CN102816701A - 用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物应用技术和食品生物技术领域，公开了用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株。该灰树花菌株已经于2011年4月7日保藏在中国武汉的武汉大学内中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏菌株编号为CCTCCNo:M2011113，名称为Grifolasp.JSU10-2。本发明通过原生质体激光诱变，得到了利用廉价原料高产菌丝多糖的菌株，该菌株和原始菌株分别液体发酵米糠和麸皮复合培养基，诱变菌株的菌丝干重和多糖分别比原始菌株提高了31.7%和32.6%。
Description
技术领域
本发明涉及食品微生物应用技术领域，尤其涉及一株适合在米糠和麸皮提取液复合培养基中生长并高产灰树花多糖的一株灰树花诱变新菌株。
背景技术
国内外科学研究和国内市场表明：食用菌多糖能增强人体免疫力，辅助治疗肿瘤等疾病，已成为肿瘤生物疗法选用的辅助用品。国内由食用菌子实体制成的药字号产品有安徽芜湖的灵芝胶囊、浙江庆元的灰树花胶囊等，由食用菌提取物制成的非药字号保健品也有销售。国际上新西兰产有“GanoPoly”（甘诺宝力）多糖提取物系列产品，销往美国、澳大利亚、中国（包括香港和台湾）等地方。该产品的发明人高益槐是国际知名食用菌产品开发专家，曾经获得爱因斯坦发明奖。高益槐发明的“GanoPoly”系列产品主要由灵芝、云芝、猴头等提取的多糖与壳聚糖一道复合构成，用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等。新西兰安发保健品有限公司现在中国福建泉州建有食用菌多糖的生产基地。在各种食用菌多糖的研究中，现在已有研究说明，药食两用食用菌灰树花的多糖也具有较好的提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等的功效，值得引起足够的重视，例如Ohno Naohito 、Suzuki Iwao等从灰树花菌体中提取灰树花多糖的药效试验表明，灰树花多糖具有抗肿瘤作用和免疫调节作用（参考文献见① Ohno N,Lino K,Suzuki I et al. Neutral and acidic antitumor polysaccharides extracted from cultured fruit bodies of Grifola Frondosa[J]. Chem. Pharm. Bull,1985,33(3):1181-1186；② Naohito Ohno,Yoshiyuki Adachi,Iwao Suzuki,et al.Characterization of the antiumor glucan obtained from liquid-cultured Grifola frondosa[J].Chem.pharm.Bull.1986,34(4):1709；③Iwao Suzuki,Koichi Hashimoto,Shozo Oikawa,et al.Antiumor and immunmodulating activity of a β-glucan obtained from liquid-cultureed Grifola frondosa[J].chem.Pharm Bull,1986,37(2):410.）。
灰树花（Grifola frondosa）是一种药食两用的食用菌，属担子菌亚门，层菌纲，无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花属。灰树花有多种名称，如贝叶多孔菌、千佛菌、栗子蘑、莲花菌、奇果菌、舞茸等 。野生灰树花分布于日本、欧洲、北美和我国许多地区，如黑龙江、吉林、河北、四川、云南、广西、福建等省区。近年来，国内灰树花已在一些省份如河北、浙江、福建等省获得栽培，用于鲜食或提取功能成分。 灰树花栽培的缺点是占用土地，生产周期相对较长。为高效生产灰树花多糖，研究人员对能工厂化生产的液体培养方法的研究十分重视，形成多种研究成果。1986年Ohno N等报道了灰树花液态培养的研究。国内江南大学陈石良的博士论文研究了灰树花深层发酵技术及灰树花的抗肿瘤多糖（参考文献见：陈石良. 药用真菌灰树花深层发酵技术及其抗肿瘤多糖的研究[D].博士学位论文.无锡:江南大学，2000.）。这类研究的内容主要涉及培养基研制、培养工艺、适宜菌种选育等。研究的重点是降低生产成本和提高多糖产量。多数工艺采用葡萄糖、粮食类原料如淀粉、马铃薯等作为培养基，即使用到农产品加工的副产品如米糠或麸皮，也是作为次要成分加入，一般还是以葡萄糖、粮食类原料或其他原料为主要碳源或氮源。现有的灰树花菌种难以在不添加葡萄糖或其他粮食类原料的米糠或麸皮的培养基上生长。本专利的设计人刘伟民、张建曾对原有灰树花菌种进行过初步微波-紫外复合诱变的处理，其诱变菌株在米糠、麸皮培养基上（不添加葡萄糖）液体发酵产灰树花多糖效果较好，菌丝干重和多糖较原有菌株分别提高39.24%和42.58%，并提交了中国发明专利申请，申请专利的名称是：用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株，申请号为201010579078.5。尽管该菌株生产的多糖较实验室原有的菌株生产的多糖有较大的提高，但诱变菌种会退化，从稳定诱变菌种、提高生产效率的角度而言，不断诱变菌种，获得更高的多糖产量仍是需要不断研究的问题和更高的发明创造的目标。另外，申请号为201010579078.5的灰树花菌株比较适合的发酵工艺是需要对米糠和麸皮先进行植物纤维酶的酶解，提供发酵所需的碳源，但引入酶解工艺会增加生产成本。如果诱变出高效灰树花菌株，在没有先期酶解的情况下，也能高效转化米糠和麸皮，则将达到创新的效果，本发明瞄准此目标，进行灰树花菌种的新诱变，以求获得新的生产灰树花多糖的高效菌株。
中国是农业大国，农副产品来源丰富。米糠、麸皮作为稻谷和小麦加工的副产物，不但其营养成分丰富，而且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灰树花生长所需要的碳源和氮源物质。在灰树花自身纤维素酶及其他酶的作用下，灰树花可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灰树花多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，完全替代葡萄糖等灰树花液体发酵所需的营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灰树花多糖，将具有经济价值。其关键问题为必须得到适宜在米糠和麸皮复合培养基上生长的灰树花菌株，所以必须对已有菌株进行诱变筛选。如能筛选出适宜的灰树花菌株，则研究和生产将有可能取得突破。目前微生物的物理选育方法主要有紫外诱变、离子束诱变、微波诱变等。本发明在实验室已有的菌株JSU10（即发明人已拥有的上述已申请专利的菌株）的基础上采用原生质体激光诱变方法，进一步诱变得到适合在米糠和麸皮复合培养基上生长并产灰树花多糖的高效菌株，所得菌株为首次发明得到。
发明内容
本发明解决上述现有技术中的不足，为了进一步降低生产成本，考虑采用大宗农产品稻谷和小麦等加工的副产品米糠和麸皮作为培养基，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，进行液体发酵，以节约原料成本、减少使用土地和缩短生产周期，但实现这一目标仍需要诱变筛选出在米糠麸皮提取液培养基中适宜生长的灰树花菌株。因此，为实现上述目的，在自然选育之外，通过不同的生物技术手段对灰树花菌株进行诱变，筛选出适宜的高产菌株尤为重要。
本发明将通过原生质体激光诱变的方法，以高产多糖为指标，定向高效转化米糠麸皮提取液为基础，选育出高产、低成本的灰树花菌株。通过一系列的稳定性、遗传性等筛选方法的建立，保证灰树花的优良性状，为进一步大规模利用低成本的米糠和麸皮生产高价值的灰树花多糖奠定基础。
本发明所采取的技术方案如下：
本发明提供一种用于高效发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的灰树花菌株Grifola sp.JSU10-2，该灰树花菌株Grifola sp. JSU10-2已经于2011年4月7日保藏在中国武汉的武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC ），保藏菌株编号为 CCTCC M2011113，名称为Grifola sp. JSU 10-2。该菌株可以在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮提取液培养基中具有高生长速率和高多糖产量的灰树花变株；
在本发明的一个方面中，提供上述灰树花菌株Grifola sp. JSU10-2 的用途，用于发酵米糠和麸皮提取液复合培养基生产灰树花多糖。
本发明的有益效果
国内外采用原生质体激光诱变技术选育灰树花高产菌株鲜见报道，针对不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基进行原生质体激光的灰树花诱变选育未见报道，故本发明由实验室现有的菌株Grifola sp. CGMCC4179为出发菌株进行原生质体激光诱变，以生长速率、菌丝干重和菌丝多糖为指标进行筛选，最终获得在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮提取液复合培养基中较出发菌株生长速度更快，多糖产量更高的诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2，其菌丝干重和菌丝多糖比已经提交发明专利申请的Grifola sp. CGMCC4179菌株又分别提高了31.7和32.6%，同时米糠和麸皮不用酶解处理，节约了酶的使用成本，获得了显著的效果。本发明的创新：不加其他碳源和氮源的米糠麸皮提取液液复合培养基技术；在Grifola sp. CGMCC4179菌株基础上，得到在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮未用酶解的提取液复合培养基上生长速度更快、多糖产量更高的诱变新菌株Grifola sp. JSU 10-2，使得本发明具有明显的经济效益，节约原料成本、减少使用土地和降低生产周期，生产出高价值的具有辅助抗肿瘤治疗效果的灰树花多糖。该方法使用原生质体激光诱变法诱变并筛选实验室现有的Grifola sp. CGMCC4179灰树花菌种，进一步得到具有高生长速率和高多糖产量的突变菌株Grifola sp. JSU 10-2，所得菌株适合在米糠和麸皮未用酶解的提取液复合培养基中快速生长并高产灰树花多糖，其液体发酵的菌丝干重和多糖较出发菌株分别提高了31.7%和32.6%。灰树花多糖具有辅助抗肿瘤治疗的价值，使得灰树花已经成为一种重要的药用真菌，但灰树花多糖大规模生产依然要面对成本高、产量低等一系列问题。基于此，本发明解决了一个技术问题：提供一株在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮未用酶解的提取液复合培养基中生长速度更快、多糖产量更高的灰树花诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2，所述诱变株是由实验室现有的灰树花菌株Grifola sp. CGMCC4179采用原生质体激光诱变技术选育，所述诱变株Grifola sp. JSU 10-2在相同条件下菌丝干重较出发菌株Grifola sp. CGMCC4179提高了31.7%，多糖产量较出发菌株Grifola sp. CGMCC4179提高了32.6%，并经过拮抗试验、蛋白电泳谱图比、酯酶同工酶电泳谱图比对和过氧化物酶同工酶电泳谱图比对证明诱变后的菌株Grifola sp. JSU 10-2与出发菌株Grifola sp. CGMCC4179遗传特性和发酵性能不同，从而得到了新的菌株，产生了有益的效果。
附图说明
图1为本发明菌株原生质体激光诱变选育方法的流程图；
图2为Grifola sp. JSU 10-2与出发菌株Grifola sp. CGMCC4179的拮抗图，其中注：左边为Grifola sp. JSU 10-2、右边为出发菌株Grifola sp. CGMCC4179；
图3为蛋白电泳谱图，注：1. Marker；2. 出发菌株Grifola sp. CGMCC4179；3. Grifola sp. JSU 10-2； 4. JSU10-1（另一种诱变方法获得的多糖产量不及本发明Grifola sp. JSU 10-2的菌株）；
图4为酯酶同工酶电泳谱图，注：1.出发菌株Grifola sp. CGMCC4179；2. Grifola sp. JSU 10-2；3. JSU10-1；
图5为过氧化物酶同工酶电泳谱图，注：1.出发菌株Grifola sp. CGMCC4179；2. Grifola sp. JSU 10-2；3. JSU10-1。
具体实施方式
本发明按照说明书附图1所示的流程，提供了原生质体激光诱变选育在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上具有高生长速率和高多糖产量的灰树花菌株的方法，所述方法包括下列步骤：
取实验室现有的灰树花Grifola sp. CGMCC4179为出发菌株；
将灰树花菌株接种于固体斜面培养基上进行恒温培养；
菌体长成后接种于液体种子培养基中培养得到灰树花种子液；
将种子液接种于液体发酵培养基中发酵得到灰树花菌丝体；
纯化菌丝体；
制备及纯化原生质体；
将上述得到的原生质体悬液在激光下照射进行诱变后，无光暗培养，一次筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；
在米糠、麸皮液体发酵培养基上进行发酵，二次筛选出高生长速率和高多糖产量的菌株；
进行稳定性和遗传性分析与鉴定；
在一个实施方案中，所用的固体斜面培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 10mg/L，琼脂20g/L，pH自然。
在一个实施方案中，所述恒温为28℃。
在一个实施方案中，所述液体种子培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 10mg/L， pH自然。
在一个实施方案中，所述液体发酵培养基为：米糠20g/L，麸皮30g/L（米糠、麸皮沸水煮3h后去渣取汁），磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B110mg/L。pH自然，250mL锥形瓶中分装100mL培养液 ，0.1MPa条件下灭菌30min。
在一个实施方案中，所述液体发酵培养条件为：在250mL三角瓶中装100mL发酵培养基，接种10%，在28℃、150r/min条件下培养七天。
在一个实施方案中，所述纯化菌丝体方法为：用灭菌的纱布过滤收集菌丝，依次用无菌水、0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂多次洗涤，3500r/min离心20min，弃去上清液，用灭菌滤纸吸干菌丝体水分。
在一个实施方案中，所述制备及纯化原生质体方法为：加酶量按每300mg湿菌丝体加1mL酶解液，室温下以100r/min水浴振荡酶解3h。酶解结束后，用灭菌的G3砂芯漏斗过滤除去残留的菌丝碎片，3000r/min离心10min，去上清液，沉淀用渗透压稳定剂清洗离心两次后，得到纯化的原生质体，将原生质体用渗透压稳定剂稀释成悬液数。
在一个实施方案中，所述酶解液为：复合植物水解酶Viscozyme L（丹麦诺维信公司生产，对购得的纤维素酶进行滤纸酶活力测定，FPU酶活=1590.41 IU/mL），用0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂配制成浓度为3%的高渗酶解液，储存于4℃冰箱中，用之前用灭菌的0.45μm微孔膜过滤除菌。
在一个实施方案中，所述原生质体激光诱变为将所制得的原生质体悬液调整到适当浓度，取1mL原生质体悬液置于1.8mL冻存管中，在LJL40-HA型氦氖激光治疗机上使冻存管与氦氖激光光源照射方向垂直，冻存管距光源3cm，照射时间60min。
在一个实施方案中，诱变结束后吸取0.2mL涂布于米糠麸皮再生筛选培养基平板上，在28℃避光再生培养4天。
在一个实施方案中，所述无光暗培养所用培养基为米糠麸皮再生平板培养基：米糠20g/L（100℃水煮3小时全米糠），麸皮30g/L（同米糠），磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 10mg/L，琼脂20g/L，pH自然，用0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂配制。
在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。
在一个实施方案中，所述一次筛选步骤为：取原生质体激光照射悬液0.2ml，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满米糠麸皮筛选培养基平板表面，每批涂4个平皿，待单菌落长成后选10株生长速度快且浓密的诱变菌株接种至新的筛选培养基平板上，在28℃恒温箱中培养约3天，制备种子液，发酵生产菌丝体，制取新的原生质体悬液，进行第二批诱变。如此连续诱变5批，最后挑选出25株较优良诱变株，对其传代培养，以菌丝生长速率为指标进行筛选，从中选出4株生长速度相对较快、形状较好、稳定性较高的变异株。
在一个实施方案中，所述二次发酵筛选步骤为：一次生长确定的较优良变异株作为二次筛选的对象，与出发菌株一起进行二次发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将一次筛选菌株和出发菌株进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目的诱变株。
在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。
在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为：米糠20g/L，麸皮30g/L（米糠、麸皮水煮3h取汁），磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 10mg/L，pH自然。
在一个实施方案中，所述指标为菌丝多糖和菌丝干重。
本发明中转化米糠和麸皮复合原料的灰树花突变株的分析鉴定方法，所述方法包括下列步骤：
种子液形态比对；
稳定性分析；
遗传性分析。
在一个实施方案中，所述为种子液形态比对，将斜面上的出发灰树花菌株Grifola sp. CGMCC4179和Grifola sp. JSU 10-2菌株接种到液体种子培养基内，在28℃恒温震荡摇床中培养5天，观察包括液体（清澈度、黏度）、菌球（大小、密度）、菌丝（长度、断裂现象）和香味等。
在一个实施方案中，所述稳定性分析为以菌丝生长速度为指标考察稳定性，对最终筛选出4株较优的变异菌株，经5次传代，选出最优的Grifola sp. JSU 10-2菌株，并与出发菌株Grifola sp. CGMCC4179对比。
在一个实施方案中，所述遗传性分析包括拮抗分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量（Mr）、酯酶同工酶同工酶电泳分析和过氧化物酶同工酶电泳分析。
实施例1 灰树花原生质体激光诱变
a．渗透压稳定剂的配制
0.6mol/L的甘露醇。
b．酶解液的配制
复合植物水解酶Viscozyme L（丹麦诺维信公司生产，对购得的纤维素酶进行滤纸酶活力测定，FPU酶活=1590.41 IU/mL）：用0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂配制成浓度为3%的高渗酶解液，储存于4℃冰箱中，用之前用灭菌的0.45μm微孔膜过滤除菌。
c．菌丝的培养和纯化
用米糠麸皮培养基作为出发菌株培养基，在250mL三角瓶中装100mL发酵培养基，接种10%，在28℃、150r/min条件下培养七天得菌丝体。
用灭过菌的纱布过滤收集菌丝，依次用无菌水、0.6mol/L的甘露醇渗透压稳定剂多次洗涤，3500r/min离心20min，弃去上清液，用灭菌滤纸将菌丝体水分吸干。
d．原生质体的制备和纯化
加酶量按每300mg湿菌丝体加1mL酶解液，室温下以100r/min水浴振荡酶解3h。
酶解结束后，用灭菌的G3砂芯漏斗过滤除去残留的菌丝碎片，3000r/min离心10min，去上清液，沉淀用渗透压稳定剂清洗离心两次后，得到纯化的原生质体，将原生质体用渗透压稳定剂稀释成悬液。
e．原生质体激光诱变
将所制得的原生质体悬液调整到适当浓度，取1mL原生质体悬液置于1.8mL冻存管中，光源照射方向与管体垂直，距冻存管3cm，照射时间60min。诱变结束后吸取0.2mL涂布于米糠麸皮再生培养基平板上，在28℃避光再生培养4天。
f．诱变菌株的筛选
取激光照射的原生质体悬液0.2mL，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满米糠麸皮再生筛选培养基平板表面，每批涂4个平皿，待单菌落长成后选10株生长速度快且浓密的诱变菌株接种至新的筛选培养基平板上，在28℃恒温箱中培养约3天，制备种子液，发酵生产菌丝体，制取新的原生质体悬液，进行第二批诱变。如此连续诱变5批，挑选出25株较优良诱变株，对其传代培养，以菌丝生长速率为指标进行筛选，从中选出4株生长速度相对较快、形状较好、稳定性较高的变异株。
将上述灰树花诱变株进行五代平板传代试验（以菌丝生长速度为指标考察稳定性）和五代摇瓶发酵试验（以菌丝多糖、菌丝干重为指标），筛选出目的诱变株Grifola sp. JSU 10-2。
表1 选出菌株各代生长速度
表2 变异菌株各代发酵菌丝体多糖
表3 变异菌株各代发酵菌丝干重
从表中1中看出诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2各代的生长速度均高于出发菌株Grifola sp. CGMCC4179，其生长速度在第三代稍有退化，但并不很明显，经过适应阶段后生长速度有所提高，到第五代生长速度为0.925mm/h，高于出发菌株Grifola sp. CGMCC4179。从表2和3中看出诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2菌丝多糖及干重产量相对稳定，均高于出发菌株，其第五代菌丝多糖和干重产量分别提高了28.9%和12.9%，菌株于2011年4月15日保藏在位于中国武汉的武汉大学内的中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏菌株编号为CCTCC No:M2011113，名称为Grifola sp. JSU 10-2。
试验一变异菌株的分析
1、种子液形态学比对
将斜面上的出发灰树花菌株Grifola sp. CGMCC4179和Grifola sp. JSU 10-2菌株接种到液体种子培养基内，在28℃恒温震荡摇床中培养5天，观察包括液体（清澈度、黏度）、菌球（大小、密度）、菌丝（长度、断裂现象）和香味等现象。结果为：变异菌株的种子液与Grifola sp. CGMCC4179差异较大，变异菌株液体清澈度较Grifola sp. CGMCC4179差，液体黏度较大；菌球大小比Grifola sp. CGMCC4179小，密度比Grifola sp. CGMCC4179大；菌丝长度稍短于Grifola sp. CGMCC4179，有轻微的断裂现象；均有浓郁的令人愉悦的香味。
、稳定性分析
以菌丝生长速度为指标考察稳定性，对最终筛选出25株较优的变异菌株，经3次传代，选出较优的4株菌株，将4株变异菌株进行五代平板传代试验（以菌丝生长速度为指标考察稳定性）选出目的菌株Grifola sp. JSU 10-2，再将Grifola sp. JSU 10-2进行五代摇瓶发酵试验（以菌丝多糖、菌丝干重为指标考察稳定性），从而确定目的诱变株Grifola sp. JSU 10-2的稳定性，其结果已经示于上述表1、表2、表3。
诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2各代的生长速度均高于出发菌株，其生长速度在第三代稍有退化，但并不很明显，经过适应阶段后生长速度有所提高，到第五代生长速度为0.925mm/h，高于出发菌株Grifola sp. CGMCC4179。诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2菌丝多糖及干重产量相对稳定，均高于出发菌株，其第五代菌丝多糖和干重产量分别提高了28.9%和12.9%。由此可见灰树花经原生质和激光诱变后产生的性状变异可以遗传。
、遗传性分析
(1) 拮抗性分析
把同样大小的变异菌株和出发菌株Grifola sp. CGMCC4179的菌块接种在同一PDA平板上，两菌株相距一定的距离，放在28℃的恒温培养箱中培养，3d后观察菌落间的拮抗现象。
不同种的食用菌菌丝在生长发育中，菌丝会相互限制对方的生长蔓延，产生拮抗，在交界处形成拮抗线，这就是拮抗现象。拮抗现象不仅在食用菌的不同种间存在，而且在同种但遗传特性有差异的菌株之间也存在，菌株之间拮抗作用的强弱反映了菌株间遗传差异性的大小，因此拮抗现象不仅可以用于判断菌株间的亲缘关系，而且可以用于育种，鉴定菌株是否产生变异。本试验将出发菌株Grifola sp. CGMCC4179与变异菌株接于同一平板上产生了一定的拮抗，从说明书附图2可以看出左边变异菌株Grifola sp. JSU 10-2的生长形态发生了一定的变化，其菌丝生长致密，生长速度明显快于右边的出发菌株，且与出发菌株形成了拮抗线，说明了出发菌株Grifola sp. CGMCC4179和变异菌株Grifola sp. JSU 10-2产生了遗传差异性。
(2) 电泳分析
电泳分析试验包含三部分：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量（Mr）、酯酶同工酶同工酶电泳分析和过氧化物酶同工酶电泳分析。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的相对分子质量（Mr）
① 蛋白提取
称取米糠麸皮培养基上生长并干燥后的菌丝0.5g，加6mL缓冲液（内含0.065mol/L Tris-柠檬酸，pH8.2），-20℃下冷冻24h，置于研钵中，冰浴下研磨成糊状，4℃下离心（10000r/min,10min），取上清液放于4℃冰箱保存备用（上清液保存时间超过15小时须重新配置）。
②贮液配制
Ars/Bis贮液配制：称取150g丙烯酰胺和4g双丙烯酰胺置于洗净烘干的烧杯中，加300mL重蒸水，用干净玻璃棒搅匀溶解，将溶液定容在500mL容量瓶内，盛于棕色瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
1.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.8）贮液:称取90.75 Tris放入500mL烧杯中，加蒸馏水400mL溶解，用1mol/L盐酸调pH值至8.8，倒入500mL容量瓶中，加蒸馏水定容到500mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8）贮液:称取12g Tris放入100mL烧杯中，加蒸馏水溶解，用1mol/L盐酸调pH值至6.8，倒入200mL容量瓶中，加蒸馏水定容到200mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
10%过硫酸铵：称取0.5g过硫酸铵溶于50mL重蒸水中，盛于棕色试剂瓶中，现配先用。
1×Tris-甘氨酸电极缓冲液贮液：称取3.025g Tris、18.75g甘氨酸、1gSDS用于1000mL蒸馏水中。
1×SDS上样缓冲液：50mM Tris-HCl（pH6.8）、20%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、100mM DTT（现加），保存于－20℃冰箱。即用时每0.5 mL上样缓冲液加0.0072g DTT。
1%溴酚蓝溶液：称0.5g溴酚蓝加重蒸水50mL溶于滴瓶内备用。
TEMED溶液：直接用原液，小瓶分装，避免挥发。
染色液：甲醇450mL，冰乙酸100mL，双蒸水450mL，考马斯亮蓝R-250 2.5g。
脱色液：冰乙酸75mL，甲醇50Ml，加蒸馏水定容道1000mL。
保存液：7%的醋酸溶液。
③凝胶配制（现配先用）
5%浓缩胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH6.8）2.50mL、Ars/Bis贮液1.7mL、10%AP 0.15mL、TEMED6μL、20%SDS 50μL、双蒸水5.60mL。
10%分离胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH8.8）2.50mL、Ars/Bis贮液3.25mL、10%AP 0.10mL、TEMED4μL、20%SDS 50μL、双蒸水4.25mL。
④操作步骤
A．电泳
a．将玻璃板洗净、晾干、固定。
b．配制分离胶，将分离胶注入玻璃板夹层中至玻璃板上端约1cm处，缓缓注入约1mL正丁醇封于分离胶之上，保持胶面平整。放在37℃恒温条件下静止30-60min，直到分离胶层与正丁醇之间形成平直清晰的界面。
c．配制浓缩胶，倾斜倒出分离胶表面正丁醇（也可用滤纸吸取），以浓缩胶缓冲液淋洗分离胶上端空腔2~3次，吸干，插点样梳于两玻璃板夹缝中，灌注浓缩胶，没过梳子。
d．室温放置约60min，待浓缩胶凝固后迅速拔出梳子，用100μL微量注射器抽取电极缓冲液清洗加样孔。
e．将凝胶连同玻璃板从制胶器上取下，放入电泳仪下槽，先将上槽加入电极缓冲液，然后在下槽内加入电极缓冲液（最高可至距平玻璃板上沿3mm处）。
f．加样
样品预处理：取50 μL上样缓冲液（现加0.0072g DTT）和50 μL样品液，混匀，于沸水浴中加热1~2min。
进样：用微量注射器吸取样品预处理液20μL，插入样品槽底部胶面上，推动样品液进入样品小槽底部，加样毕，轻轻抽出进样器。
g．电泳
加样完毕后静止3min，使样品完全沉入样品槽底部，打开电源，开始稳压70V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至120V，待溴酚蓝指示剂达到分离胶底部边缘上约0.5~1cm时，即刻停止电泳。
B．检测蛋白
a．剥胶：电泳结束后，放掉电极缓冲液，松开斜插板，取出玻璃胶室，在两块玻璃下角空隙内用刀片背面轻轻撬动，除去浓缩胶，取出凝胶，并切角做记号。
b．染色：凝胶放入染色盘中，加适量染色液至液面完全覆盖凝胶，将染色盘置于脱色摇床，室温染色1~2h。
c．脱色：倾去染色液，用蒸馏水清晰凝胶几次，加入脱色液，在脱色摇床上室温脱色几次至背景脱净为止。
d．保存：脱色完成后将凝胶保存于7%的醋酸溶液中。
⑤ 电泳图谱分析
染色后的胶板用卡尺测量指示剂及各条酶带的迁移距离，按式计算迁移率R f 值。
式中，x 1为酶带迁移距离；x 2为指示剂迁移距离。图谱见说明书附图3。
电泳分析结果为：
从附图3蛋白图谱中可以看出，出发菌株Grifola sp. CGMCC4179有10条谱带，分子量分别为44, 000、36,900、31,100、27,100、21,700、20,600、17,300、16,500、15,500和14,200道尔顿，与Grifola sp. CGMCC4179相比较变异菌株Grifola sp. JSU 10-2在分子量44,000道尔顿位置上谱带消失，而在分子量40,900道尔顿出现谱带。说明诱变菌株遗传特性相对于出发菌株发生了变化。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析酯酶同工酶
① 蛋白提取
称取米糠麸皮培养基上生长并干燥后的菌丝0.5g，加6mL缓冲液（内含0.065mol/L Tris-柠檬酸，pH8.2），-20℃下冷冻24h，置于研钵中，冰浴下研磨成糊状，4℃下离心（10000r/min,10min），取上清液放于4℃冰箱保存备用（上清液保存时间超过15小时须重新配置）。
②贮液配制
Ars/Bis贮液配制：称取150g丙烯酰胺和4g双丙烯酰胺置于洗净烘干的烧杯中，加300mL重蒸水，用干净玻璃棒搅匀溶解，将溶液定容在500mL容量瓶内，盛于棕色瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
1.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.8）贮液:称取90.75 Tris放入500mL烧杯中，加蒸馏水400mL溶解，用1mol/L盐酸调pH值至8.8，倒入500mL容量瓶中，加蒸馏水定容到500mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
0.5mol/L Tris-HCl缓冲液（pH6.8）贮液:称取12g Tris放入100mL烧杯中，加蒸馏水溶解，用1mol/L盐酸调pH值至6.8，倒入200mL容量瓶中，加蒸馏水定容到200mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
10%AP：称取0.5g过硫酸铵溶于50mL重蒸水中，盛于棕色试剂瓶中，现配先用。
1×Tris-甘氨酸电极缓冲液贮液：称取3.025g Tris、18.75g甘氨酸、1gSDS用于1000mL蒸馏水中。
1×SDS上样缓冲液：50mM Tris-HCl（pH6.8）、20%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、100mM DTT（现加），保存于－20℃冰箱。即用时每0.5 mL上样缓冲液加0.0072g DTT。
1%溴酚蓝溶液：称0.5g溴酚蓝加重蒸水50mL溶于滴瓶内备用。
TEMED溶液：直接用原液，小瓶分装，避免挥发。
染色液A：称取100mg醋酸-α-萘酯和100mg醋酸-β-萘酯，分别用5mL丙酮溶解，溶解后的醋酸萘酯用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.4）定容至100mL。
染色液B：4%的铁氰化钾溶液（现配先用）。
保存液：7%的醋酸溶液。
③凝胶配制（现配先用）
5%浓缩胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH6.8）2.50mL、Ars/Bis贮液1.7mL、10%AP 0.15mL、TEMED6μL、20%SDS 50μL、双蒸水5.60mL。
10%分离胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH8.8）2.50mL、Ars/Bis贮液3.25mL、10%AP 0.10mL、TEMED4μL、20%SDS 50μL、双蒸水4.25mL。
④操作步骤
A．电泳
a．将玻璃板洗净、晾干、固定。
b．配制分离胶，将分离胶注入玻璃板夹层中至玻璃板上端约1cm处，缓缓注入约1mL正丁醇封于分离胶之上，保持胶面平整。放在37℃恒温条件下静止30-60min，直到分离胶层与正丁醇之间形成平直清晰的界面。
c．配制浓缩胶，倾斜倒出分离胶表面正丁醇（也可用滤纸吸取），以浓缩胶缓冲液淋洗分离胶上端空腔2~3次，吸干，插点样梳于两玻璃板夹缝中，灌注浓缩胶，没过梳子。
d．室温放置约60min，待浓缩胶凝固后迅速拔出梳子，用100μL微量注射器抽取电极缓冲液清洗加样孔。
e．将凝胶连同玻璃板从制胶器上取下，放入电泳仪下槽，先将上槽加入电极缓冲液，然后在下槽内加入电极缓冲液（最高可至距平玻璃板上沿3mm处）。
f．加样
样品预处理：取50 μL上样缓冲液（现加0.0072g DTT）和50 μL样品液，混匀。
进样：用微量注射器吸取样品预处理液20μL，插入样品槽底部胶面上，推动样品液进入样品小槽底部，加样毕，轻轻抽出进样器。
g．电泳
加样完毕后静止3min，使样品完全沉入样品槽底部，打开电源，开始稳压70V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至120V，待溴酚蓝指示剂达到分离胶底部边缘上约0.5~1cm时，即刻停止电泳。
B．检测蛋白
a．剥胶：电泳结束后，放掉电极缓冲液，松开斜插板，取出玻璃胶室，在两块玻璃下角空隙内用刀片背面轻轻撬动，除去浓缩胶，取出凝胶，并切角做记号。
b．染色：凝胶放入染色盘中，加适量染色液A至液面完全覆盖凝胶，将染色盘置于脱色摇床，37℃保温染色15~20min，弃去染色液A，用蒸馏水稍加漂洗,再用染色液B染色,直至显出酶带，待酶带清晰后用蒸馏水冲洗干净。
c．保存：染色完成后将凝胶保存于7%的醋酸溶液中。
⑤ 电泳图谱分析
染色后的胶板用卡尺测量指示剂及各条酶带的迁移距离，按式计算迁移率R f 值。
式中，x 1为酶带迁移距离；x 2为指示剂迁移距离。图谱见说明书附图4。
电泳分析结果为：
从附图4酯酶同工酶图谱可知，出发菌株Grifola sp. CGMCC4179和诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2均有2条谱带，位置分别为：R f1 =0.292，R f2 =0.580。即诱变菌株JSU10-1相比出发菌株Grifola sp. CGMCC4179的谱带位置没变，且酶带条数也没有变化，但诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2 在R f1 =0.292处的酶带比出发菌株Grifola sp. CGMCC4179略深，在R f2 =0.580处的酶带比出发菌株Grifola sp. CGMCC4179略浅，即诱变后与诱变前菌株的酶活性不同，说明诱变菌株遗传特性相对于出发菌株发生了变化。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析过氧化物酶同工酶
① 蛋白提取
称取米糠麸皮培养基上生长并干燥后的菌丝0.5g，置于预先在冰浴中冷却的小研钵中，加样品提取液（pH8.0Tris-HCl缓冲液）6mL，冰浴下研磨成糊状，4℃下离心（10000r/min,10min），取上清液放于4℃冰箱保存备用（上清液保存时间超过15小时须重新配置）。
②贮液配制
Ars/Bis贮液配制：称取150g丙烯酰胺和4g双丙烯酰胺置于洗净烘干的烧杯中，加300mL重蒸水，用干净玻璃棒搅匀溶解，将溶液定容在500mL容量瓶内，盛于棕色瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
Tris-HCl缓冲液（pH8.9）贮液:称取36.8gTris放入烧杯中，用少量重蒸水溶解，加入48mL1mol/L HCl调pH值至8.9后，定容至100mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
Tris-HCl缓冲液（pH6.7）贮液: 称取5.98gTris放入烧杯中，用少量重蒸水溶解，加入48mL1mol/L HCl调pH值至8.9后，定容至100mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
10%AP：称取0.5g过硫酸铵溶于50mL重蒸水中，盛于棕色试剂瓶中，现配先用。
0.04g/L核黄素溶液：称取4mg核黄素溶于100mL重蒸水中，盛于棕色试剂瓶中，放入4℃冰箱，可保存一周。
10×Tris-甘氨酸电极缓冲液贮液（pH8.3）：称取6g Tris、28.8g甘氨酸用无离子水定容到1000mL，用时稀释10倍。
40%蔗糖溶液：称取蔗糖40g，加无离子水定容到100mL，4℃冰箱中避光保存。
样品提取液（pH8.0Tris-HCl缓冲液）：称取12.1g Tris加无离子水溶解，用1mol/L HCl调pH值至8.0后，定容至1000mL，盛于试剂瓶中放在4℃冰箱中避光保存。
0.2%溴酚蓝溶液：称取0.2g溴酚蓝溶于100mL无离子水中，放在4℃冰箱中保存。
TEMED溶液：直接用原液，小瓶分装，避免挥发。
染色液（联苯胺染色液）：称取0.1g联苯胺溶于5mL无水乙醇中，加1.5mol/LNaAc溶液 10mL，1.5mol/LHAc溶液 10mL，蒸馏水70mL，用前滴加H2O2原液5滴（约250μL）。
保存液：7%的醋酸溶液。
③凝胶配制（现配先用）
浓缩胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH6.7）0.625mL、Ars/Bis贮液0.7mL、10%AP 0.25mL、TEMED10μL、0.04g/L核黄素溶液1mL、双蒸水2.7mL。
分离胶组成为：Tris-HCl缓冲液（pH8.9）1.8mL、Ars/Bis贮液3.5mL、10%AP 0.15mL、TEMED6μL、0.04g/L核黄素溶液2mL、双蒸水7.7mL。
④操作步骤
A．电泳
a．将玻璃板洗净、晾干、固定。
b．配制分离胶，将分离胶注入玻璃板夹层中至玻璃板上端约1cm处，缓缓注入约1mL正丁醇封于分离胶之上，保持胶面平整。放在37℃恒温条件下静止30-60min，直到分离胶层与正丁醇之间形成平直清晰的界面。
c．配制浓缩胶，倾斜倒出分离胶表面正丁醇（也可用滤纸吸取），以浓缩胶缓冲液淋洗分离胶上端空腔2~3次，吸干，插点样梳于两玻璃板夹缝中，灌注浓缩胶，没过梳子。
d．室温放置约60min，待浓缩胶凝固后迅速拔出梳子，用100μL微量注射器抽取电极缓冲液清洗加样孔。
e．将凝胶连同玻璃板从制胶器上取下，放入电泳仪下槽，先将上槽加入电极缓冲液，然后在下槽内加入电极缓冲液（最高可至距平玻璃板上沿3mm处）。
f．加样
样品预处理：取一定量的样品液和等量的40%蔗糖溶液混合，加总体积1/5的0.2%的溴酚蓝溶液（作为指示剂），混匀。
进样：用微量注射器吸取样品预处理液30μL，插入样品槽底部胶面上，推动样品液进入样品小槽底部，加样毕，轻轻抽出进样器。
g．电泳
加样完毕后静止3min，使样品完全沉入样品槽底部，打开电源，开始稳压70V，待溴酚蓝进入分离胶后加大电压至120V，待溴酚蓝指示剂达到分离胶底部边缘上约0.5~1cm时，即刻停止电泳。
B．检测蛋白
a．剥胶：电泳结束后，放掉电极缓冲液，松开斜插板，取出玻璃胶室，在两块玻璃下角空隙内用刀片背面轻轻撬动，除去浓缩胶，取出凝胶，并切角做记号。
b．染色：凝胶放入染色盘中，加适量染色液至液面完全覆盖凝胶，将染色盘置于脱色摇床，37℃保温染色30min，待酶带清晰后倒去染色液，用蒸馏水冲洗干净。
c．保存：染色完成后将凝胶保存于7%的醋酸溶液中。
⑤ 电泳图谱分析
染色后的胶板用卡尺测量指示剂及各条酶带的迁移距离，按式计算迁移率R f 值。
式中，x 1为酶带迁移距离；x 2为指示剂迁移距离。图谱见说明书附图5。
电泳分析结果为：
从附图5过氧化物酶同工酶图谱可知，出发菌株Grifola sp. CGMCC4179和诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2均有2条谱带，位置分别为：R f1 =0.226，R f2 =0.555。即诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2相比出发菌株Grifola sp. CGMCC4179的谱带位置没变，且酶带条数也没有变化，但诱变菌株Grifola sp. JSU 10-2在R f1 =0.226和R f2 =0.555处的酶带比出发菌株Grifola sp. CGMCC4179都浅，即诱变后与诱变前菌株的酶活性不同，说明诱变菌株遗传特性相对于出发菌株发生了变化。
试验二突变菌株 Grifola sp. JSU 10-2和出发菌株 Grifola sp. CGMCC4179产量比较
液体发酵培养基为：米糠120g/L，麸皮120g/L，米糠、麸皮常压下95℃浸提3h后，去渣取汁，磷酸二氢钾0.2g/L，硫酸镁0.1g/L，维生素B12mg/L，pH自然。 0.1MPa条件下灭菌30min。
液体种子培养基为：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素B1 10mg/L， pH自然。
装样量为发酵罐容积的80%，培养温度为28℃，通风量为装罐液体体积/mim，搅拌速度150r/min，罐表压0.05MPa，接种量8%，培养时间4d。
称重法测定菌丝干重，苯酚硫酸法测定菌丝多糖。将液体培养所得的菌丝体经离心分离后，再用蒸馏水洗涤3次，以除去菌丝体表面所黏附的培养液，放入鼓风干燥箱中，在60℃条件下干燥至恒重，经称量即得菌丝干重。向烘干的菌丝中加入一定体积蒸馏水，经研磨后，在80℃水浴中浸提3h，3000r/min离心取上清液，Sevage法脱蛋白后，再用3倍体积的95%的乙醇溶液醇沉提取胞内多糖，采用苯酚硫酸法测定菌丝多糖。试验结果为：（1）突变菌株Grifola sp. JSU 10-2和出发菌株Grifola sp. CGMCC4179在相同条件和培养基中发酵，菌丝干重分别为10.8g/L和8.2g/L，突变菌株Grifola sp. JSU 10-2的菌丝干重较出发菌株Grifola sp. CGMCC4179发菌株的菌丝干重提高了31.7%。（2）突变菌株Grifola sp. JSU 10-2和出发菌株Grifola sp. CGMCC4179在相同条件和培养基中发酵，菌丝多糖分别为1.262g/L和0.952g/L，突变菌株Grifola sp. JSU 10-2的菌丝多糖较出发菌株Grifola sp. CGMCC4179的菌丝多糖提高了32.6%。发酵试验表明，突变菌株Grifola sp. JSU 10-2和出发菌株Grifola sp. CGMCC4179相比，发酵性能发生了变化。
Claims (2)
1.用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株Grifola sp. CCTCC M2011113。
2.权利要求1所述的灰树花菌菌株（Grifola sp.）的用途，其特征在于用于由米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖。
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