pH值自然。
发酵培养液的配制：按质量份数计，取葡萄糖100份，蛋白胨8份，硝酸钠8份，KH2PO44份，Mg SO4 0.8份，CaCO3 3.5份，KCl 0.5份，121℃灭菌20min，pH5.2±0.3。
（1）选取土壤，用灭菌瓶取土壤样品200份，置于 4℃冰箱内备用。按质量份数计，称取15份采集来的土样置于经过灭菌处理的装有质量分数为0.9%生理盐水的锥形瓶中振荡30 min，混合均匀，按质量分数计，取1份灭菌生理盐水稀释至10-5稀释度，用灭菌的移液管吸取，涂布于预先配制并且灭菌的筛选平板培养基中，在 28℃下培养5天后置于5℃冰箱中静置3天，然后在30℃下存放至出现蓝色颜色圈。挑取蓝色圈中单个菌落接种至接种斜面培养基上培养，培养基上长出菌落后用接种环挑取少菌丝加入质量分数为0.9%生理盐水，接种于灭菌后的真菌平板培养基上，28℃培养48小时，选定菌径最大的菌落作为提取葡萄糖氧化酶的种子菌株。
（2）挑取上述培养出的种子菌株划线接种于斜面培养基，25℃培养7天，取培养物加入聚山梨酯80与pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，培养物、聚山梨酯80、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液的体积比为100:15:300，将孢子洗脱，将去孢子培养物接种至真菌种子液培养基中，28℃培养24 h，得到一级种子液。
（3）将一级种子液接种至发酵培养液中，一级种子液和发酵培养液的质量比为1:6，调节混合发酵液的pH至6.5，培养温度为28℃，振荡器转速为 200r/min条件下摇瓶发酵60~72h，得到二级种子液。在发酵罐中加入发酵液，发酵液与发酵罐的体积比为1:2，关闭各阀门通入蒸汽进行实罐灭菌，完成后开循环水阀门降温，降温后，按体积比例为10%的接种量倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合，二级种子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三种物质按质量比2:1:1混合均匀，在28℃的温度条件下，发酵72h，发酵完成后，即可得到含有酶活为5.3U(酶活定义：每分钟催化氧化1μmol葡萄糖的酶量的定义为一个酶活力单位)以上葡萄糖氧化酶发酵液。
（4）葡萄糖氧化酶的分离与提纯
将上述发酵液(离心条件8000rpm，20min)，去除菌丝体收取上清液，过微滤膜去除残留的微小颗粒和菌体，取上清液，得粗酶液，透析1天后收集备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的 DTT缓冲溶液平衡，DEAE-Sepharose 离子交换层析柱，取粗酶液上样，用浓度为0.1～1mol/L NaCl(用0.05mol/L，pH7.1的Tris-HCl 缓冲溶液配制)进行梯度洗脱，流速0.5mL/min，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥后备用。用浓度为0.05mol/L pH7.1±0.2 的DTT缓冲溶液平衡，放置在Superdex-200 凝胶过滤层析柱过夜，将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，按质量比1:2混合均匀，用浓度为0.05mol/L的DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末。
（5）葡萄糖氧化酶的固定化
将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与pH5.6 浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液按质量比1:5混合均匀，过滤，取过滤液，测定游离酶酶活为12.2U/g，将聚乙烯醇作为载体，将聚乙烯醇，甲苯-氯仿，滤液按质量比2:8:5混合均匀后加入反应容器，在反应容器中分别加入按质量比1:2的二氨基丙腈和过硫酸钾，用搅拌器持续搅拌，转数为240r /min，在40℃的水浴中反应 30min，加入N2作为保护气，反应形成的固定化酶颗粒直径为200μm，结束后将固定化酶过滤，收集滤渣，分别用pH6.0的PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液洗涤，再用质量分数为10%的双重氮联苯胺溶液交联处理40min，用蒸馏水反复冲洗后再用甘氨酸将残留的双重氮联苯胺反应掉，充分洗涤，即得到固定化葡萄糖氧化酶，测定固定酶活性为53~68U/g，根据公式测得固定化葡萄糖氧化酶的回收率达到了64.8%。
对比例：深圳某食品配料邮箱公司生产的葡萄糖氧化酶
方法：准备4份10U/mL的GOD酶液，分别在各个试样中加入酶活力相同的GOD
酶液标准品，作回收率实验。
保持pH6.0恒定的条件下，分别将酶液放置在20、25、30、35、40、45、50、55、60℃水浴条件下60 min后，在最适温度下每隔10 min测定酶活力，3次取算术平均值，确定不同温度下酶活力稳定性的变化。
葡萄糖氧化酶具体检测情况如表1
表1
检测项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例
酶活力（U/mL） 47.5 48.2 55 40.3
回收率（%） 85.4 96.0 98.4 75.2
由上可知，本发明所生产的葡萄糖氧化酶酶活性高，稳定性强，回收率高，是一种安全高效的葡萄糖氧化酶，值得推广和使用。

Claims (6)

1.一种固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：
取田园土放入装有生理盐水的锥形瓶中振荡混匀，取质量分数为0.9%生理盐水稀释土样至10-5稀释度，移液管吸取稀释混合液，涂布于筛选平板培养，挑取菌落与生理盐水按质量比1:9混合，得混合菌液，取菌液接种至真菌平板培养基上培养，选取菌径最大的菌落作为种子菌株；
挑取上述的种子菌株划线接种于斜面培养基培养，得培养物，将培养物加入聚山梨酯80与pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液混合均匀，将孢子洗脱，得去孢子混合菌液，将去孢子混合菌液接种至真菌种子液培养基中，培养得一级种子液；
将一级种子液接种至发酵培养液中，发酵得二级种子液，在发酵罐中加入发酵液，通入蒸汽进行实罐灭菌，降温，倒入二级种子液，并加入甘露糖，醋酸乙烯酯混合均匀，进行发酵，发酵完成后，得葡萄糖氧化酶发酵液；
葡萄糖氧化酶的分离与提纯：将葡萄糖氧化酶发酵液离心去除菌丝体收取上清液，并过微滤膜去除残留的颗粒和菌体，取上清液，透析1天后收集粗酶液，取粗酶液上离子交换层析柱，用NaCl溶液进行梯度洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥, 将冷冻干燥后的葡萄糖氧化酶加水稀释，再次放入离子交换层析柱中，用DTT缓冲溶液进行洗脱，层析完成后收集葡萄糖氧化酶活性管，透析脱盐，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶粉末；
葡萄糖氧化酶的固定化:将上述干燥的葡萄糖氧化酶粉末与磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合均匀，过滤，取过滤液，将聚乙烯醇、甲苯、氯仿、滤液混合均匀后加入反应容器,在反应容器中分别加入二氨基丙腈和过硫酸钾， 用搅拌器持续搅拌，在20～40℃的水浴中反应，加入N2作为保护气，反应，过滤，收集滤渣，分别用PBS缓冲溶液，碳酸氢钠溶液对滤渣进行洗涤，再用双重氮联苯胺溶液对滤渣交联处理40min，再使用蒸馏水冲洗，干燥，即得到固定化葡萄糖氧化酶。
2.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中田园土与生理盐水混合的质量比为1:9。
3.根据权利要求1所述的复合微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中种子菌株接种于斜面培养基的培养条件为在20~25℃温度条件下，培养5~7天，培养物、聚山梨酯80与pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液的质量比为100:15:300,一级种子液的培养条件是在23~28 ℃温度条件下，培养18~24 h。
4.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中一级种子液与发酵培养液的质量比为1:6，发酵条件为pH3.5~6.5，23~ 28℃，发酵60~72h，发酵罐中加入的发酵液与发酵罐的体积比为1:2，倒入的二级种子液的接种量按质量分数计，为10%，二级种子液、甘露糖、醋酸乙烯酯三种物质的质量比为2:1:1,在25~28℃的温度条件下，发酵36~72h得到葡萄糖氧化酶发酵液，测定含有酶活为4.5~5.6U。
5.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中平衡溶液为pH7.1±0.2，浓度为0.05mol/L的DTT缓冲溶液，进行梯度洗脱的是浓度为0.1~1mol/L NaCl溶液，冷冻干燥葡萄糖氧化酶与水混合的质量比为1:2。
6.根据权利要求1所述的固定化葡萄糖氧化酶的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）干燥的葡萄糖氧化酶粉末与pH4.5~5.6，浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液混合的质量比为1:5，将聚乙烯醇作为载体对游离酶进行包埋，聚乙烯醇、甲苯、氯仿、滤液的质量比2:5:8:5，二氨基丙腈和过硫酸钾的质量比为1:2，反应形成的固定化酶颗粒直径为100μm～200μm，用作交联处理的物质为质量分数为10%的双重氮联苯胺溶液。
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