CN105255964B

CN105255964B - 一种β-葡聚糖的生产方法

Info

Publication number: CN105255964B
Application number: CN201510725996.7A
Authority: CN
Inventors: 贾艳; 诸辉
Original assignee: Ningbo Xi Nuoya Marine Organisms Science And Technology Ltd
Current assignee: Ningbo Xi Nuoya Marine Organisms Science And Technology Ltd
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2015-10-30
Publication date: 2019-01-18
Anticipated expiration: 2035-10-30
Also published as: CN105255964A

Abstract

本发明公开了一种β‑葡聚糖的生产方法，包括以下步骤：(1)裂褶菌菌种活化；(2)种子活化；(3)发酵培养；(4)粗提；(5)纯化。采用葡萄糖25～30g/L、山梨醇10～15g/L、磷酸二氢钾0.2～0.8g/L、七水硫酸镁3～5g/L、硫酸铵0.5～1g/L、三乙胺盐酸盐0.1～0.5g/L、微量元素混合液1～2.2ml/L和水组成的无色液体培养基作为发酵培养基，对菌种进行深层的液体发酵培养，得到无色的发酵液。整个过程没有色素的存在，不需要经过脱色步骤，减少了由于吸附造成的损耗，克服了β‑葡聚糖分离纯化的难题，得到高纯度的白色β‑葡聚糖，适合大规模的工业生产。

Description

一种β-葡聚糖的生产方法

技术领域

本发明涉及一种β-葡聚糖的生产方法。

背景技术

葡聚糖是存在于燕麦、大麦、小麦、酵母和真菌中的天然多聚糖，包括由葡萄糖链接而成的1,3-葡聚糖、1,4-葡聚糖(含有支链)和1,6-葡聚糖(不含支链)，它们可能是α型也可能是β型。大量的研究表明，β-葡聚糖为一种良好的免疫促进剂，可有效刺激免疫细胞，不仅能增强生物体特异性免疫反应，同时也提高了非特异性免疫反应。此外，β-葡聚糖还能使生物体抵抗细菌、真菌、病毒及寄生虫的感染，并且抑制肿瘤的生长，在国外已经得到很好的临床应用。由于β-葡聚糖在生物、医药、保健、食品方面巨大的应用价值，因此如何能有效地获得高纯度的β-葡聚糖，特别是获取能达到注射针剂标准的具有生物活性的β-葡聚糖，成为当前研究的一个重点方向。

目前，β-葡聚糖的获得主要有三种方式：一种是直接从燕麦、大麦、小麦等植物果实中提取，一种直接从蘑菇中提取，还有一种是通过生物技术分离培养得到菌种，再经过深层发酵分得到。第一种方法虽然原料成本低，但是提取过程复杂、效率低下，得到的β-葡聚糖分支度低、分子量小、水溶性和结构稳定性差，应用价值大打折扣；第二种方法虽然得到的β-葡聚糖的分支度、分子量、水溶性以及结构稳定性都比较高，但是蘑菇来源成本高，周期长，生产空间大，产量低，产物后处理困难，并且容易残留杂质；第三种方法周期相对比较短，产物的分支度、分子量、水溶性等性质可以通过选择不同的菌种以及控制发酵条件来进行选择，但是需要大量的研究才能确定发酵的优化条件。

然而，无论上述哪种方法，在生产过程中都会产生大量成分复杂的色素，必须经过脱色步骤才能提高纯度和产品质量。考虑到要保持β-葡聚糖的生物活性、周期不能太长、环境友好不能使用过多有机溶剂、生产成本要低等诸多因素，目前实用的脱色方法只有使用活性炭或者树脂吸附。但是，这两种方法的原理都是物理吸附，在除去色素的同时会同时吸附产物β-葡聚糖，使得产物的损耗率很大，产率大大降低。

发明内容

针对现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种β-葡聚糖的生产方法，利用含有特别组成的培养基及常规的发酵处理设备，对菌种进行深层的液体发酵培养，整个过程没有色素的存在，克服了β-葡聚糖分离纯化的难题，不需要经过脱色步骤，大大地较少了产品的损耗，也适合β-葡聚糖大规模的工业化生产。

本发明所提供的一种β-葡聚糖的生产方法，包括如下步骤：

(1)裂褶菌菌种活化：将马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5～10g/L、酵母浸粉5～10g/L、琼脂15～20g/L制成平板培养基，把裂褶菌菌种接种到该平板培养基上，20℃～30℃培养4～10天得到平板菌丝体；

(2)种子活化：将马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5～10g/L、酵母浸粉5～10g/L、水制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/5～1/3，取步骤(1)所得的平板菌丝体接种该摇瓶，20℃～30℃培养器中培养，培养时间4～10天，作为种子液；

(3)发酵培养：将葡萄糖25～30g/L、山梨醇10～15g/L、磷酸二氢钾0.2～0.8g/L、七水硫酸镁3～5g/L、硫酸铵0.5～1g/L、三乙胺盐酸盐0.1～0.5g/L、微量元素混合液1～2.2ml/L、水制成的发酵培养基加入发酵罐中，再将步骤(2)所得的种子液接种上述发酵罐中，20℃～40℃发酵培养5～10天；

(4)粗提：将步骤(3)所得的发酵罐中混合物打浆，加热至60℃～80℃，离心分离得到上清液，利用有机膜使上清液浓缩至原体积1/2～1/5，加入浓缩液体积2～5倍95％乙醇醇析，再次离心得到粗多糖；

(5)纯化：将步骤(4)所得的粗多糖加水复溶，加入蛋白酶经Sevage法洗涤脱蛋白，静置分层后，压滤，在滤液加入2～5倍乙醇醇析，干燥后获得产物β-葡聚糖。

上述生产方法中，所述步骤(1)的裂褶菌菌种可以提取自食用菌或者海洋真菌类，举例但非限制，如巴西蘑菇、冬虫夏草、灵芝、云芝、樟芝、桑黄、珊瑚菇、香菇、田头菇、柳松菇、猴头菇、杏鲍菇、花瓣茸、木茸、金针菇、藻类。

上述生产方法中，所述步骤(2)的培养器转速90～180rpm。

上述生产方法中，所述步骤(3)发酵培养基中的微量元素混合液所含组分及含量为Na₂EDTA 16～20g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.5～3.0g/L、FeSO₄·7H₂O 2.2～2.6g/L、CoSO₄·7H₂O0.06～0.12g/L、CuCl₂·7H₂O 0.1～0.3g/L、NaBO₂·4H₂O 12～16g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06～0.12g/L、NiCl₂·2H₂O 0.22～0.26g/L，其余为水，上述浓度为溶解后各组分的最终浓度。

上述生产方法中，所述步骤(3)的发酵条件为发酵罐转速100～300rpm，溶氧DO值在10％～40％。

上述生产方法中，所述步骤(4)的有机膜是超滤浓缩膜，孔径10～50nm。

上述生产方法中，所述步骤(5)加入蛋白酶的种类为中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的一种或者几种。

上述生产方法中，所述步骤(5)加入的每种蛋白酶的量按照每升发酵液加入1g～10g计算。

本发明提供的方法生产的最终产物为白色粉末，其主成分为β-葡聚糖，纯度高于95％，β-葡聚糖的保留率高于90％。

本发明的方法发酵培养基采用无机氮源，避免了以往专利中采用的有机氮源造成发酵液颜色深、发酵液有沉淀等现象以及因成分复杂和可靠性导致的代谢产物复杂、不可控因素多等缺点，并添加山梨醇，有效促进细胞分泌胞外多糖。本发明的培养基配制后呈无色透明，既含有发酵必需的营养成分和能量来源，又成分明确，容易控制，减少了不可控因素以及其他代谢产物的生成。正是由于采用了这种无极氮源的无色液体培养基，得到的发酵液也是无色的，经过简单的分离、纯化、干燥后，即得到白色粉末状β-葡聚糖。这摒弃了传统培养基中采用黄豆粉、玉米粉等有机氮源发酵后，发酵液浑浊、颜色深、必须经过脱色处理的缺点。本发明的方法减少了发酵液后处理的脱色步骤，也就减少了产物β-葡聚糖由于脱色时的吸附所带来的损耗，简化了生产工艺和设备，降低了生产成本，缩短了生产周期。本发明所得产物β-葡聚糖由于是裂褶菌发酵得来，水溶性好、生物活性高，并且纯度高、保留率高，可以很好地应用于生物、医药、保健、食品方面，也满足大规模工业化生产的需求。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的具体技术方案做进一步说明。

实施例1.

步骤一、裂褶菌菌种活化：

在无菌操作条件下，将裂褶菌菌种接种于平板培养基上，置于20℃培养箱培养，其中改良平板培养基包含马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉10g/L、酵母浸粉10g/L、琼脂20g/L。培养4天后，开始出现菌丝体，6天后菌丝体长满固体培养基，得到纯白色、绒状的平板菌丝体。

步骤二、种子活化：

将马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉5g/L制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/3。取步骤一所得的平板菌丝体接种于该摇瓶，在转速180rpm、温度18℃培养器中培养10天，作为种子液。

步骤三、发酵培养：

将葡萄糖25g/L、山梨醇10g/L、磷酸二氢钾0.2g/L、七水硫酸镁3g/L、硫酸铵0.5g/L、三乙胺盐酸盐0.1g/L、微量元素混合液1ml/L与水混合，形成液体发酵培养基，加入100L发酵罐中。其中，微量元素混合液所含组分及含量为Na₂EDTA 16g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.5g/L、FeSO₄·7H₂O 2.2g/L、CoSO₄·7H₂O 0.06g/L、CuCl₂·7H₂O 0.1g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06g/L、NiCl₂·2H₂O 0.22g/L，其余为水，上述浓度为溶解后各组分的最终浓度。

以5％接种量，将步骤二中的种子液接种至100L发酵罐发酵培养，其中控制发酵条件为：转速100rpm，溶氧DO值在10％，并利用转速控制液体中的溶氧量。随着培养时间的延长，发酵液中还原糖(以葡萄糖计)不断减少、PH都在不断降低，菌丝体重量不断增加，多糖含量、发酵液粘度不断升高。培养5天后,还原糖下降到1％，PH下降至4.8，菌球的体积占发酵液总体积70％，终止发酵。

步骤四、粗提：

将步骤三所得的发酵罐中混合物打浆，加热至60℃，离心分离获得发酵上清液，利用孔径为10nm的超滤浓缩膜使发酵液浓缩至原体积1/2，加入浓缩液体积2倍95％乙醇醇析2h，再经离心机离心得到粗多糖。

步骤五、纯化：

将步骤四所得的粗多糖加水复溶，得到透明均一的β-葡聚糖溶液，加入浓度为1g/L的中性蛋白酶经Sevage法洗涤脱蛋白，静置分层后，板框压滤后，滤液加入2倍无水乙醇醇析，干燥后获得产物β-葡聚糖。

实施例1生产的最终产物最终产物为白色粉末，其主成分为β-葡聚糖，纯度为97.7％，β-葡聚糖的保留率为95.8％。

实施例2.

步骤一、菌种活化：

在无菌操作条件下，将裂褶菌菌种接种于平板培养基上，置于30℃培养箱培养，其中平板培养基包含马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉5g/L、酵母浸粉5g/L、琼脂15g/L。培养2天后，开始出现菌丝体，2天后菌丝体长满固体培养基，得到纯白色、绒状的平板菌丝体。

步骤二、种子活化：

将马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉10g/L、酵母浸粉10g/L制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/5。取步骤一所得的平板菌丝体接种于该摇瓶，在转速90rpm、温度30℃培养器中培养4天，作为种子液。

步骤三、发酵培养：

将葡萄糖30g/L、山梨醇15g/L、磷酸二氢钾0.8g/L、七水硫酸镁4g/L、硫酸铵1g/L、三乙胺盐酸盐0.5g/L、微量元素混合液2.2ml/L与水混合，形成液体发酵培养基，加入500L发酵罐中。其中，微量元素混合液所含组分及含量为Na₂EDTA20g/L，其余为水，上述浓度为溶解后各组分的最终浓度。

以10％接种量，将步骤二中的种子液接种至500L发酵罐发酵培养，其中控制发酵条件为：转速300rpm，溶氧DO值在40％，并利用转速控制液体中的溶氧量。随着培养时间的延长，发酵液中还原糖(以葡萄糖计)不断减少、PH都在不断降低，菌丝体重量不断增加，多糖含量、发酵液粘度不断升高。培养10天后,还原糖下降到0.5％，PH下降至3.5，菌球的体积占发酵液总体积80％，终止发酵。

步骤四、粗提：

将步骤三所得的发酵罐中混合物打浆，加热至80℃，离心分离获得发酵上清液，利用孔径为50nm的超滤浓缩膜使发酵液浓缩至原体积1/5，加入浓缩液体积5倍95％乙醇醇析3h，再经离心机离心得到粗多糖。

步骤五、纯化：

将步骤四所得的粗多糖加水复溶，得到透明均一的β-葡聚糖溶液，加入中性蛋白酶(3g/L)和胰蛋白酶(5g/L)经Sevage法洗涤脱蛋白，静置分层后，板框压滤后，滤液加入5倍无水乙醇醇析，干燥后获得产物β-葡聚糖。

实施例2生产的最终产物最终产物为白色粉末，其主成分为β-葡聚糖，纯度为96.5％，β-葡聚糖的保留率为93.5％。

实施例3.

步骤一、菌种活化：

在无菌操作条件下，将裂褶菌菌种接种于平板培养基上，置于28℃培养箱培养，其中改良PDA平板培养基包含马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，牛肉浸粉8g/L，酵母浸粉8g/L，琼脂17.5g/L。培养3天后，开始出现菌丝体，3天后菌丝体长满固体培养基，得到纯白色、绒状的平板菌丝体。

步骤二、种子活化：

将马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉8g/L制成的液体培养基装入摇瓶，装液量为1/4。取步骤一所得的平板菌丝体接种于该摇瓶，在转速150rpm、温度28℃培养器中培养7天，作为种子液。

步骤三、发酵培养：

将葡萄糖27g/L、山梨醇13g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、七水硫酸镁5g/L、硫酸铵0.8g/L、三乙胺盐酸盐0.3g/L、微量元素混合液1.8ml/L与水混合，形成液体发酵培养基，加入1t发酵罐中。其中，微量元素混合液所含组分及含量为Na₂EDTA 17.5g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.8g/L、FeSO₄·7H₂O 2.4g/L、CoSO₄·7H₂O 0.08g/L、CuCl₂·7H₂O 0.2g/L、NaBO₂·4H₂O 14g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.08g/L、NiCl₂·2H₂O0.24g/L，其余为水，上述浓度为溶解后各组分的最终浓度。

以8％接种量，将步骤二中的种子液接种至1t发酵罐发酵培养，其中控制发酵条件为：转速200rpm，溶氧DO值在30％，并利用转速控制液体中的溶氧量。随着培养时间的延长，发酵液中还原糖(以葡萄糖计)不断减少、、PH都在不断降低，菌丝体重量不断增加，多糖含量、发酵液粘度不断升高。培养10天后,还原糖下降到0.8％，PH下降至4.5，菌球的体积占发酵液总体积72％，终止发酵。

步骤四、粗提：

将步骤三所得的发酵罐中混合物打浆，加热至70℃，离心分离获得发酵上清液，利用孔径为25nm的超滤浓缩膜使发酵液浓缩至原体积1/3，加入浓缩液体积3倍95％乙醇醇析2.5h，再经离心机离心得到粗多糖。

步骤五、纯化：

将步骤四所得的粗多糖加水复溶，得到透明均一的β-葡聚糖溶液，加入中性蛋白酶(1g/L)、胰蛋白酶(1g/L)和木瓜蛋白酶(10g/L)经Sevage法洗涤脱蛋白，静置分层后，板框压滤后，滤液加入3倍无水乙醇醇析，干燥后获得产物β-葡聚糖。

实施例3生产的最终产物最终产物为白色粉末，其主成分为β-葡聚糖，纯度高为95.0％，β-葡聚糖的保留率为90.0％。

以上实施例最终得到的均是白色粉末状的β-葡聚糖，不含有明显的色素，并且纯度很高。这充分说明了本发明所述方法的有益效果，即可以省去脱色这一常规步骤，依然得到高品质的β-葡聚糖。

本发明采用以下方法确定产物的主成分为β-葡聚糖：

1)基本组成分析

用苯酚-硫酸法测定本法产物的多糖含量，用凯氏定氮法测本法产物的蛋白质含量，结果表明本法产物的主成分为糖(总糖含量均高于95％)。

2)单糖组成分析

用高效液相色谱法(HPLC)测定本法产物总糖的水解产物，结果表明本法产物中的糖水解后主要为葡萄糖(葡萄糖含量均高于95％)。

3)产物分子量分布测定

用高效凝胶过滤色谱法(HPSEC)测定本法产物的分子量及其分布，结果表明，本法产品中的糖主要是以高分子形式存在的，即主成分为葡聚糖。

4)特征光谱分析

用红外吸收光谱测定本法产物的特征吸收峰，结果表明，本法产物是一种β-葡聚糖。

本发明产物中β-葡聚糖的含量采用刚果红染色法测定。

本发明所称β-葡聚糖的保留率为经过步骤(5)后的最终产物与经过步骤(4)的粗多糖的质量百分比。

Claims

1.一种β-葡聚糖的生产方法，其特征在于，生产方法包括以下步骤：

(3)发酵培养：将葡萄糖25～30g/L、山梨醇10～15g/L、磷酸二氢钾0.2～0.8g/L、七水硫酸镁3～5g/L、硫酸铵0.5～1g/L、三乙胺盐酸盐0.1～0.5g/L、微量元素混合液1～2.2ml/L、水制成的发酵培养基加入发酵罐中，再将步骤(2)所得的种子液接种上述发酵罐中，20℃～40℃发酵培养5～10天；所述微量元素混合液所含组分及含量为Na₂EDTA 16～20g/L、ZnSO₄·7H₂O 2.5～3.0g/L、FeSO₄·7H₂O 2.2～2.6g/L、CoSO₄·7H₂O 0.06～0.12g/L、CuCl₂·7H₂O 0.1～0.3g/L、NaBO₂·4H₂O 12～16g/L、Na₂MoO₄·2H₂O 0.06～0.12g/L、NiCl₂·2H₂O 0.22～0.26g/L，其余为水，上述浓度为溶解后各组分的最终浓度；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的培养器转速90～180rpm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)的发酵条件为发酵罐转速100～300rpm，溶氧DO值在10％～40％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)的有机膜是超滤浓缩膜，孔径10～50nm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)加入蛋白酶的种类为中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的一种或者几种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)加入的每种蛋白酶的量按照每升发酵液加入1g～10g计算。