CN106434377B - 一种蛹虫草菌株及其在制备产脂蛹虫草产品中的应用 - Google Patents

一种蛹虫草菌株及其在制备产脂蛹虫草产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种蛹虫草菌株及其在制备产脂蛹虫草产品中的应用。本发明提供一种蛹虫草FX1521，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2016423。本发明还保护蛹虫草FX1521在生产油脂、生产不饱和脂肪酸、生产虫草素中的应用。本发明还保护一种培养蛹虫草FX1521的方法。本发明提供的蛹虫草FX1521能高效积累虫草素，同时能够有效合成油脂，特别是积累不饱和脂肪酸。本发明提供的培养方法大大提高蛹虫草菌株孢子数及细胞活力，减少发酵级数，缩短发酵周期，节约成本，能够非常有效的促进菌丝体的生长及提高菌丝体中油脂含量。本发明具有重大的应用价值和产业前景。

Description

一种蛹虫草菌株及其在制备产脂蛹虫草产品中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种蛹虫草菌株及其在制备产脂蛹虫草产品中的应用。
背景技术
蛹虫草(Cordyceps militaris)，又名北冬虫夏草，属于真菌界，分类学上属于真菌门，子囊菌亚门，核菌纲，球壳菌目，麦角菌科，虫草属。蛹虫草分布广、生长快、易培养、含有多种活性成分，对人体具有多种生理功能。近年来，科学工作者们在蛹虫草及其无性型的生物学特征、人工栽培、液体深层发酵培养、培养基组成、培养条件优化、菌丝体及代谢产物的化学成分检测、分离、提取、纯化及其功能、优良菌株选育、功能性食品研制、保健药物开发等方面进行了大量的研究，取得了许多可喜的成果。大量研究已检测或分离到蛹虫草含有的多类活性成分，如虫草素、腺苷、虫草酸(D-甘露醇)、虫草多糖、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、麦角甾醇等，其对促进机体新陈代谢，提高机体免疫功能等具有积极意义。此外，蛹虫草还含有丰富的蛋白质、氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素及微量元素等成分。2009年原卫生部批准蛹虫草为新资源食品，认定其作为新保健食品，为冬虫夏草的良好替代品。2014年国家卫生计生委批准蛹虫草作为新食品原料，取消了对蛹虫草的食用量及使用范围等限制，更进一步体现了蛹虫草作为健康食品的安全性和可行性。
研究数据显示，蛹虫草中含有较低含量的不饱和脂肪酸如γ-亚麻酸、亚油酸等，其总油脂含量不足3％，而且油脂中的不饱和脂肪酸的种类比较单一，总的不饱和脂肪酸的含量占总油脂含量低于30％。不饱和脂肪酸作为人体必需的营养成分，对降低血液粘稠度，改善血液微循环以及维持机体细胞膜的相对流动性，保证细胞的正常生理功能方面具有显著生理功效，但人体不能自行合成，必须从膳食中补充。开展蛹虫草合成与积累油脂，尤其是积累不饱和脂肪酸的研究，是实现蛹虫草资源生物活性物质有效补充的一个全新课题，从而实现蛹虫草资源营养成分多优并举，生理活性功能多效叠加的目的，具有极高的现实意义与应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种蛹虫草菌株及其在制备产脂蛹虫草产品中的应用。
本发明提供的蛹虫草FX1521(Cordyceps militaris FX 1521)，已于2016年08月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016423。蛹虫草FX1521(Cordyceps militaris FX1521)CCTCC NO：M2016423简称为蛹虫草FX1521。
本发明还保护蛹虫草FX1521的应用，为如下(a1)和/或(a2)和/或(a3)和/或(a4)：
(a1)生产油脂；
(a2)生产不饱和脂肪酸；
(a3)生产虫草素；
(a4)制备产品；所述产品满足如下参数(b1)-(b10)中的一种或多种：
(b1)油脂含量为301g/kg以上；
(b2)不饱和脂肪酸含量为225.8g/kg以上；
(b3)油酸含量为77.8g/kg以上；
(b4)γ-亚麻酸含量为59.9g/kg以上；
(b5)亚油酸含量为52.1g/kg以上；
(b6)二十碳五烯酸含量为22.1g/kg以上；
(b7)二十二碳六烯酸含量为9.3g/kg以上；
(b8)二十四碳一烯酸含量为3.1g/kg以上；
(b9)二十碳一烯酸含量为1.5g/kg以上；
(b10)虫草素含量含量为2.1g/kg以上。
本发明还保护一种制备产品的方法，包括如下步骤：培养蛹虫草FX1521。
本发明还保护一种制备产品的方法，包括如下步骤：采用液体发酵培养基培养蛹虫草FX1521。
本发明还保护一种制备产品的方法，依次包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子强化培养基培养蛹虫草FX1521；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至液体发酵培养基进行培养。
本发明还保护以上任一所述方法制备得到的产品。
以上任一所述产品满足如下参数(b1)-(b10)中的一种或多种：
(b1)油脂含量为301g/kg以上；
(b2)不饱和脂肪酸含量为225.8g/kg以上；
(b3)油酸含量为77.8g/kg以上；
(b4)γ-亚麻酸含量为59.9g/kg以上；
(b5)亚油酸含量为52.1g/kg以上；
(b6)二十碳五烯酸含量为22.1g/kg以上；
(b7)二十二碳六烯酸含量为9.3g/kg以上；
(b8)二十四碳一烯酸含量为3.1g/kg以上；
(b9)二十碳一烯酸含量为1.5g/kg以上；
(b10)虫草素含量含量为2.1g/kg以上。
本发明还保护一种培养蛹虫草FX1521的方法，包括如下步骤：采用液体发酵培养基培养所述蛹虫草FX1521。
所述培养蛹虫草FX1521的方法具体包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子强化培养基培养蛹虫草FX1521；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至液体发酵培养基进行培养。
本发明还保护一种生产油脂和/或不饱和脂肪酸和/或虫草素的方法，包括如下步骤：培养蛹虫草FX1521。
所述培养蛹虫草FX1521是采用液体发酵培养基培养蛹虫草FX1521。
所述生产油脂和/或不饱和脂肪酸和/或虫草素的方法具体包括如下步骤(a)和步骤(b)：
步骤(a)：采用种子强化培养基培养蛹虫草FX1521；
步骤(b)：将步骤(a)的产物接种至液体发酵培养基进行培养。
本发明还保护一种用于培养蛹虫草FX1521的试剂盒。
本发明还保护一种用于生产油脂的试剂盒。
本发明还保护一种用于生产不饱和脂肪酸的试剂盒。
本发明还保护一种用于制备虫草素的试剂盒。
以上任一所述试剂盒包括液体发酵培养基。
所述试剂盒还包括种子强化培养基。
以上任一所述“采用液体发酵培养基培养蛹虫草FX1521”或所述步骤(b)中，所述“培养”的条件为：通气量15-20L/min，搅拌150-200rpm，罐压0.8Mpa，温度24-28℃，溶解氧(DO)25-45％。
所述“采用液体发酵培养基培养蛹虫草FX1521”或所述步骤(b)中，所述“培养”的方法具体可为：第0-24小时为黑暗培养，第25-96小时为光照培养(光照强度：300lux)；实时监测培养体系中的还原糖浓度，第0-92小时，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.5g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.5g/100mL)；第93小时至发酵结束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度为0.1g/100ml。培养全程参数为：通气量20L/min，搅拌200rpm，罐压0.8Mpa，温度25℃，溶解氧(DO)35％。
所述“采用液体发酵培养基培养蛹虫草FX1521”或所述步骤(b)中，所述“培养”的方法具体可为：第0-24小时为黑暗培养，第25-120小时为光照培养(光照强度：200lux)；实时监测培养体系中的还原糖浓度，第0-115小时，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.8-1.5g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.8g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.5g/100mL)；第116小时至发酵结束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度为0.01g/100ml。培养全程参数为：通气量15L/min，搅拌150rpm，罐压0.8Mpa，温度24℃，溶解氧(DO)25％。
所述“采用液体发酵培养基培养蛹虫草FX1521”或所述步骤(b)中，所述“培养”的方法具体可为：第0-24小时为黑暗培养，第25-96小时为光照培养(光照强度：500lux)；实时监测培养体系中的还原糖浓度，第0-92小时，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.8-1.5g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.8g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.5g/100mL)；第93小时至发酵结束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度为0.045g/100ml。培养全程参数为：通气量17.5L/min，搅拌175rpm，罐压0.8Mpa，温度28℃，溶解氧(DO)45％。
以上任一所述步骤(a)具体可为：将蛹虫草FX1521接种至种子强化培养基(蛹虫草FX1521在培养体系中的初始浓度为104个/ml)，26℃培养4天，得到强化种子培养物(蛹虫草FX1521在培养体系中的孢子浓度为1012个/克培养物)。
以上任一所述步骤(b)具体可为：将100g步骤(a)的产物接种至35L液体发酵培养基进行培养。
以上任一所述方法还包括如下步骤(c)：完成(b)后，取整个培养体系，离心收集菌丝体。
步骤(c)具体可为：完成(b)后取整个培养体系，采用平板式离心机收集菌丝体(3000rpm离心30min)。
以上任一所述方法还包括如下步骤：完成步骤(c)后，将产物风干。
所述风干具体可为60℃烘干至水分为7％(质量百分含量)。
以上任一所述种子强化培养基的原料配比为：1L营养液：0.5-1.5kg小米；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：马铃薯浸出粉1-3g/100ml、葡萄糖0.5-1.5g/100ml、蛋白胨0.5-0.7g/100ml、磷酸二氢钾0.05-0.15g/100ml、硫酸镁0.04-0.06g/100ml、柠檬酸钠0.05-0.15g/100ml、维生素B1 1-3mg/100ml、维生素B20.5-1.5mg/100ml、维生素B60.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、苏氨酸0.20-0.30mg/100ml、缬氨酸0.10-0.20mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、异亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.20-0.30mg/100ml、丝氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、赖氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml、硫酸亚铁16.0-17.0μg/100ml、氯化钙16.0-17.0μg/100ml、硫酸铜0.2-0.4μg/100ml、硫酸锌3.0-4.0μg/100ml；所述溶剂为水。
所述溶质及其在所述营养液中的浓度具体可为：马铃薯浸出粉2g/100ml、葡萄糖1g/100ml、蛋白胨0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.1g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、柠檬酸钠0.1g/100ml、维生素B12mg/100ml、维生素B21mg/100ml、维生素B61mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、苏氨酸0.25mg/100ml、缬氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、异亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、丝氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羟脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、赖氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml、硫酸亚铁16.5μg/100ml、氯化钙16.5μg/100ml、硫酸铜0.3μg/100ml、硫酸锌3.5μg/100ml。
所述种子强化培养基的原料配比具体可为：1L营养液：1.0kg小米。
所述种子强化培养基的制备方法具体可为：将营养液与小米混合均匀，隔水蒸(时间具体可为30min)。
以上任一所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：葡萄糖7-9g/100ml、蛋白胨1.0-2.0g/100ml、酵母粉1.0-2.0g/100ml、玉米粉5.0-6.0g/100ml、小麦粉0.4-0.6g/100ml、硫酸胺0.4-0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.4-0.6g/100ml、硫酸镁0.2-0.4g/100ml、维生素B11-3mg/100ml、维生素B20.5-1.5mg/100ml、维生素B60.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、苏氨酸0.20-0.30mg/100ml、缬氨酸0.10-0.20mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、异亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.20-0.30mg/100ml、丝氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、赖氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml、硫酸亚铁16.0-17.0μg/100ml、氯化钙16.0-17.0μg/100ml、硫酸铜0.2-0.4μg/100ml、硫酸锌3.0-4.0μg/100ml；所述溶剂为水。
所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖8g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母粉1.5g/100ml、玉米粉5.5g/100ml、小麦粉0.5g/100ml、硫酸胺0.5g/100ml、磷酸二氢钾0.5g/100ml、硫酸镁0.3g/100ml、维生素B12mg/100ml、维生素B21mg/100ml、维生素B61mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、苏氨酸0.25mg/100ml、缬氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、异亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、丝氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羟脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、赖氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml、硫酸亚铁16.5μg/100ml、氯化钙16.5μg/100ml、硫酸铜0.3μg/100ml、硫酸锌3.5μg/100ml。
所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖7g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母粉1.0g/100ml、玉米粉5.0g/100ml、小麦粉0.4g/100ml、硫酸胺0.4g/100ml、磷酸二氢钾0.4g/100ml、硫酸镁0.2g/100ml、维生素B11mg/100ml、维生素B20.5mg/100ml、维生素B60.5mg/100ml、甘氨酸0.2mg/100ml、苏氨酸0.2mg/100ml、缬氨酸0.1mg/100ml、亮氨酸0.04mg/100ml、异亮氨酸0.05mg/100ml、苯丙氨酸0.2mg/100ml、丝氨酸0.05mg/100ml、脯氨酸0.04mg/100ml、羟脯氨酸0.02mg/100ml、半胱氨酸0.01mg/100ml、色氨酸0.02mg/100ml、甲硫氨酸0.04mg/100ml、赖氨酸0.05mg/100ml、谷氨酸0.04mg/100ml、硫酸亚铁16.0μg/100ml、氯化钙16.0μg/100ml、硫酸铜0.2μg/100ml、硫酸锌3.0μg/100ml。
所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度具体可为：葡萄糖9g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母粉2.0g/100ml、玉米粉6.0g/100ml、小麦粉0.6g/100ml、硫酸胺0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.6g/100ml、硫酸镁0.4g/100ml、维生素B13mg/100ml、维生素B21.5mg/100ml、维生素B61.5mg/100ml、甘氨酸0.4mg/100ml、苏氨酸0.3mg/100ml、缬氨酸0.20mg/100ml、亮氨酸0.06mg/100ml、异亮氨酸0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.3mg/100ml、丝氨酸0.15mg/100ml、脯氨酸0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.04mg/100ml、半胱氨酸0.03mg/100ml、色氨酸0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.06mg/100ml、赖氨酸0.15mg/100ml、谷氨酸0.06mg/100ml、硫酸亚铁17.0μg/100ml、氯化钙17.0μg/100ml、硫酸铜0.4μg/100ml、硫酸锌4.0μg/100ml。
以上任一所述液体发酵培养基的pH＝6.5-7.0。
本发明提供了蛹虫草FX1521以及培养蛹虫草FX1521的方法以及通过培养蛹虫草FX1521合成油脂和制备虫草素的方法。蛹虫草FX1521能高效积累虫草素，同时能够有效合成油脂，特别是积累不饱和脂肪酸。蛹虫草菌株在液体发酵过程往往容易出现过早“老化”现象，导致蛹虫草菌株生长的同步性降低，菌丝体生物量及代谢能力减弱，最终影响蛹虫草菌株在发酵过程中合成与积累目标代谢产物(油脂、不饱和脂肪酸以及虫草素)的表现。本发明提供的培养方法大大提高蛹虫草菌株孢子数及细胞活力，减少发酵级数，缩短发酵周期，节约成本，能够非常有效的促进菌丝体的生长及提高菌丝体中油脂含量，特别是合成与积累不饱和脂肪酸。本发明具有重大的应用价值和产业前景。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
蛹虫草菌株50383：中国农业微生物菌种保藏管理中心(www.accc.org.cn，简称ACCC)，ACCC编号：50383。
蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)于2016年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2016220。
溶壁酶：广东微生物菌种保藏中心。
蜗牛酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A600870。
纤维素酶：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：A002598。
PDA固体培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1000mL，自然pH；121℃高压蒸汽灭菌20-30min。
PDA液体培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.3g，维生素B120mg，蒸馏水定容至1000ml，调pH至6.5-7.0；121℃高压蒸汽灭菌20-30min。
再生固体培养基：在PDA固体培养基中添加20％(W/V)甘露醇作为渗透压稳定剂。
再生液体培养基：在PDA液体培养基中添加20％(W/V)甘露醇作为渗透压稳定剂。
氨基酸营养母液的制备方法为：取甘氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸，丝氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、半胱氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸和谷氨酸，加蒸馏水定容至1000ml；4℃存储，备用。
微量元素母液的制备方法为：取硫酸亚铁、氯化钙、硫酸铜和硫酸锌，加蒸馏水定容至1000ml，4℃存储，备用。
种子强化培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖10g，蛋白胨6.0g，磷酸二氢钾1.0g，硫酸镁0.5g，柠檬酸钠1.0g，氨基酸营养母液5ml，微量元素母液10ml，维生素B120mg，维生素B210mg，维生素B610mg，蒸馏水定容至1000ml，制成营养液；1000ml营养液与1000g小米混合均匀，隔水蒸30min，得到种子强化培养基；121℃高压灭菌20-30min。各溶质在营养液中的浓度如下：马铃薯浸出粉2g/100ml、葡萄糖1g/100ml、蛋白胨0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.1g/100ml、硫酸镁0.05g/100ml、柠檬酸钠0.1g/100ml、维生素B12mg/100ml、维生素B21mg/100ml、维生素B61mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、苏氨酸0.25mg/100ml、缬氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、异亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、丝氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羟脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、赖氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml、硫酸亚铁16.5μg/100ml、氯化钙16.5μg/100ml、硫酸铜0.3μg/100ml、硫酸锌3.5μg/100ml。
液体发酵培养基的制备方法(pH＝6.5-7.0)：取葡萄糖，蛋白胨，酵母粉，玉米粉，小麦粉，硫酸胺，磷酸二氢钾，硫酸镁，氨基酸营养母液，微量元素母液，维生素B1，维生素B2，维生素B6，加蒸馏水定容至100ml，调pH为6.5-7.0；121℃高压灭菌25min。按照上述方法分别制备得到液体发酵培养基甲、液体发酵培养基乙及液体发酵培养基丙。
液体发酵培养基甲中，各溶质的浓度如下：葡萄糖8g/100ml、蛋白胨1.5g/100ml、酵母粉1.5g/100ml、玉米粉5.5g/100ml、小麦粉0.5g/100ml、硫酸胺0.5g/100ml、磷酸二氢钾0.5g/100ml、硫酸镁0.3g/100ml、维生素B12mg/100ml、维生素B21mg/100ml、维生素B61mg/100ml、甘氨酸0.3mg/100ml、苏氨酸0.25mg/100ml、缬氨酸0.15mg/100ml、亮氨酸0.05mg/100ml、异亮氨酸0.1mg/100ml、苯丙氨酸0.25mg/100ml、丝氨酸0.1mg/100ml、脯氨酸0.05mg/100ml、羟脯氨酸0.03mg/100ml、半胱氨酸0.02mg/100ml、色氨酸0.025mg/100ml、甲硫氨酸0.05mg/100ml、赖氨酸0.1mg/100ml、谷氨酸0.05mg/100ml、硫酸亚铁16.5μg/100ml、氯化钙16.5μg/100ml、硫酸铜0.3μg/100ml、硫酸锌3.5μg/100ml。
液体发酵培养基乙中，各溶质的浓度如下：葡萄糖7g/100ml、蛋白胨1.0g/100ml、酵母粉1.0g/100ml、玉米粉5.0g/100ml、小麦粉0.4g/100ml、硫酸胺0.4g/100ml、磷酸二氢钾0.4g/100ml、硫酸镁0.2g/100ml、维生素B11mg/100ml、维生素B20.5mg/100ml、维生素B60.5mg/100ml、甘氨酸0.2mg/100ml、苏氨酸0.2mg/100ml、缬氨酸0.1mg/100ml、亮氨酸0.04mg/100ml、异亮氨酸0.05mg/100ml、苯丙氨酸0.2mg/100ml、丝氨酸0.05mg/100ml、脯氨酸0.04mg/100ml、羟脯氨酸0.02mg/100ml、半胱氨酸0.01mg/100ml、色氨酸0.02mg/100ml、甲硫氨酸0.04mg/100ml、赖氨酸0.05mg/100ml、谷氨酸0.04mg/100ml、硫酸亚铁16.0μg/100ml、氯化钙16.0μg/100ml、硫酸铜0.2μg/100ml、硫酸锌3.0μg/100ml。
液体发酵培养基丙中，各溶质的浓度如下：葡萄糖9g/100ml、蛋白胨2.0g/100ml、酵母粉2.0g/100ml、玉米粉6.0g/100ml、小麦粉0.6g/100ml、硫酸胺0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.6g/100ml、硫酸镁0.4g/100ml、维生素B13mg/100ml、维生素B21.5mg/100ml、维生素B61.5mg/100ml、甘氨酸0.4mg/100ml、苏氨酸0.3mg/100ml、缬氨酸0.20mg/100ml、亮氨酸0.06mg/100ml、异亮氨酸0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.3mg/100ml、丝氨酸0.15mg/100ml、脯氨酸0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.04mg/100ml、半胱氨酸0.03mg/100ml、色氨酸0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.06mg/100ml、赖氨酸0.15mg/100ml、谷氨酸0.06mg/100ml、硫酸亚铁17.0μg/100ml、氯化钙17.0μg/100ml、硫酸铜0.4μg/100ml、硫酸锌4.0μg/100ml。
油脂提取及含量检测方法：参照参考文献“李植峰，张玲，沈晓京，等.四种真菌油脂提取方法的比较研究[J].微生物学通报，2001，28(6)：72-75”中的酸热法(初筛)和索氏提取法(复筛和成品检测)。
检测油脂中总不饱和脂肪酸的含量的方法：参照参考文献“赵娟，杨志岩，闫仲丽，等.油脂中总不饱和脂肪酸的紫外光谱测定[J].天津科技大学学报，2012，2(3)：815-818.”中的紫外光谱法。
检测不饱和脂肪酸种类的方法：参考文献：可成友，吴晓芳.不饱和脂肪酸的气相色谱法同时测定[J].中国卫生检验杂志，2005，5(15)：528-535.。
检测虫草素含量的方法：NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法。
实施例1、蛹虫草菌FY1421的选育
以蛹虫草菌株50383为出发菌株，经过常压室温等离子体(ARTP)诱变处理，筛选出一株蛹虫草菌株，命名为蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)。蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)于2016年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCCNO：M2016220。蛹虫草菌FY1421(Cordyceps militaris FY1421)CCTCC NO：M2016220简称为蛹虫草菌FY1421。
实施例2、蛹虫草菌FX1521的选育
一、蛹虫草菌FY1421菌丝体的收集
1、将蛹虫草菌FY1421接种至PDA固体斜面培养基，24-28℃培养5-7天。
2、用无菌的生理盐水将步骤1培养好的PDA固体斜面培养基上的孢子洗脱，并通过无菌滤纸过滤得到孢子悬液，孢子悬液中含孢子浓度为1.8×107个/mL。
3、将步骤2制备的孢子悬液按5-20％接种量转接于PDA液体培养基培养(24-28℃，100-150rpm，24-36h)，获得液体培养物。
4、将步骤3获得的液体培养物8000rpm离心10min收集菌丝体，用无菌生理盐水洗涤二次，用无菌滤纸吸干水分，得到菌丝体。
二、蛹虫草菌FY1421原生质体悬液的制备
1、取步骤一得到的菌丝体，采用由溶壁酶、蜗牛酶和纤维素酶混合得到的酶解液对菌丝体进行酶解反应，得到反应后的酶解液。酶解反应中：溶壁酶的使用浓度为0.5％-2.5％，最佳浓度为0.5％-1.0％；蜗牛酶的使用浓度0.5％-2.5％，最佳浓度为0.5％-1.0％；纤维素酶的使用浓度为0.2％-1.5％，最佳浓度为0.5-1.0％％；酶解温度范围为24-35℃，最佳酶解温度为26-30℃；酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为3-5h；调节酶解pH为5.0-7.0，最佳酶解pH为6.2-6.8。
2、采用45g/L的氯化钾水溶液重悬步骤2得到的原生质体细胞沉淀，得到原生质体悬液。
三、蛹虫草菌株原生质体的常压室温等离子体(ARTP)诱变处理
取10μL的步骤二制备的原生质体悬液，均匀涂布在金属载片的上表面，干燥后用镊子将载片转移至载物台。采用高纯氦气作为等离子体的工作气体处理菌物载片，设置电源功率80W，照射距离4mm，等离子体的温度26-30℃，气流量10L/min，处理时间为20s。样品处理完毕后，用无菌镊子将载片放至装有1mL再生液体培养基的EP管中，在振荡器上再生培养45min，把附着在载片上的微生物洗脱到再生液体培养基中，形成新的菌悬液。
四、优良高效合成油脂、积累不饱和脂肪酸的蛹虫草菌株的筛选
1、将步骤三得到的新的菌悬液稀释1000倍，取100-300μL稀释液涂布到再生固体培养基平板置于培养箱内培养。
2、将步骤1的平板上的生长快速的突变菌株接种到装有1mL PDA液体培养基的96孔微孔板振荡培养，培养温度为24-28℃，转速为150-200rpm，培养2天，离心收集菌丝体，检测菌丝体油脂含量。
统计得到2000株突变菌株，其中油脂含量提高的正突变菌株为61株，油脂含量降低的负突变菌株为1939株。与出发菌株相比，正突变菌株中的32株的油脂含量提高幅度为250％-500％，5株的油脂含量提高幅度为500％以上。
3、收集步骤2中油脂含量明显提高的正突变菌株(5株)，继续进行摇瓶复筛，250ml摇瓶，装液量50ml，培养条件为24-28℃，150-200rpm，培养2天，收集菌丝体，60℃烘干至水分为7％，检测其生物量(菌丝体干重)、油脂含量及不饱和脂肪酸含量、虫草素含量。
5株正突变菌株中，4株的生物量在30g/L以下，油脂含量在20％(占菌丝体干重的比例)以下，不饱和脂肪酸占总油脂的含量不足50％，虫草素含量为“1.0g/kg菌丝体干重”以下，另外1株菌(即编号FX 1521的菌株)的生物量达到50g/L，油脂含量达到30.1％(占菌丝体干重的比例)，其中不饱和脂肪酸占总油脂的含量达75％，而且虫草素含量达到“2.1g/kg菌丝体干重”。将编号FX 1521的菌株命名为蛹虫草FX 1521，进行斜面保存及甘油保种。
五、蛹虫草FX1521的保藏
蛹虫草FX1521(Cordyceps militaris FX1521)于2016年08月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016423。蛹虫草FX1521(Cordyceps militaris FX1521)CCTCC NO：M2016423简称为蛹虫草FX1521。
六、蛹虫草FX1521的遗传稳定性
将蛹虫草FX1521进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌丝体的油脂含量、不饱和脂肪酸含量及虫草素含量，结果显示蛹虫草FX1521传代过程中发酵油脂含量、不饱和脂肪酸含量以及虫草素含量均无明显变化，具有良好的遗传稳定性。
实施例2、蛹虫草FX1521的发酵应用
一、蛹虫草FX1521的种子强化培养
1、将蛹虫草FX1521接种至PDA固体斜面培养基，24-28℃培养5-7天。
2、用无菌的生理盐水将步骤1培养好的PDA固体斜面培养基上的分生孢子洗脱，转接于PDA固体斜面培养基，于培养箱中24-28℃避光培养3-5天。
3、用10ml无菌的生理盐水将步骤2培养好的PDA固体斜面培养基上的分生孢子洗脱，得到菌悬液。
4、将10ml步骤3得到的菌悬液接种至装有100g种子强化培养基的茄子瓶中(蛹虫草FX1521在培养体系中的初始浓度为104个/ml)，于培养箱中26℃培养4天，得到强化种子培养物(孢子浓度为1012个/克培养物)。
二、蛹虫草FX1521液体深层发酵培养
取100g步骤一制备的强化种子培养物接种于含有35L液体发酵培养基的50L发酵罐中进行培养。
试验组甲采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基甲。
试验组乙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基乙。
试验组丙采用的液体发酵培养基为液体发酵培养基丙。
试验组甲的培养过程(发酵时间为96小时)：第0-24小时为黑暗培养，第25-96小时为光照培养(光照强度：300lux)；实时监测培养体系中的还原糖浓度，第0-92小时，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.5-1.5g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.5g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.5g/100mL)；第93小时至发酵结束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度为0.1g/100ml。培养全程参数为：发酵罐通气量20L/min，搅拌200rpm，罐压0.8Mpa，温度25℃，溶解氧(DO)35％。
试验组乙的培养过程(发酵时间为120小时)：第0-24小时为黑暗培养，第25-120小时为光照培养(光照强度：200lux)；实时监测培养体系中的还原糖浓度，第0-115小时，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.8-1.5g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.8g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.5g/100mL)；第116小时至发酵结束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度为0.01g/100ml。培养全程参数为：发酵罐通气量15L/min，搅拌150rpm，罐压0.8Mpa，温度24℃，溶解氧(DO)25％。
试验组丙的培养过程(发酵时间为96小时)：第0-24小时为黑暗培养，第25-96小时为光照培养(光照强度：5001ux)；实时监测培养体系中的还原糖浓度，第0-92小时，通过加入70％的葡萄糖水溶液控制培养体系中的还原糖浓度在0.8-1.5g/100mL(每当培养体系中的还原糖浓度低于0.8g/100mL时，加入70％的葡萄糖水溶液使得培养体系中的还原糖浓度达到1.5g/100mL)；第93小时至发酵结束，不再加入70％的葡萄糖水溶液。发酵结束时，培养体系中的还原糖浓度为0.045g/100ml。培养全程参数为：发酵罐通气量17.5L/min，搅拌175rpm，罐压0.8Mpa，温度28℃，溶解氧(DO)45％。
三、蛹虫草FX1521发酵培养物菌丝体的分离
完成步骤二后，取整个培养体系，采用平板式离心机收集菌丝体(3000rpm离心30min，收集菌丝体)，60℃烘干至水分为7％，烘干后得到产脂蛹虫草产品。
试验组甲的菌丝体干重得率约为5.0％(即5g干重/100ml发酵液)。试验组甲得到的产脂蛹虫草产品命名为产脂蛹虫草产品I-甲。
试验组乙的菌丝体干重得率约为3.0％(即3g干重/100ml发酵液)。试验组乙得到的产脂蛹虫草产品命名为产脂蛹虫草产品I-乙。
试验组丙的菌丝体干重得率约为4.0％(即4g干重/100ml发酵液)。试验组乙得到的产脂蛹虫草产品命名为产脂蛹虫草产品I-丙。
试验组甲得到的菌丝体最多。
四、对照菌株菌丝体的制备
将蛹虫草菌FY1421代替蛹虫草FX1521采用试验组甲的条件按照步骤一、二、三进行操作，得到产脂蛹虫草产品II。
五、油脂及虫草素含量的测定
将步骤三制备的产脂蛹虫草产品I-甲和步骤四制备的产脂蛹虫草产品II进行油脂提取、不饱和脂肪酸含量及虫草素含量进行测定。
检测结果为：利用蛹虫草FX1521制备的产脂蛹虫草产品I-甲的油脂含量达到301g/kg菌丝体干重，总的不饱和脂肪酸含量为225.8g/kg菌丝体干重，占总油脂含量的75％，其中，油酸为77.8g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的34.5％，γ-亚麻酸为59.9g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的26.5％，亚油酸为52.1g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的23.1％，二十碳五烯酸(EPA)为22.1g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的9.8％，二十二碳六烯酸(DHA)为9.3g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的4.1％，二十四碳一烯酸为3.1g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的1.4％，二十碳一烯酸为1.5g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的0.67％，虫草素含量为2.1g/kg菌丝体干重。
利用蛹虫草菌FY1421制备的产脂蛹虫草产品II的油脂含量达到36.5g/kg菌丝体干重，总的不饱和脂肪酸含量为12.8g/kg菌丝体干重，占总油脂含量的35.1％，其中油酸含量为9.9g/kg，占总不饱和脂肪酸含量的77.3％，γ-亚麻酸为2.9g/kg菌丝体干重，占总不饱和脂肪酸含量的22.7％，虫草素含量达到42.3g/kg菌丝体干重。
结果表明：蛹虫草FX1521在种子强化培养的基础上，其发酵周期显著缩短，在合成与积累一定量虫草素的基础上，具备优异的油脂合成与不饱和脂肪酸的积累能力，而且不饱和脂肪酸的种类较对照菌株明显丰富多样。

Claims (8)

1.蛹虫草 FX1521（Cordyceps militarisFX 1521），其保藏编号为CCTCC NO:M2016423。
2.权利要求1所述蛹虫草 FX1521的应用，为如下（a1）和/或（a2）和/或（a3）和/或（a4）：
（a1）生产油脂；
（a2）生产不饱和脂肪酸；
（a3）生产虫草素；
（a4）制备产品；所述产品满足如下参数（b1）-（b10）中的一种或多种：
（b1）油脂含量为301g/kg以上；
（b2）不饱和脂肪酸含量为225.8g/kg以上；
（b3）油酸含量为77.8g/kg以上；
（b4）γ-亚麻酸含量为59.9 g/kg以上；
（b5）亚油酸含量为52.1 g/kg以上；
（b6）二十碳五烯酸含量为22.1 g/kg以上；
（b7）二十二碳六烯酸含量为9.3 g/kg以上；
（b8）二十四碳一烯酸含量为3.1g/kg以上；
（b9）二十碳一烯酸含量为1.5 g/kg以上；
（b10）虫草素含量含量为2.1g/kg以上。
3.一种制备产品的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述蛹虫草 FX1521。
4.一种制备产品的方法，包括如下步骤：采用液体发酵培养基培养权利要求1所述蛹虫草 FX1521；
所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：葡萄糖7-9g/100ml、蛋白胨1.0-2.0g/100ml、酵母粉1.0-2.0g/100ml、玉米粉5.0-6.0g/100ml、小麦粉0.4-0.6g/100ml、硫酸胺0.4-0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.4-0.6g/100ml、硫酸镁0.2-0.4g/100ml、维生素B11-3mg/100ml、维生素B2 0.5-1.5mg/100ml、维生素B60.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、苏氨酸0.20-0.30mg/100ml、缬氨酸0.10-0.20mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、异亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.20-0.30mg/100ml、丝氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、赖氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml、硫酸亚铁16.0-17.0μg/100ml、氯化钙16.0-17.0μg/100ml、硫酸铜0.2-0.4μg/100ml、硫酸锌3.0-4.0μg/100ml；所述溶剂为水。
5.一种制备产品的方法，依次包括如下步骤（a）和步骤（b）：
步骤（a）：采用种子强化培养基培养权利要求1所述蛹虫草 FX1521；
步骤（b）：将步骤（a）的产物接种至液体发酵培养基进行培养；
所述种子强化培养基的原料配比为：1L营养液：0.5-1.5kg小米；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：马铃薯浸出粉1-3g/100ml、葡萄糖0.5-1.5g/100ml、蛋白胨0.5-0.7g/100ml、磷酸二氢钾0.05-0.15g/100ml、硫酸镁0.04-0.06g/100ml、柠檬酸钠0.05-0.15g/100ml、维生素B1 1-3mg/100ml、维生素B2 0.5-1.5mg/100ml、维生素B60.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、苏氨酸0.20-0.30mg/100ml、缬氨酸0.10-0.20mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、异亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.20-0.30mg/100ml、丝氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、赖氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml、硫酸亚铁16.0-17.0μg/100ml、氯化钙16.0-17.0μg/100ml、硫酸铜0.2-0.4μg/100ml、硫酸锌3.0-4.0μg/100ml；所述溶剂为水；
所述液体发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述液体发酵培养基中的浓度如下：葡萄糖7-9g/100ml、蛋白胨1.0-2.0g/100ml、酵母粉1.0-2.0g/100ml、玉米粉5.0-6.0g/100ml、小麦粉0.4-0.6g/100ml、硫酸胺0.4-0.6g/100ml、磷酸二氢钾0.4-0.6g/100ml、硫酸镁0.2-0.4g/100ml、维生素B11-3mg/100ml、维生素B2 0.5-1.5mg/100ml、维生素B60.5-1.5mg/100ml、甘氨酸0.2-0.4mg/100ml、苏氨酸0.20-0.30mg/100ml、缬氨酸0.10-0.20mg/100ml、亮氨酸0.04-0.06mg/100ml、异亮氨酸0.05-0.15mg/100ml、苯丙氨酸0.20-0.30mg/100ml、丝氨酸0.05-0.15mg/100ml、脯氨酸0.04-0.06mg/100ml、羟脯氨酸0.02-0.04mg/100ml、半胱氨酸0.01-0.03mg/100ml、色氨酸0.02-0.03mg/100ml、甲硫氨酸0.04-0.06mg/100ml、赖氨酸0.05-0.15mg/100ml、谷氨酸0.04-0.06mg/100ml、硫酸亚铁16.0-17.0μg/100ml、氯化钙16.0-17.0μg/100ml、硫酸铜0.2-0.4μg/100ml、硫酸锌3.0-4.0μg/100ml；所述溶剂为水。
6.如权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于：所述产品满足如下参数（b1）-（b10）中的一种或多种：
（b1）油脂含量为301g/kg以上；
（b2）不饱和脂肪酸含量为225.8g/kg以上；
（b3）油酸含量为77.8g/kg以上；
（b4）γ-亚麻酸含量为59.9 g/kg以上；
（b5）亚油酸含量为52.1 g/kg以上；
（b6）二十碳五烯酸含量为22.1 g/kg以上；
（b7）二十二碳六烯酸含量为9.3 g/kg以上；
（b8）二十四碳一烯酸含量为3.1g/kg以上；
（b9）二十碳一烯酸含量为1.5 g/kg以上；
（b10）虫草素含量含量为2.1g/kg以上。
7.一种培养权利要求1所述蛹虫草 FX1521的方法，包括如下步骤：采用权利要求4中所述的液体发酵培养基培养所述蛹虫草 FX1521。
8.一种生产油脂和/或不饱和脂肪酸和/或虫草素的方法，包括如下步骤：培养权利要求1所述蛹虫草 FX1521。
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