CN108410744A - 一种产多糖、腺苷和虫草素的融合菌株 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产多糖、腺苷和虫草素的融合菌株。本发明公开的融合菌株为将蛹虫草菌与羊肚菌进行融合筛选得到融合菌株，得到的融合菌株具有以下特征：与蛹虫草菌和羊肚菌相比，融合菌株的生物量均增加，融合菌株的产物种类和产物产量也均增加；其中，产物种类体现在组成多糖的单糖种类、腺苷和虫草素上，该多糖的组成包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。本发明得到的融合菌株，丰富了珍稀药食同源真菌的活性成分，实现了一菌多效以及蛹虫草资源和羊肚菌资源生物活性物质有效补充，从而生理活性成分多优并举，生理活性功能多效叠加的目的，具有极高的现实意义与应用价值。

Description

一种产多糖、腺苷和虫草素的融合菌株
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种产多糖、腺苷和虫草素的融合菌株。
背景技术
自然界中能够感染杀虫的子囊菌类真菌已被鉴定的达1500多种，统称为广义虫草菌，这些真菌在昆虫种群的自然调控中发挥着重要作用。而其中最具有代表性的冬虫夏草、蛹虫草和蝉花等为代表的虫草菌有悠久的食药用历史。蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，属于真菌界，分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，核菌纲，球壳菌目，麦角菌科，虫草属。蛹虫草分布广、生长快、易培养、含有多种活性成分，对人体具有多种生理功能。近年来，科学工作者们在蛹虫草活性物质的生物合成途径、无性型的生物学特征、人工栽培、液体深层发酵培养、培养基组成、培养条件优化、菌丝体及代谢产物的化学成分检测、分离、提取、纯化及其功能、优良菌株选育、功能性食品研制、保健药物开发等方面进行了大量的研究，取得了许多可喜的成果。大量研究已检测或分离到蛹虫草含有的多类活性成分，如虫草素、腺苷、虫草酸(D-甘露醇)、虫草多糖、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、麦角甾醇等，其对促进机体新陈代谢，提高机体免疫功能等具有积极意义。此外，蛹虫草还含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素及微量元素等成分。2009年原卫生部批准蛹虫草为新资源食品，认定其作为新保健食品，为冬虫夏草的良好替代品。2014年国家卫生计生委批准蛹虫草作为新食品原料，取消了对蛹虫草的食用量及使用范围等限制，更进一步体现了蛹虫草作为健康食品的安全性和可行性。随着现代技术的发展，采用液体深层发酵工程技术既可以快速生产蛹虫草菌丝体，也可以获得发酵液，同时还可以改进工艺参数，优化培养条件，富集目的生理活性物质，提高生物活性物质的含量，为大规模开发新型健康食品提供便利。
羊肚菌同样作为世界著名的野生食(药)用菌,因其表面有蜂窝状的可孕头部,外观极似羊肚而得名。羊肚菌肉质脆嫩鲜美、营养和药用价值均极高,故在食品、医药、保健、化妆品等领域显示出极大的开发潜力。羊肚菌(Mor chella esculenta),俗称羊肚蘑、羊肚菜、阳雀菌等,属子囊菌亚门(Ascomyco tina),盘菌目(Pezizales),羊肚菌科(Morchellaceae),羊肚菌属(Mor chel la)。羊肚菌营养丰富,其氨基酸含量为各食用菌之首。羊肚菌多糖是其最主要生理活性成分之一,具有增强肌体免疫力、促进副肾皮激素的分泌、降低胆固醇、预防动脉硬化、抗疲劳、抗病毒、抑制肌癌-180等诸多作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何有效提高真菌活性产物的种类及真菌菌丝体产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一株融合菌株，所述融合菌株为将蛹虫草菌与羊肚菌进行细胞融合得到的菌株；与所述蛹虫草菌和所述羊肚菌相比，所述融合菌株的生物量均增加。
上述融合菌株具体可为将所述蛹虫草菌和所述羊肚菌的原生质体进行融合得到的菌株。
所述生物量可为菌丝体的生物量。
上述融合菌株中，与所述蛹虫草菌和所述羊肚菌相比，所述融合菌株的产物种类和/或产物产量均可增加。
上述融合菌株中，所述融合菌株产物种类的增加可体现在下述A1)和/或A2)上：
A1)与所述蛹虫草菌和所述羊肚菌相比，所述融合菌株合成的多糖的组分均增加；
A2)与所述羊肚菌相比，所述融合菌株能合成腺苷和/或虫草素。
所述融合菌株合成的多糖的组分增加具体可表现在所述融合菌株的多糖中含有所述蛹虫草菌的多糖中所不含有的木糖和阿拉伯糖，还含有所述羊肚菌的多糖中所不含有的半乳糖。
上述融合菌株中，所述融合菌株产物产量增加可体现在下述B1)和/或B2)上：
B1)与所述蛹虫草菌相比，所述融合菌株的多糖产量和/或虫草素产量增加；
B2)与所述羊肚菌相比，所述融合菌株的多糖产量增加。
上述融合菌株中，所述多糖可为由如下单糖中的至少两种组成的多糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
上述融合菌株中，所述蛹虫草菌可为中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2016220的菌株。
上述融合菌株中，所述羊肚菌可为羊肚菌CICC 14033。
上述融合菌株可为融合菌株FJR1181，将融合菌株FJR1181命名为蛹虫草FJR1181(Cordyceps militaris FJR1181)，所述蛹虫草FJR1181在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2017824。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分可为所述融合菌株。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述融合菌株的培养方法，所述方法包括：将所述融合菌株在种子培养基或发酵培养基中进行培养，完成所述融合菌株的培养；
所述种子培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度分别为：白糖40.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、玉米淀粉20.0g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钾0.75/L、VB10.05g/L、VB20.02g/L、氨基酸营养母液5ml/L和微量元素母液10ml/L，pH为6.3；
所述氨基酸营养母液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度分别为：甘氨酸0.6g/L、苏氨酸0.5g/L、缬氨酸0.3g/L、亮氨酸0.1g/L、异亮氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸0.2g/L、脯氨酸0.1g/L、羟脯氨酸0.06g/L、半胱氨酸0.04/L、色氨酸0.05g/L、甲硫氨酸0.1g/L、赖氨酸0.2g/L和谷氨酸0.1g/L；
所述微量元素母液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度分别为：硫酸亚铁16.5mg/L，氯化钙16.5mg/L，硫酸铜0.3mg/L，硫酸锌3.5mg/L；
所述发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为：葡萄糖8g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母粉1.0g/100mL，黄豆粉2.0g/100mL，玉米粉5.5g/100mL，小麦粉0.5g/100mL，硫酸胺0.5g/100mL，磷酸二氢钾0.75g/100mL，磷酸氢二钾0.25g/100mL，硫酸镁0.3g/100mL，所述氨基酸营养母液0.5ml/100ml，所述微量元素母液10ml/100ml，维生素B12mg/100ml，维生素B21mg/100ml，维生素B61mg/100ml，pH为6.8。
上述融合菌株中，所述白糖具体可为白砂糖，所述白砂糖具体可为苏州欧扬化工科技有限公司产品。
所述种子培养基和所述发酵培养基均可为无菌培养基。
所述黄豆粉具体可为黄豆去皮后磨制而成的粉末。
所述玉米粉具体可为玉米去皮后磨制而成的粉末。
所述小麦粉具体可为小麦去皮后磨制而成的粉末。
为解决上述技术问题，本发明还提供了多糖、腺苷或虫草素的制备方法，所述方法包括：培养所述融合菌株，得到菌株培养液，从所述菌株培养液中提取得到多糖、腺苷或虫草素。
上述方法中，所述多糖可为由如下单糖中的至少两种组成的多糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
为解决上述技术问题，本发明还提供了所述菌剂或所述融合菌株的培养方法在制备多糖、腺苷和/或虫草素中的应用。
上述应用中，所述多糖可为由如下单糖中的至少两种组成的多糖：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。
开展蛹虫草菌株与羊肚菌菌株的融合选育研究，丰富珍稀药食同源真菌的活性成分，实现一菌多效，是实现蛹虫草资源和羊肚菌资源生物活性物质有效补充的一个全新课题，从而生理活性成分多优并举，生理活性功能多效叠加的目的，具有极高的现实意义与应用价值。本发明的融合菌株FJR1181与双亲菌株相比，生物量和产物种类均增加；与亲本之一蛹虫草菌相比，生物量、多糖产量和虫草素产量均增加，且组成多糖的单糖种类增加，能合成亲本蛹虫草菌多糖组分中所不含有的木糖和阿拉伯糖；与亲本之一羊肚菌相比，生物量和多糖产量均增加，组成多糖的单糖种类增加，可以合成羊肚菌多糖组分中所不含有的半乳糖，还可以合成羊肚菌所不能合成的腺苷和虫草素。表明，本发明的融合菌株具有丰富的产物种类，还具有较高的产物合成能力，具有极大的生产意义。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：蛹虫草(Cordyceps militaris)
生物材料的菌株编号：FJR1181
生物材料的保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(cctcc)
生物材料的保藏单位简称：CCTCC
生物材料的保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心邮编：430072
生物材料的保藏日期：2017年12月22日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CCTCC No：M2017824
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：蛹虫草菌(Cordyceps militaris)
生物材料的菌株编号：FY1421
生物材料的保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(cctcc)
生物材料的保藏单位简称：CCTCC
生物材料的保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学保藏中心邮编：430072
生物材料的保藏日期：2016年4月21日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CCTCC No：M2016220
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例中的蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)已于2016年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M2016220。
下述实施例中的羊肚菌CICC 14033(Morchella sp CICC 14033)，为中国工业微生物菌种保藏管理中心(简称CICC)产品。
实施例1、融合菌株FJR1181的选育
本实施例将蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)与羊肚菌CICC14033的原生质体进行融合，得到一株新的生物量、多糖、腺苷及虫草素均高产的融合菌株。具体操作步骤如下：
1、出发双亲菌株菌丝体的收集
将出发的亲本之一，菌株蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)接种至PDA固体斜面培养基，24-28℃培养5-7天后，用无菌生理盐水将斜面孢子洗脱，得到洗脱液，然后使用无菌滤纸过滤所述洗脱液得到孢子悬液，按10-20％接种量将孢子悬液转接于PDA液体培养基(PDA液体培养基组分包括：马铃薯浸出粉20g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨15g/L，磷酸二氢钾0.8g/L，硫酸镁0.3g/L，维生素B1 20mg/L，余量为水，调pH至6.5-7.0，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)培养，250mL的三角瓶内转液量为50mL，内含10粒玻璃珠，于恒温振荡器24-28℃，100-150rpm，培养24-36h，培养结束后，获得液体培养物，8000rpm离心10min收集菌丝体，并用无菌生理盐水洗涤二次，离心、无菌滤纸吸干水分，最后收集得到蛹虫草菌FY1421菌丝体。
将出发的另一亲本菌株，羊肚菌CICC 14033(Morchella spCICC 14033)接种至综合PDA固体培养基的18×180mm试管斜面(其中，综合PDA固体斜面组成包括：马铃薯浸出粉20g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 1.5g/L，维生素B1100μg/L，琼脂15-20g/L，余量为水，自然pH，121℃高压蒸汽灭菌20-30min)，24-26℃培养5-7天，然后用无菌生理盐水将固体斜面中的孢子洗下制备孢子洗脱液，并使用无菌滤纸过滤所述洗脱液得到孢子悬液，按10-20％的接种量将该孢子悬液接种于PDA液体培养基中，250mL的三角瓶内转液量为50mL，内含10粒玻璃珠，以100-150r/min的转速恒温振荡器培养24-36小时，获得液体培养物，8000rpm，离心10min，收集菌丝体即得到羊肚菌CICC 14033菌丝体。
2、双亲本出发菌株原生质体悬液的制备
以步骤1制备菌丝体为原料，以浓度为45g/L的氯化钾水溶液为渗透压稳定剂，采用溶壁酶(广东省微生物菌种保藏中心)、蜗牛酶(生工生物工程(上海)股份有限公司)和纤维素酶(生工生物工程(上海)股份有限公司)混合的酶解液。
其中，蛹虫草菌FY1421菌丝体的酶解破壁方法如下：向45g/L的氯化钾水溶液中添加溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶，得到溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶的浓度分别为0.8％(质量百分比浓度)、0.8％(质量百分比浓度)和0.8％(质量百分比浓度)的蛹虫草菌菌丝体酶解液；将步骤1得到的蛹虫草菌FY1421菌丝体添加至蛹虫草菌菌丝体酶解液中(蛹虫草菌FY1421菌丝体与蛹虫草菌菌丝体酶解液的配比为2.5g步骤1得到的蛹虫草菌FY1421菌丝体：100mL蛹虫草菌菌丝体酶解液)后，于28℃下酶解6h，酶解pH为6.5，得到蛹虫草菌原生质体，原生质体浓度达到1×107个/mL，并且该方法下得到的原生质体的效率高(显微观察显示菌丝体基本全部形成原生质体)，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)，达到30％。将得到的原生质体离心后，去上清液，利用45g/L的氯化钾水溶液重悬原生质体，得到蛹虫草菌原生质体悬液。
羊肚菌CICC 14033菌株酶解破壁方法为：向45g/L的氯化钾水溶液中添加溶壁酶和纤维素酶，得到溶壁酶和纤维素酶的浓度分别为1.8％(质量百分比浓度)和1.8％(质量百分比浓度)的羊肚菌菌丝体酶解液；将步骤1得到的羊肚菌CICC 14033菌丝体添加至羊肚菌菌丝体酶解液中(羊肚菌CICC 14033菌丝体与羊肚菌菌丝体酶解液的配比为1.8g步骤1得到的羊肚菌CICC 14033菌丝体：100mL羊肚菌菌丝体酶解液)后，于28℃下酶解4h，酶解pH为6.5，得到羊肚菌原生质体，原生质体浓度达到1×107个/mL，并且该方法下得到的原生质体的效率高(显微观察显示菌丝体基本全部形成原生质体)，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)，达到30％。将得到的原生质体离心后，去上清液，利用45g/L的氯化钾水溶液重悬原生质体，得到羊肚菌原生质体悬液。
3、双亲原生质体的灭活处理
蛹虫草菌株FY1421原生质体的灭活条件为紫外照射。取300μL步骤2得到的蛹虫草菌原生质体悬液，均匀涂布于再生培养基上(再生培养基各组分如下：葡萄糖7.5g/L、蔗糖7.5g/L、麦芽糖5.0g/L、蛋白胨0.5g/L、酵母粉1.0g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、CaCl2 0.2g/L、VB1 0.2g/L、琼脂10.00g/L、甘露醇109.30g/L，余量为水，121℃高压灭菌20min)，距离30W紫外灯下5-10cm处开盖，避免白光干扰条件下垂直照射10-15min进行紫外灭活，即距离紫外灯10cm处照射10min、距离紫外灯5cm处照射5min、距离紫外灯8cm处照射8min。最佳灭活条件为：距离紫外灯10cm处，照射10min，其灭活率达到100％，将得到灭活蛹虫草菌原生质体利用45g/L的氯化钾水溶液悬浮，得到灭活蛹虫草菌原生质体悬液。
羊肚菌CICC 14033菌株原生质体的热灭活条件为：取1mL步骤2得到的羊肚菌原生质体悬液放入5mL离心管中，于恒温水浴中进行50-60℃热灭活处理，灭活时间分别为15-20min，即50℃下灭活处理20min、55℃下热灭活处理15min、60℃下灭活处理10min，每梯度3次重复，并设置未处理对照组。每隔2min轻轻振荡离心管1次。最佳热灭活条件为：灭活温度50℃，时间为20min，灭活率达到100％，得到灭活羊肚菌原生质体悬液。
4、原生质体融合
然后，进行灭活双亲原生质体的融合与再生：以35％(质量百分比浓度)聚乙二醇6000(PEG-6000)溶液(该溶液的溶剂为0.05mol/L氯化钙水溶液，溶质为PEG-6000)为促融剂，分别取灭活蛹虫草菌原生质体悬液和灭活羊肚菌原生质体悬液各1mL混合并离心，弃上清液，向沉淀中加入加入1mL促融剂重悬，将得到的混合原生质体悬液在30℃水浴中预热5min后，再迅速置于35℃水浴摇床中，60转/分钟，振荡融合30min。细胞融合结束之后，于2000r/min，4℃离心10min，弃上清液，再用0.6mol/L KCl渗稳剂洗涤沉淀三次，去除PEG，将得到的原生质体沉淀用0.6mol/L KCl渗透压稳定剂稀释至105个细胞/mL，而后涂布于再生培养基平板上，置于25℃恒温培养箱中，避光培养，长出的即为再生融合菌株。
5、融合菌株的筛选
将步骤4的平板上的生长快速的35株融合菌株转接种到综合PDA固体培养基斜面(18×180mm试管斜面)，培养温度为26℃，培养4天，将各融合菌株进一步活化。
培养结束后，向每个试管斜面加入5mL无菌生理盐水，洗脱即得到种子悬液，将种子悬液接种发酵摇瓶，进行摇瓶发酵筛选，250ml摇瓶装液量50ml，种子悬液接种量为1mL，发酵所用发酵培养基进行，培养条件为26℃，180rpm，培养4天，得到发酵产物，收集菌丝体，将得到的各菌株的菌丝体于60℃下烘干至水分含量为7％(质量百分比)，得到干燥后的菌丝体，称量此时菌丝体的重量即为菌丝体干重，而后检测各菌株的多糖含量、腺苷及虫草素含量。
35株融合菌株中，34株的生物量在25g/L发酵产物以下，多糖含量在15％(占菌丝体干重的百分比)以下，腺苷含量在3.0g/kg菌丝体干重以下，虫草素含量在0.5g/kg菌丝体干重以下，另外1株菌(即编号FJR1181的融合菌株)的生物量达到35g/L发酵产物，多糖含量达到27.5％(占菌丝体干重的百分比)，腺苷含量达到4.5g/kg菌丝体干重，虫草素含量达到1.5g/kg菌丝体干重。
上述摇瓶所用发酵培养基按照称量体积计为：葡萄糖8g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母粉1.0g/100mL，黄豆粉(黄豆去皮后磨制而成的粉末)2.0g/100mL，玉米粉(玉米去皮后磨制而成的粉末)5.5g/100mL，小麦粉(小麦去皮后磨制而成的粉末)0.5g/100mL，硫酸胺0.5g/100mL，磷酸二氢钾0.75g/100mL，磷酸氢二钾0.25g/100mL，硫酸镁0.3g/100mL，氨基酸营养母液0.5ml/100ml，微量元素母液10ml/100ml，维生素B1 2mg/100ml，维生素B21mg/100ml，维生素B6 1mg/100ml，余量为水，调pH为6.8，121℃高压灭菌25min。
上述的氨基酸营养母液的组分与浓度如下：甘氨酸0.6g/L、苏氨酸0.5g/L、缬氨酸0.3g/L、亮氨酸0.1g/L、异亮氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸0.2g/L、脯氨酸0.1g/L、羟脯氨酸0.06g/L、半胱氨酸0.04/L、色氨酸0.05g/L、甲硫氨酸0.1g/L、赖氨酸0.2g/L、谷氨酸0.1g/L，余量为水，4℃存储，备用。
上述的微量元素母液的组分与浓度如下：硫酸亚铁16.5mg/L，氯化钙16.5mg/L，硫酸铜0.3mg/L，硫酸锌3.5mg/L，余量为水，4℃存储，备用。
上述发酵菌丝体多糖含量的检测：按照中华人民共和国农业行业标准NYT1676-2008食用菌中粗多糖含量的测定进行。
上述发酵菌丝体虫草素和腺苷的检测：按照中华人民共和国农业行业标准NYT2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法进行。
6、融合菌株FJR1181的鉴定与保藏
步骤5中编号为FJR1181的融合菌株的鉴定：
形态鉴定：菌落形态——在PDA固体培养基平板上生产，初期菌丝层白色，细密绒毛状，中央会形成凸起，边缘清晰，菌丝贴着培养基生长，后期光照培养后，菌丝表面及平板背面均可见黄色色素的形成和累积。
显微形态显示：菌丝透明且高度分支，在菌丝体顶端可形成分生孢子梗,孢子梗顶端不膨大,无分枝,分生孢子呈球状或椭圆状,成串地着生于孢子梗上,也见一些疏散的孢子。结合《真菌鉴定手册》及菌落形态及显微形状与虫草属真菌相同，特别与蛹草拟青霉极为相似。
分子鉴定：采用真菌18S核糖体的通用引物ITS1和ITS4(生工生物工程(上海)股份有限公司)对融合菌株FJR1181的rDNA基因的ITS序列进行PCR扩增，获得扩增长度约为580bp的基因片段，将获得的基因片段测定，测定结果显示其大小为585bp，具体序列为序列表中序列1。将该序列登录NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对(Blast)，结果显示与其亲缘关系最近的菌株为Cordyceps militaris strain C-5(蛹虫草菌株C-5)，但其相似性为93％。
将编号为FJR1181的融合菌株(融合菌株FJR1181)命名为蛹虫草FJR1181(Cordyceps militaris FJR1181)，并进行斜面保存及甘油保种。蛹虫草FJR1181已于2017年12月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M2017824。
7、蛹虫草FJR1181的遗传稳定性
将蛹虫草FJR1181进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌丝体含量、多糖含量及腺苷和虫草素含量，结果显示蛹虫草FJR1181传代过程中菌丝体的各个指标含量均无明显变化，显示良好的遗传稳定性。
实施例2、蛹虫草FJR1181的发酵应用
一、蛹虫草FJR1181的种子活化培养
1、将蛹虫草FJR1181接种至综合PDA固体斜面培养基，26℃培养6天。
2、用无菌的生理盐水将步骤1培养好的综合PDA固体斜面培养基上的孢子洗脱，转接于综合PDA固体斜面培养基，于培养箱中26℃避光培养4天，继续活化传代一次。
二、蛹虫草FJR1181的摇瓶种子培养
1、用5ml无菌生理盐水将步骤一中2培养好的PDA固体斜面培养基上的分生孢子洗脱，制备菌悬液。
2、按2％接种量将制备好的菌悬液转接于含种子培养基摇瓶中，于恒温振荡培养器中200r/min下26℃培养4天，得到种子培养液1，进一步提高菌丝数，同时强化菌丝活力，达到菌株种子培养的目的。
其中种子培养基的组分及浓度为：白糖(白砂糖，所述白砂糖具体可为苏州欧扬化工科技有限公司产品)40.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、玉米淀粉20.0g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钾0.75/L、VB1 0.05g/L、VB20.02g/L、实施例1的氨基酸营养母液5ml/L，微量元素母液10ml/L，余量为水，调pH值为6.3，121℃高压灭菌25min。
三、蛹虫草FJR1181的种子放大培养
将步骤二得到的种子培养液1接种至含有种子培养基的种子罐，接种量为2％。在培养起始阶段，控制发酵罐通气量为250ml/min，搅拌控制为180rpm，温度控制在26℃，初始葡萄糖的浓度控制在50-100g/L，全过程控制溶解氧(DO)为40％，通过控制流加70％(质量百分比)的葡萄糖水溶液，维持发酵罐中的葡萄糖含量为1.0-1.5g/100mL。发酵周期控制在6天，全过程不需要光照，培养结束，种子罐中的菌丝体浓度达到20％，此即为种子放大培养液。
四、蛹虫草FJR1181液体深层发酵培养
按移种量20％，将步骤三的种子放大培养液接种于含有实施例1的发酵培养基的发酵罐中。
发酵全过程(发酵时间为6天)：前面2天为黑暗培养，第3天开始至发酵结束为光照培养(光照强度：300lux)；实时监测培养体系中的还原糖(葡萄糖)浓度，通过加入70％(质量百分比)的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.0g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到0.5-1.0g/100mL)；发酵结束前4小时，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度0.1g/100ml。培养全程参数为：发酵罐通气量为20L/min，搅拌控制为200rpm，罐压为0.8Mpa，温度控制在25℃，控制溶解氧(DO)为35％。
五、蛹虫草FJR1181发酵培养物菌丝体的收集
完成步骤四后，取整个培养体系，采用平板式离心机收集菌丝体(3000rpm离心30min)，然后于60℃烘干至水分含量为7％，烘干后样品即为蛹虫草FJR1181产品。
六、对照菌株菌丝体的制备
将蛹虫草菌株FY1421代替蛹虫草FJR1181采用试验组的条件按照步骤一、二、三、四、五进行操作，收集蛹虫草菌株FY1421菌丝体，并进行60℃烘干至水分为7％，得到对照1菌株菌丝体。
将羊肚菌CICC 14033代替蛹虫草FJR1181采用试验组的条件按照步骤一、二、三、四、五进行操作，收集羊肚菌CICC 14033菌丝体，并进行60℃烘干至水分为7％，得到对照2菌株菌丝体。
七、菌丝体生物量、多糖含量、腺苷及虫草素含量的测定
1、菌丝体生物量、多糖含量、腺苷及虫草素含量的测定
将步骤五中的蛹虫草FJR1181产品和步骤六得到的对照1菌株菌丝体和对照2菌株菌丝体的进行生物量称重，然后测定多糖、腺苷及虫草素含量。实验重复三次。
检测结果为：蛹虫草FJR1181产品的平均生物量达到3.5g干重/100ml发酵液，多糖平均含量达到275g/kg菌丝体干重，腺苷平均含量达到4.5g/kg菌丝体干重，虫草素平均含量达到1.5g/kg菌丝体干重。蛹虫草菌株FY 1421平均生物量为3.2g干重/100ml发酵液，多糖平均含量为112g/kg，腺苷平均含量为6.0g/kg菌丝体干重，虫草素平均含量达到1.3g/kg菌丝体干重。羊肚菌CICC 14033的平均生物量为2.5g干重/100ml发酵液，多糖平均含量为206g/kg菌丝体干重，腺苷含量为0，虫草素含量也为0。
结果表明：蛹虫草FJR1181集中了双亲本的优势，在液体深层发酵条件下，能够有效合成与积累一定量腺苷和虫草素的基础上，特异性的具备了优异复合多糖的合成与积累能力，具备良好的开发富含珍稀食用菌多糖的潜力。
2、组成多糖的单糖种类及比例的测定
提取各菌株的多糖，采用高效液相色谱法测定蛹虫草FJR1181、蛹虫草菌株FY1421以及羊肚菌CICC 14033多糖的各单糖组成。样品预处理的条件为：称取6mg多糖样品于安瓿瓶中，加入1.0mL蒸馏水，再加入等体积的2mol/L三氟乙酸，封管后于110℃烘箱中水解90min；冷却后打开盖子加入1.0mL甲醇，用N2吹干。测定条件为：色谱条件如下:检测器:RI(示差折光检测器)；色谱柱:AminexHPX-87HHPX-87H分析柱(300×7.8mm)；柱温:50℃；流动相:0.005mol/L的稀硫酸，流速：1mL/min。实验重复三次。多糖的检测结果的平均值如下表1：
表1、各菌株多糖的单糖组成
结果显示：蛹虫草FJR1181较蛹虫草菌株FY1421和羊肚菌菌株CICC 14033具有更为丰富的单糖组成，显示了特异性多糖的合成能力。
<110> 福建师范大学、厦门元尊生物工程有限公司
<120> 一种产多糖、腺苷和虫草素的融合菌株
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> 融合菌株FJR1181
<400> 1
ctccgtaggt gaacctgcgg agggatcatt agcaagttaa ccaactccca accctttgtg 60
aacataccta tcgttgcttc ggcggactcg cccagcgcct ggacgcgggc ctggcgcggc 120
ggccgatcgg ggccccaaac actgtatcta ccagtttttc tgaatccgcc gcaaggcatt 180
acaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggctc tggcatcgat gaagaacgca 240
gggaaatgcg ataacatatg tgaattgcag aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc 300
acattgcgcc cgccagcatt ctcccgggca tgcctgttcg aagcgtcatt tcaaccctcg 360
acgtcccctc ctggatgtcg gcgttggggt tcgcgcagca caccgccgcc cccgaaatga 420
agttggcggc ccgtccgcgg cgacctcatc gtagtactcc aactcgcacc gggaagtagg 480
cacgtggcca cgccgttgat gaacgcttaa ctctgaacgt tgacctcgga tcaggtagga 540
atagtcgctg aactgcagca tatcagcata tcaataagcg gagga 585

Claims (10)

1.融合菌株，其特征在于：所述融合菌株为将蛹虫草菌与羊肚菌进行融合得到的菌株；与所述蛹虫草菌和所述羊肚菌相比，所述融合菌株的生物量均增加。
2.根据权利要求1所述的融合菌株，其特征在于：与所述蛹虫草菌和所述羊肚菌相比，所述融合菌株的产物种类和/或产物产量均增加。
3.根据权利要求2所述的融合菌株，其特征在于：所述融合菌株产物种类的增加体现在下述A1)和/或A2)上：
A1)与所述蛹虫草菌和所述羊肚菌相比，所述融合菌株合成的多糖的组分均增加；
A2)与所述羊肚菌相比，所述融合菌株能合成腺苷和/或虫草素。
4.根据权利要求2或3所述的融合菌株，其特征在于：所述融合菌株产物产量增加体现在下述B1)和/或B2)上：
B1)与所述蛹虫草菌相比，所述融合菌株的多糖产量和/或虫草素产量增加；
B2)与所述羊肚菌相比，所述融合菌株的多糖产量增加。
5.根据权利要求1-4中任一所述的融合菌株，其特征在于：所述蛹虫草菌为中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2016220的菌株；
和/或，所述羊肚菌为羊肚菌CICC 14033。
6.根据权利要求1-5中任一所述的融合菌株，其特征在于：所述融合菌株为融合菌株FJR1181，将所述融合菌株FJR1181命名为蛹虫草FJR1181(Cordyceps militarisFJR1181)，所述蛹虫草FJR1181在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2017824。
7.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1-6中任一所述的融合菌株。
8.权利要求1-6中任一所述融合菌株的培养方法，包括：将所述融合菌株在种子培养基或发酵培养基中进行培养，完成所述融合菌株的培养；
所述种子培养基由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度分别为：白糖40.0g/L、蛋白胨10.0g/L、酵母粉5.0g/L、玉米淀粉20.0g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾1.0g/L、磷酸氢二钾0.75/L、VB1 0.05g/L、VB2 0.02g/L、氨基酸营养母液5ml/L和微量元素母液10ml/L，pH为6.3；
所述氨基酸营养母液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度分别为：甘氨酸0.6g/L、苏氨酸0.5g/L、缬氨酸0.3g/L、亮氨酸0.1g/L、异亮氨酸0.2g/L、苯丙氨酸0.5g/L、丝氨酸0.2g/L、脯氨酸0.1g/L、羟脯氨酸0.06g/L、半胱氨酸0.04/L、色氨酸0.05g/L、甲硫氨酸0.1g/L、赖氨酸0.2g/L和谷氨酸0.1g/L；
所述微量元素母液由溶剂和溶质组成；所述溶剂为水；所述溶质及其浓度分别为：硫酸亚铁16.5mg/L，氯化钙16.5mg/L，硫酸铜0.3mg/L，硫酸锌3.5mg/L；
所述发酵培养基由溶剂和溶质组成，所述溶剂为水，所述溶质及其浓度分别为：葡萄糖8g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，酵母粉1.0g/100mL，黄豆粉2.0g/100mL，玉米粉5.5g/100mL，小麦粉0.5g/100mL，硫酸胺0.5g/100mL，磷酸二氢钾0.75g/100mL，磷酸氢二钾0.25g/100mL，硫酸镁0.3g/100mL，所述氨基酸营养母液0.5ml/100ml，所述微量元素母液10ml/100ml，维生素B1 2mg/100ml，维生素B2 1mg/100ml，维生素B6 1mg/100ml，pH为6.8。
9.多糖、腺苷或虫草素的制备方法，包括：培养权利要求1-6中任一所述融合菌株，得到菌株培养液，从所述菌株培养液中提取得到多糖、腺苷或虫草素。
10.权利要求7所述菌剂或权利要求8所述方法在制备多糖、腺苷和/或虫草素中的应用。
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