CN106520579B - 一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌发酵液培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌发酵液培养基，本培养基通过制备获得沙雷氏菌发酵液，将其添加到常规斑玉蕈液体培养基中，培养斑玉蕈。该方法可以促进斑玉蕈菌丝的生长及其锰过氧化物酶、纤维素酶、木聚糖酶的分泌。本发明确定了沙雷氏菌无菌发酵液的制备及其添加最适体积比，通过测量斑玉蕈菌丝的生长及其锰过氧化物酶、纤维素酶、木聚糖酶的分泌证明其对斑玉蕈的生长发育有促进作用。利用沙雷氏菌促进斑玉蕈的生长发育还未见报道。

Description

一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌发酵液培养基

技术领域

本发明涉及食用菌生产技术领域，具体涉及一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌属发酵液培养基。

背景技术

沙雷氏菌（Serratia marcescens）是肠杆菌科的一种条件致病菌，存在于土壤、水、植物、动物以及人类的肠道和呼吸道中。已有研究证实，粘质沙雷氏菌能够分泌多种重要的胞外蛋白与酶，如溶血素、细菌素、核酸酶、几丁质酶、脂肪酶、以及多种蛋白酶，如丝氨酸类蛋白酶、及金属蛋白酶等。这些胞外分泌酶类在许多领域都有广泛的应用。例如脂肪酶对一些有机溶剂具有耐受性，可用于手性化合物不对称合成；几了质酶可以催化水解生物高聚物几丁质的糖苷键，从而具有重要的工业价值。

斑玉蕈(Hypsizygus marmoreus )又名玉蕈，它不仅形态美观，质地脆嫩，味道美味独特，营养也非常丰富，因独特的口感，有“菇中第一脆”的美誉。其子实体的提取物具有提高免疫力、降血压和延缓衰老等功效，是一种高蛋白、低脂肪、低热量的食用兼药用的珍稀名贵食用菌。近年来，斑玉蕈深受消费者的青睐，在日本人们常把它与珍贵的松茸相提并论，并享有“闻则松茸，食则玉蕈”的美称。

斑玉蕈是一个低温结实性品种，在栽培生产中发菌速度较为缓慢，后熟时间较长，生产周期长达120-150天以上，且易受外界环境因素的影响。目前，工厂化斑玉蕈栽培主要从两个方面的来增产、增效与增收，一种是培育优良品种，另一种是优化培养配方。近年来斑玉蕈栽培工厂化生产获得了快速的发展，导致生产原料（如棉子壳、麸皮、玉米芯、木屑等）匮乏，大多数原料需从外地采购，原料价格和运输成本的快速上涨在一定程度上增加了食用菌的生产成本。另外，不同来源地的原料因外界自然环境和种植条件等因素的影响，会导致作为栽培料工厂化种植斑玉蕈存在生产差异，急需一种来源稳定、可重复性强的优化配方培养基来降低食用菌生产成本并是工厂化栽培过程的斑玉蕈品质更为稳定具有重要的意义。沙雷氏菌发酵液具有重复性性好，操作简单便捷，生产成本低廉，当前关于促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌属发酵液培养基尚无相关研究报道，本发明可填补相关领域空白，为工厂化标准化斑玉蕈栽培提供保障，具有良好的经济效益和社会效益。

发明内容

本发明针对生产原料价格居高不下、运输成本高来来源受外界自然环境影响较大等生产实际问题，本发明的目的在于提供一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌属发酵液培养基，解决斑玉蕈生长周期较长，为斑玉蕈的栽培提供一种理论依据，这对促进斑玉蕈工厂化生产，促进行业增产增收增效等方面具有着重要的意义。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌属发酵液培养基， 所述的培养基为包含沙雷氏菌发酵液的PDA培养基；沙雷氏菌发酵液与PDA培养基体积比为（1-9）:（91-99）。

优选的，沙雷氏菌发酵液与PDA固体培养基体积比为1:19或沙雷氏菌无菌发酵液与PDA液体培养基体积比为3:97。

沙雷氏菌发酵液的制备方法为取原-80℃保存的沙雷氏菌活化，活化后菌液转接于LB液体培养基，置于30℃、180rpm摇床振荡培养12h，培养后菌液稀释至OD值为0.7。

利用所述的培养基培养斑玉蕈的方法，包括如下步骤：

（1）取原-80℃保存的沙雷氏菌活化，活化后菌液转接于LB液体培养基，置于30℃、180rpm摇床振荡培养12h，培养后菌液稀释至OD值为0.7；

（2）将（1）中菌液于8000 rpm离心15min，取上清，在超净工作台用0.22μm滤膜过滤并分装于无菌EP管制得沙雷氏菌的无菌发酵液；

（3）无菌操作环境下，将沙雷氏菌无菌发酵液加入到PDA固体培养基或PDA液体培养基中；

（4）每个PDA固体培养基平板中接d=1.5cm斑玉蕈菌块1块或每瓶100mLPDA液体培养基接d=1cm斑玉蕈菌块10块，置于 24℃恒温培养箱中培养；

（5）从第3d起每隔2d测其菌丝生长速度、观察其形态特征、测定其锰过氧化物酶、纤维素酶和木聚糖酶，测至第11d结束。

（6）添加了20mL HZSO-1发酵液的出菇总朵数与有效菇朵数相比对照明显来的高，且成菇质量好此外其出菇不管是质量还是其他各项指标都是最好。

本发明的优点在于：首次提出沙雷氏菌促进斑玉蕈生长发育的方法，为斑玉蕈的栽培提供一种新的理论依据，这对促进食用菌业向着工厂化方向稳步快速发展有着重要的意义。

附图说明

图1 添加不同体积比发酵液对斑玉蕈菌丝（上）和菌丝生长速度的影响（下）。对照组为无添加沙雷氏菌无菌发酵液；A、B、C添加沙雷氏菌无菌发酵液/PDA固体培养基体积比分别为5:100、3:97、2:98。

图2、添加不同体积比发酵液斑玉蕈锰过氧化物酶酶活。对照组为无添加沙雷氏菌无菌发酵液；A、B、C、D、E添加沙雷氏菌无菌发酵液/PDA液体培养基体积比分别为1:99、3:97、5:95、7:93、9:91。

图3、添加不同体积比发酵液斑玉蕈纤维素酶酶活，对照组为无添加沙雷氏菌无菌发酵液；A、B、C、D、E添加沙雷氏菌无菌发酵液/PDA液体培养基体积比分别为1:99、3:97、5:95、7:93、9:91。

图4、添加不同体积比发酵液斑玉蕈木聚糖酶酶活。对照组为无添加沙雷氏菌无菌发酵液；A、B、C、D、E添加沙雷氏菌无菌发酵液/PDA液体培养基体积比分别为1:99、3:97、5:95、7:93、9:91。

图5 灭菌前添加不同浓度梯度的细菌发酵液对白玉出菇影响。A：空白对照；B：加5mL发酵液；C：加10mL发酵液；D：加15mL发酵液；E：加20mL发酵液。

图6灭菌前添加20mL细菌发酵液(下)与对照（上）出菇对比， A：空白对照；B：加20mL发酵液。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 供试菌株

斑玉蕈Hypsizygus marmoreus、沙雷氏菌为福建农林大学微生物工程实验室保藏。

1.2 供试培养基

PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉3 g、蛋白胨3 g、KH₂PO₄ 1.5 g、MgSO₄·7H₂O 1.5 g，pH自然；

LB培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，pH7.2；

固体培养基在以上液体培养基中添加琼脂。

1.3 方法

1.3.1 沙雷氏菌无菌发酵液的制备

将沙雷氏菌活化与转接并隔夜培养至OD值三倍稀释度为0.7左右，培养后菌液于8000rpm离心15min，取上清液，在超净工作台用0.22μm滤膜过滤并分装于无菌EP管中密封4℃保存备用。

1.3.2 菌株生长速度测定实验

将斑玉蕈菌株分别接种于沙雷氏菌无菌发酵液/PDA固体培养基（（1-9）:（91-99），体积比）的平板上，以不添加无菌发酵液作对照，每种培养基的平板接种菌块（d=1.5cm）做3个重复，置于 24℃恒温培养箱中培养，从第3d开始每隔2d测其菌丝生长速度，并观察其形态特征。

1.3.3 粗酶液提取

将菌株分别接种于沙雷氏菌无菌发酵液/PDA液体培养基体积比为（1-9）:（91-99）的液体培养基中，以不添加无菌发酵液作对照，每瓶接种菌块10块（d=1cm）做 3 个重复，置于 24℃、120rpm摇床培养，从第3d开始每隔2d无菌操作环境下取一次酶液，于8000rpm离心10min取上清即为粗酶液。

1.3.4 锰过氧化物酶（MnP）酶活测定

采用愈创木酚法测定锰过氧化物酶活性，1.5mL 酶液，含有终浓度为 0.4mmol/L的愈创木酚，0.1mmol/L的H₂O₂，0.2mmol/L的MnSO₄及50mmol/L的琥珀酸钠缓冲体系（pH4.5），以0.1mmol/L的H₂O₂启动反应。测定465nm 处，反应开始前3min的吸光值的增加，以灭活15min的粗酶液作为空白对照。

1.3.5 滤纸法测纤维素酶

在具塞试管中加入（50±1）mg 滤纸、1mL酶液和1mL100mmol/L HAc‐NaAc 缓冲液（pH4.6），置于50℃恒温水浴锅中保温1h，取出后立即加入3mL DNS溶液，沸水显色5min，冷却至室温，加蒸馏水定容至25mL，测其520nm处OD值，以灭活15min的粗酶液作为空白对照。

1.3.6 木聚糖酶的测定

在具塞试管中加入 1%木聚糖溶液1.5mL、酶液0.5mL，置于50℃恒温水浴锅中保温20min，取出后立即加入3mL DNS溶液，沸水显色5min，冷却至室温，加蒸馏水定容至10mL，测其550nm 处OD值，以灭活15min的粗酶液作为空白对照。

2 结果与分析

2.1 不同体积比发酵液对斑玉蕈的生长影响

添加低体积比沙雷氏菌无菌发酵液能促进斑玉蕈菌丝的生长速度和伸展度，且菌丝更稠密更洁白，其在沙雷氏菌无菌发酵液/PDA固体培养基体积比为5:95时促进效果最优，见图1。

2.2 不同体积比发酵液对斑玉蕈酶活影响

2.2.1 锰过氧化物酶测定结果

斑玉蕈在添加沙雷氏菌无菌发酵液与PDA液体培养基不同体积比中锰过氧化物酶与对照组有明显差异，高体积比的无菌发酵液明显抑制斑玉蕈锰过氧化物酶的分泌，而低体积比的无菌发酵液促进锰过氧化物酶的分泌且在第7d达到最大值，为7.67U/mL，其相比对照提高了1.34U/mL，结果见图2。

2.2.2 纤维素酶测定结果

斑玉蕈在添加沙雷氏菌无菌发酵液与PDA液体培养基不同体积比中纤维素酶各组之间有明显差异，低体积比的无菌发酵液明显促进斑玉蕈纤维素酶的分泌，最适体积比为（沙雷氏菌无菌发酵液/PDA液体培养基）3:97，在第7d达到最大值，为3594U/L，比对照的2564U/L提高了1030U/L，而添加高体积比的无菌发酵液纤维素酶酶活比对照组相对来得低，结果见图3。

2.2.3 木聚糖酶测定结果

斑玉蕈在添加沙雷氏菌无菌发酵液与PDA液体培养基不同体积比中木聚糖酶各组之间有明显差异，高体积比的无菌发酵液木聚糖酶酶活比对照组相对来得低，但低体积比的无菌发酵液明显促进斑玉蕈纤维素酶的分泌，最适体积比为3:97，在第7d达到最大值，为65.3U/mL，相比对照组的40.6U/mL提高了24.7U/mL，结果见图4。

2.2.4添加不同浓度梯度的粘质沙雷氏菌 H30发酵液对出菇的影响

灭菌前添加不同浓度梯度的粘质沙雷氏菌 H30发酵液出菇与对照组有明显差异，见图5、图6，添加了粘质沙雷氏菌 H30发酵液斑玉蕈出菇明显优于对照组，尤其在添加20mL时效果最优，在其可采摘时对照组菇蕾才形成。此外，添加了粘质沙雷氏菌 H30发酵液斑玉蕈出菇比对照组其菇蕾密而多，说明粘质沙雷氏菌 H30发酵液对其出菇具有明显的促进作用。

3.1.1.2子实体表观测定

表1 子实体表观测定

注:对照组为不添加发酵液，横杠后数字表示添加发酵液体积（mL）。

由表1可以看出，添加了粘质沙雷氏菌 H30发酵液的出菇总朵数与有效菇朵数相比对照明显来的高，此外添加了20mL粘质沙雷氏菌 H30发酵液其出菇不管是质量还是其他各项指标都是最好。

Claims (3)

1.一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌发酵液培养基，其特征在于： 所述的培养基为包含沙雷氏菌发酵液的PDA培养基；沙雷氏菌发酵液与PDA培养基体积比为1-5: 95-99；

所述的PDA培养基为马铃薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉3 g、蛋白胨3 g、KH₂PO₄ 1.5 g、MgSO₄·7H₂O 1.5 g，pH自然；

沙雷氏菌发酵液的制备方法为取原-80℃保存的沙雷氏菌活化，活化后菌液转接于LB液体培养基，置于30℃、180rpm摇床振荡培养12h，培养后菌液稀释至OD值为0.7。

2.根据权利要求1所述的一种促进斑玉蕈生长发育的沙雷氏菌发酵液培养基，其特征在于：沙雷氏菌发酵液与PDA固体培养基体积比为1:19或沙雷氏菌无菌发酵液与PDA液体培养基体积比为3:97。

3.利用权利要求1所述的培养基培养斑玉蕈的方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取原-80℃保存的沙雷氏菌活化，活化后菌液转接于LB液体培养基，置于30℃、180rpm摇床振荡培养12h，培养后菌液稀释至OD值为0.7；

（2）将（1）中菌液于8000 rpm离心15min，取上清，在超净工作台用0.22μm滤膜过滤并分装于无菌EP管制得沙雷氏菌的无菌发酵液；

（3）无菌操作环境下，将沙雷氏菌无菌发酵液加入到PDA固体培养基或PDA液体培养基中；

（4）每个PDA固体培养基平板中接d=1.5cm斑玉蕈菌块1块或每瓶100mLPDA液体培养基接d=1cm斑玉蕈菌块10块，置于 24℃恒温培养箱中培养；

（5）从第3d起每隔2d测其菌丝生长速度、观察其形态特征、测定其锰过氧化物酶、纤维素酶和木聚糖酶，测至第11d结束。