CN108823110B - 一株产灰黄霉素的菌株及其应用 - Google Patents

一株产灰黄霉素的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产灰黄霉素的菌株及其应用。本发明提供了灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2018187。利用本发明所提供的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816生产灰黄霉素，采用不用乳糖和玉米浆的原料路线和流加补氯发酵新工艺，可大幅度提高灰黄霉素的发酵效价，降低生产成本，为开发作为抗真菌生物农药——松刚霉素提供可靠的原料来源。

Description

一株产灰黄霉素的菌株及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一株产灰黄霉素的菌株及其应用。
背景技术
灰黄霉素作为一类医农两用的抗生素，最早为国外厂商开发的第一代抗皮肤真菌病药物，在20世纪60年代上市，曾被国际药学界誉为是对付真菌病的一大里程碑重大药物。随着生物技术及生物信息学的不断进步，灰黄霉素的应用范围也不断扩大，其中最为让人瞩目方面在抗癌药和农业的应用开发方面，其为灰黄霉素的市场拓展开辟了新途径。经过几十年的长足发展，我国现已成为灰黄霉素原料药的唯一生产国，总产能已扩大至1000吨左右。
灰黄霉素农用化使其作为生物农药成为可能，利用生物藕合技术，对灰黄霉素基团进行藕合修饰，使其具备更好的抗植物真菌病原的能力和水溶性，研制出新型抗真菌生物农药——松刚霉素，为进一步开拓灰黄霉素市场提供了广阔的空间。
目前国内采用液体深层发酵模式生产的灰黄霉素，其工业化大生产的发酵水平多年来都维持在25000μg/mL左右，糖素的转化率较低，而且在发酵周期超过240h，发酵过程中存在一段明显的停滞期，发酵效率来说还是偏低，致使发酵成本处于高位，农业推广应用受到限制。如何进一步获得高产灰黄霉素的菌株及开发高效的灰黄霉素发酵工艺，对于灰黄霉素的应用及以灰黄霉素为主效成分的生物农药——松刚霉素的开发具有重大意义。
发明内容
为了有效解决上述技术问题，本发明的目的是提供一株高产灰黄霉素的菌株。
第一方面，本发明要求保护一株灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816。
本发明所提供的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2018187。
该菌株为自行从土壤中分离获得的产灰黄霉素的出发菌株F3215(CCTCC NO：M2018188)通过紫外线加氯化锂诱变获得的优良变株。该优良菌株能够高效积累灰黄霉素，而且发酵周期较现有发酵菌种明显缩短，发酵原料来源广泛，而且无氯灰黄霉素组分含量少。
第二方面，本发明要求保护一种菌剂。
本发明所提供的菌剂的活性成分为前文所述的灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)FH1816。
第三方面，本发明要求保护前文所述的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816或所述菌剂在生产灰黄霉素中的应用。
第四方面，本发明要求保护前文所述的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816或所述菌剂在制备松刚霉素中的应用。
实验证明，利用本发明所提供的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816生产灰黄霉素，采用不用乳糖和玉米浆的原料路线和流加补氯发酵新工艺，可大幅度提高灰黄霉素的发酵效价，降低生产成本，为开发作为抗真菌生物农药——松刚霉素提供可靠的原料来源。经发酵罐培养，本发明所提供的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816的生物量，菌丝体湿重达到29.5％，较原始菌株F3215的生物量提高120％；灰黄霉素效价达到30751μg/mL，较菌株F3215的灰黄霉素效价提高55倍；脱氯灰黄霉素占灰黄霉素比例为0.17％，较菌株F3215的脱氯灰黄霉素含量低33.5％。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816的发酵培养基无需复杂的碳、氮源，具备高浓度的前体——氯的耐受性，并且大幅度缩短发酵周期，提高了发酵效价，使生产成本显著下降。
(2)本发明成功实现了工业规模化发酵，不但生产原料简单，工艺控制简便，而且生产过程稳定，而且产品质量能达到中国药典、欧洲药典和美国药典要求。
保藏说明
菌种名称：灰黄青霉
拉丁名：Penicillium griseofulvum
菌株编号：FH1816
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
保藏日期：2018年4月10日
保藏中心保藏编号：CCTCC NO：M 2018187
菌种名称：灰黄青霉
拉丁名：Penicillium griseofulvum
菌株编号：F3215
保藏机构：中国典型培养物保藏中心
保藏机构简称：CCTCC
地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内武汉大学保藏中心
保藏日期：2018年4月10日
保藏中心保藏编号：CCTCC NO：M 2018188
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、灰黄霉素产生菌F3215的筛选
一、土样样品的采集及青霉菌初筛
1、土样采集
一般在有机质较多的肥沃土壤中，微生物的数量最多，中性偏碱的土壤以细菌和放线菌为主，酸性红土壤及森林土壤中霉菌较多，果园、菜园和野果生长区等富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多。
用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-15cm处的土样10-15g，装入事先准准备好的灭菌的空试管中，用棉塞封口，再用牛皮纸封存。北方土壤干燥，在10-20cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、时间及环境条件。
一般样品取回后马上分离，以免微生物死亡。但有时样品较多，而且外地取样，路途遥远，难以做到及时分离，则采先用选择性培养基做好试管斜面，随身携带。到一处将取好的土样混匀，取3-4g撒到选择性培养基试管斜面上，这样避免菌株因不能及时分离而死亡。
所以，根据我们的选择目标，从我国十五省、市、自治区采集不同类型土壤，不同类型土壤中，采集了森林土、菜地土及果园土为主的土样共计3515份。
2、菌株的选择性分离与产灰黄霉素菌株的初筛
为了容易分离到所需的青霉菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，通过配制霉菌的选择性培养基——察氏培养基，制备察氏培养基平板，通过梯度稀释的方法对不同的土样进行平板培养，培养温度设定为28℃。获得营养菌丝体色素为棕褐色的以青霉为主的真菌菌株共1536株。
其中，所述的察氏培养基配方为(％)：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖3.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100mL，pH为6.0，121℃灭菌20min，备用。
进一步的，对初步分离培养获得的1536株的青霉菌菌株再次采用察氏培养基平板进行稀释分离纯化，确保获得的菌株为纯种菌株。稀释分离初花的方法为：将初步获得的菌株分别接种察氏培养基斜面，28℃培养96h，然后在培养好的斜面分别加入5mL灭菌的生理盐水，洗脱，制备孢子悬液，取孢子悬液进行梯度稀释，并将梯度稀释的孢子悬液进行平板培养，至纯菌落出现。
根据灰黄霉素的抑菌特性，选择具有代表性的拮抗菌株：石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和絮状癣菌对分离纯化后的1536株菌株采用固体移块法进行拮抗性分析和检测，结果表明对这三种菌中的一种、两种或三种有拮抗作用的菌株共153株。
二、灰黄霉素产生菌的复筛及菌株鉴定
1、灰黄霉素产生菌的复筛及菌株确定
对上述获初筛获得的153株拮抗性菌株采用摇瓶发酵培养基进行摇瓶发酵复筛，测定发酵生物量及发酵液紫外吸收峰效价，采用纸片法和杯蝶法对发酵样品进行石膏样毛癣菌、石膏样小孢子菌和絮状癣菌的拮抗性测定，获得生物量大，而且对这三种检菌豆油明显拮抗作用且发酵液在289-292nm有明显吸收峰的菌株5株。具体结果见表1。
其中，所述的摇瓶发酵培养基包括：大米粉3.0g，乳糖1.0g，硫酸胺0.5g，氯化钾0.2g，氯化钠0.1g，磷酸二氢钾0.55g，硫酸镁0.05g，碳酸钙0.18g，自来水100mL，氢氧化钠调节pH为6.5，121℃灭菌20min。
所述的纸片法和杯蝶法的检测可参考文献：“纸片法快速测定庆大霉素发酵液生物效价[J].《药物生物技术》,2004,11(3):187-189”。
表1五株菌的摇瓶发酵液拮抗性能及紫外吸收峰
Figure BDA0001743883710000041
结果显示，编号F3215的菌株对这三种检菌的活性最高，而且生物量也是最大的。为进一步的确认F3215所产的抗菌物质为灰黄霉素，我们将其与灰黄霉素产生菌CICC 4015(Penicillium urticae CICC 4015，来自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，www.china-cicc.org，菌株保藏编号为CICC 4015)的发酵产物进行对比，并且以灰黄霉素标准品(卫生部药品生物制品检定所)为对照一起进行HPLC检测。结果确认，菌株F3215具有与灰黄霉素产生菌CICC 4015抗菌谱类似，具有产类似抗菌物质的能力(表2)，而且HPLC检测结果显示，菌株F3215与菌株CICC 4015均有与灰黄霉素标准品出峰时间一致的物质，进一步确认了菌株F3215是一株能够产灰黄霉素的野生型菌株。
表2 F3215与CICC 4015的抗菌谱比较(直径为mm)
Figure BDA0001743883710000051
所述的灰黄霉素HPLC的检测方法参照：“HPLC法测定灰黄霉素含量的研究[J].《中国药学杂志》，1990，25(6)：343-345”。
2、菌株F3215的鉴定与保藏
形态鉴定：菌落形态——在PDA固体培养基平板上28℃培养96h，菌落表面平滑疏松，菌落质地呈绒毛状，边缘全缘，菌落颜色呈龟背灰绿色。
显微形态显示：菌丝多且高度分支，分枝成帚状的分生孢子从菌丝体伸向空中，各顶端的小梗产生链状的分生孢子，分生孢子呈现近球形或宽椭圆形。结合《真菌鉴定手册》及菌落形态及显微形状与青霉属真菌相同，特别与灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)极为相似。
分子鉴定：采用真菌18S核糖体的通用引物ITS1和ITS4(生工生物工程(上海)股份有限公司)对菌株F3215的rDNA基因的ITS序列进行PCR扩增，获得扩增长度约为580bp的基因片段，将获得的基因片段测定，测定结果显示其大小为585bp，具体序列如SEQ ID No.1所示。将该序列登录NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对(Blast)，结果显示与其亲缘关系最近的菌株为Penicillium griseofulvum F-WY-12-08(灰黄青霉F-WY-12-08)。
将编号为F3215的菌株命名灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F3215，并进行斜面保存及甘油保种。灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)F3215已于2018年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018188。
实施例2、高产灰黄霉素菌株FH1816的选育
在上述获得能够产生灰黄霉素的菌株F3215的基础上，采用原生质体诱变的手段进一步提高灰黄霉素产量，同时生长速度快且遗传稳定的优良菌株。
1、菌株F3215原生质体的制备
将实施例1筛选获得的灰黄霉素菌株F3215的甘油菌接种至察氏培养基斜面，28℃培养3天后，用无菌生理盐水将斜面孢子洗脱，并使用无菌滤纸过滤所述洗脱液得到孢子悬液，并按10％接种量转接于察氏液体培养基培养(察氏培养基斜面组分包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖3.0g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100mL，pH为6.0，121℃灭菌20min，若需液体培养基，则无需添加琼脂粉)，250mL的三角瓶内装液量为30mL，内含10粒玻璃珠，于恒温振荡器28℃，250rpm，培养36h，培养结束后，获得液体培养物，10000rpm离心10min收集菌丝体，并用无菌生理盐水洗涤二次，离心、无菌滤纸吸干水分，最后收集的菌丝体。
以上述制备的菌丝体为原料，以浓度为171.0g/L的蔗糖溶液为渗透压稳定剂，采用溶壁酶(广东微生物菌种保藏中心产品)和纤维素酶(上海生工产品)混合的酶解液，破壁条件为：溶壁酶酶解液使用浓度为0.5％-1.5％，最佳酶解浓度为1.2％(％表示g/100ml)，纤维素酶的使用浓度为0.5％-1.5％的最佳浓度为0.5％(％表示g/100ml)，酶解温度范围为25-37℃，最佳酶解温度为30℃，酶解时间为2-8h，最佳酶解时间为4.5h，酶解pH为5.0-7.0，最佳酶解pH为6.2，原生质体浓度达到1×107个/mL。此即为灰黄青霉菌株F3215原生质体制备的最佳条件，制备原生质体的效率最高(显微观察显示菌丝体基本全部形成原生质体)，原生质体的再生率也较好(再生率＝再生菌落数/原生质体总数×100％)，达到40％。采用171.0g/L的蔗糖溶液重悬原生质体细胞，制备灰黄青霉菌株F3215原生质体悬液。
2、原生质体的诱变与筛选
预实验：选择诱变处理时间，方法如下：
取1mL的上述制备的原生质体悬液，于9cm的灭菌平皿中，并置于磁力搅拌器上，低速搅拌(30rpm)，距离15W的紫外灯15cm处，分别照射0(对照)、10、20、30、40、50、60s，辐射后将原生质体悬液稀释并涂布于含有1.0％(％表示g/100ml)氯化锂的再生培养基平板上(再生培养基包括：硝酸钠0.3g，磷酸氢二钾0.1g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05g，氯化钾0.05g，硫酸亚铁0.001g，蔗糖20.1g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100mL，pH为6.0，121℃灭菌20min)，28℃培养3-4天后对平板菌落进行计数，计算致死率，致死率计算方法如下所示：
致死率％＝(未经诱变处理菌落数-经诱变处理菌落数)/未经诱变菌落数×100％
通过统计各处理组的致死率，选择致死率为75-85％的照射处理时间进行正式实验，处理时间为30s。
正式实验：根据预实验的结果进行，方法如下：
取1mL的上述制备的原生质体悬液，装于9cm的无菌平皿中，并置于磁力搅拌器上，低速搅拌(30rpm)，距离15W的紫外灯15cm处，照射30s。处理完毕后，将原生质体悬液稀释并涂布于含有1.0％(％表示g/100ml)氯化锂的再生培养基平板上，28℃培养3-4天。待长出单菌落，备进行筛选。
初筛：选取上述平板上的生长快速的突变菌株1500株，接种到装有1mL察氏液体培养基的96孔微孔板振荡培养，培养温度为28℃，转速为250rpm，培养3天，离心收集菌丝体，检测菌丝体中灰黄霉素效价。
选取的1500株突变菌株中，其中灰黄霉素效价提高的正突变菌株有356株，灰黄霉素含量降低的负突变菌株为1144株。与出发菌株相比，正突变菌株中的341株的灰黄霉素效价提高幅度为150％-500％，15株的灰黄霉素效价提高幅度为500％以上。
复筛：收集初筛菌株中灰黄霉素效价明显提高的正突变菌株(15株)，继续进行摇瓶发酵复筛，250ml摇瓶，装液量30ml，培养条件为28℃，250rpm，培养3天，收集菌丝体，检测其生物量(菌丝体湿重)、灰黄霉素效价。
选取灰黄霉素效价最高，且生物量较好的菌株作为下一轮诱变的出发菌株，继续采用上述步骤和方法进行选育，共进行15代的诱变育种。
最终获得的正突变菌株中，其中1株菌(即编号FH1816的菌株)的菌落形态及及产量较原始菌株都发生明显的变异。形态方面：在察氏培养基斜面中，孢子由龟背灰绿色变为纯白色，菌落表面由松散变紧密，孢子量由多变少，单菌落也较原始菌株小。显微形态显示菌株FH1816较原始菌株F3215菌丝细，而且分支较少，18S rRNA的序列测定显示，其序列较原始菌株F3215的相似性达99％，都属于灰黄青霉菌株。产量方面：变株FH1816灰黄霉素摇瓶发酵效价最高达到18500μg/mL，较原始菌株F3215提高37倍。将编号FH1816的菌株命名为灰黄青霉菌FH1816，进行斜面保存及甘油保种。
3、优良变株的遗传稳定性检测及保藏
菌株保藏：灰黄青霉菌(Penicillium griseofulvum)FH1816于2018年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018187。
灰黄青霉FH1816的遗传稳定性：将灰黄青霉FH1816进行传代培养以考察其遗传稳定性，每3天传代一次，传代15代，每隔一代进行摇瓶发酵测定菌株的生物量及灰黄霉素效价，结果显示灰黄青霉FH1816传代过程中发酵灰黄霉素效价无明显变化，具有良好的遗传稳定性。
实施例3、灰黄霉素菌株FH1816的发酵应用
根据灰黄霉素生物合成特性及变株FH1816的生理特性，对其发酵配方及发酵工艺进行优化，获得适用于变株菌株生长和发酵产素的优化配方及控制工艺，并实现变株的高密度规模化发酵生产灰黄霉素。
一、变株FH1816灰黄霉素发酵培养基配方的优化
1、不同碳源对变株FH1816发酵的影响
为比较不同碳源对变株FH1816发酵水平的影响，进行了乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖浆、小麦粉、玉米粉及大米粉等七种碳源的单因素比较试验，并以原始菌株F3215为对比，结果如下表3。
表3不同碳源对变株FH1816灰黄霉素发酵效价的影响
Figure BDA0001743883710000081
结果显示：变株FH1816都可以在这几种氮源中生长并发酵生产灰黄霉素，但以乳糖为碳源，在七种碳源中发酵单位最低，其发酵单位的顺序是大米粉>玉米粉>小麦粉>麦芽糖浆>蔗糖>葡萄糖>乳糖。可见变株FH1816仍保持着出发菌株F3215不以乳糖为主要碳源，而主要利用大米粉为碳源的发酵特性，这点对灰黄霉素的发酵成本而言非常关键。
2、不同氮源对变株FH1816发酵的影响
为比较不同氮源对变株FH1816发酵水平的影响，进行了添加玉米浆、花生饼粉、酵母膏、蛋白胨和黄豆饼粉五种有机氮源的单因素比较试验，结果列入表4。
表4不同有机氮源对变株FH1816灰黄霉素发酵效价的影响
Figure BDA0001743883710000082
Figure BDA0001743883710000091
结果显示：变株FH1816在添加五种不同有机氮源的发酵培养基中，玉米浆、黄豆饼粉对生物合成灰黄霉素是不利的。并且整体来说，有机氮的添加对灰黄霉素的效价来说贡献不大，鉴于工业化规模发酵的需要及成本原因，变株FH1816不需添加有机氮源进行发酵，这对简化原料品种是十分有利的。
3、氯化物浓度对变株FH1816灰黄霉素发酵的影响
氯离子(Cl-)作为灰黄霉素生物合成的重要前体之一，对灰黄霉素的合成至关重要，但过高的Cl-对菌体的生长会有一定的抑制，所以非常有必要对其进行添加量的优化。
表5不同氯化物浓度对灰黄霉素发酵效价的影响
Figure BDA0001743883710000092
注：氯化物浓度以氯化钠或(和)氯化钾之和计，％表示质量百分比，即g/100mL。
结果显示：突变株FH1816经氯化锂处理后，本身具备了一定浓度Cl-的耐受性，这对灰黄霉素的合成来说非常有利。从基础氯化物浓度0.3％提高到1.8％时，其产量可提高35％，而且菌株生长也不受影响，并且当氯化物浓度为1.8％时生物量最高。最终，确认氯化物的添加量为1.8％，其中氯化钠1.0％，氯化锂0.8％。
4、变株FH1816优化的发酵配方
根据上述碳源、氮源及氯的优化工艺，结合菌株的生长及发酵需要，设计多因素多水平的均匀设计优化发酵培养基配方，考察生物量、灰黄霉素效价。
最终，得到优化的变株FH1816灰黄霉素发酵培养基配方：每100mL发酵培养基中含有大米粉15.0g，KH2PO4 0.6g，FeSO4.7H2O 0.1g，KCl 0.8g，NaCl 1.0g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 0.3g，MgSO4 0.1g，余量为水，pH6.0-6.5，121℃灭菌20min。
二、灰黄霉素菌株FH1816的关键发酵技术
1、发酵起始pH
其始pH对菌株的生长及灰黄霉素的合成都极为关键，为摸索变株FH1816的最适发酵培养基的消前pH，进行了不同发酵培养基消前pH的试验。结果显示，变株FH1816发酵培养基起始pH以6.0为宜。
2、接种量及移种量
为摸索变株FH1816的接种量和移种量对菌株生长和灰黄霉素合成的影响，在种子培养基中分别加入不同孢子浓度的大米孢子以及种子摇瓶不同移种发酵摇瓶量对变株FH1816灰黄霉素发酵效价的影响。
结果显示：种子培养基中大米孢子浓度为1.8×106个/100mL，种子培养液培养28h时，种子培养液的生物量达到12.4％，完全达到移种要求。移种发酵摇瓶，最佳的移种量为15％(体积百分含量)，即装有85mL的发酵培养基的摇瓶接入15mL种子培养液，发酵效价达到最好。
所述的种子培养基包括：每100mL种子培养基中含有大米粉5.0g，NaNO3 0.1g，NaCl 0.2g，FeSO4.7H2O 0.1g，KH2PO4 0.4g，KCl 0.1g，(NH4)2SO4 0.5g，CaCO3 0.18g，余量为水(氢氧化钠调pH6.0)，121℃灭菌25min。
所述的大米孢子的制备包括：称取市售大米10g，加入90mL营养液(配方：单位g/100mL，蔗糖5.0，KCl 0.4，KH2PO4 0.05，MgSO4 0.05，NaNO3 0.2，FeSO4 0.001，pH自然)，隔水煮沸45分钟，取出放凉后，称取20g煮熟后的大米培养基装入茄子瓶(20g大米培养基/瓶)，扎口，121℃灭菌30分钟。
3、补液化大米粉工艺
变株FH1816在发酵摇瓶初期(发酵前24h)，发酵培养基中的大米粉很快就液化，将淀粉分解成糖类，提供了较多快速利用的碳源有利于菌体的吸收利用，使通气量快速提高，从而加快菌株生长，并且使产灰黄霉素时间提早。随着菌株生物量的不断加大，通过补料工艺进行补充营养源，解决营养供需矛盾，特别是规模化发酵时期。多种补料工艺及补料配方试验，结果显示，只需补充碳源即可，而且碳源只需要补充大米粉，但大米粉需要液化处理，同时补料的方式采用发酵72h后(摇瓶发酵无需补料)，每24小时补充一次，每次至发酵体系总糖浓度3.0-5.0％(％表示g/100ml)。
所述的液化大米粉的制备包括：取市售大米100g，磨成粉，并过60目筛，然后加入400mL自来水，并按每mL液体添加50U高温α-淀粉酶(枣庄市杰诺生物酶有限公司产品)，85℃水浴加热45min，反应结束后，121℃高温灭菌20min，即可。
三、灰黄霉素菌株FH1816的发酵应用
1、大米孢子制备
首先，将菌株FH1816甘油菌接种察氏斜面培养基进行活化，28℃，培养3天。然后，将活化的斜面菌种(18×180mm斜面)加入6ml无菌生理盐水洗脱下菌株孢子，转接于含大米培养基的茄子瓶中(2mL孢子悬液/茄子瓶)，制成表面积大、通气量好且易于菌株孢子繁殖的培养基，于培养箱中28℃培养3天，进一步提高孢子的萌发数，同时强化菌丝活力。孢子浓度达到109个/克培养物
2、灰黄青霉FR1816菌株的种子罐培养
取100g上述制备的大米孢子，按照种子培养基中大米孢子浓度为1.8×106个/100mL的量接种含有35L种子培养基的50L种子罐中进行培养。初始搅拌转速控制为220rpm，初始pH为6.0，通气量12L/min，培养温度31℃±1℃，溶氧控制在30-50％(溶解于水中的分子态氧称为溶氧，通常记作DO，如30％溶氧表示为100mL溶剂中氧的量为30mg，主要通过溶氧电极检测)，并通过调整搅拌控制溶氧，罐压0.1Mpa，种子培养期间不需要一级摇瓶种子，直接大米孢子悬液入种子罐，种子罐周期48h，生物量达到15％(即100mL培养基中，离心后的固形物的含量为15g)，完全达到移种要求，此即为成熟种子培养液。
3、灰黄青霉FR1816菌株的发酵罐培养
上述成熟的种子培养液按照15％(体积百分含量)的移种量移种至300L发酵罐。并控制初始搅拌转速180rpm，通气量20L/min，罐压0.1Mpa，培养温度在0-24小时控制为31±1℃，24小时以后29±1℃，溶氧控制在25-35％，并通过搅拌控制溶氧，初始pH为6.0，发酵全程通过流加20％的氨水(体积百分比，20％表示的即100mL氨水中含有20mL的液氨)或20％的磷酸溶液(体积百分比，20％表示的即100mL磷酸溶液中含有20mL的纯磷酸)控制pH在6.0-6.5之间，发酵72h开始补充液化大米粉，每24h补充添加一次，每次至发酵体系总糖浓度3.0-5.0％(％表示g/100ml)。另外通过流加补充20％(％表示g/100ml)的氯化钠和15％(％表示g/100ml)的氯化钾灭菌混合溶液维持发酵体系的氯化物浓度含量在0.5％-1.0％(％表示g/100ml，以氯化钠和氯化钾之和计)，发酵周期为312-336h。
4、灰黄霉素含量和生物量的测定
发酵结束后，采用平板离心机或板框对发酵体系进行过滤，收集菌丝体，计算菌丝体得率及测定灰黄霉素和脱氯灰黄霉素的含量。
变株FR1816的生物量，菌丝体湿重达到29.5％，较原始菌株F3215的生物量提高120％；灰黄霉素效价达到30751μg/mL，较菌株F3215的灰黄霉素效价提高55倍；脱氯灰黄霉素占灰黄霉素比例为0.17％，较菌株F3215的脱氯灰黄霉素含量低33.5％。
其中，灰黄霉素的测定方法参考：HPLC法测定灰黄霉素含量的研究[J].《中国药学杂志》，1990，25(6)：343-345。
脱氯灰黄霉素的测定方法参考：灰黄霉素中脱氯灰黄霉素的HPLC测定[J].《中国医药工业杂志》，1999(10):459-460。
<110> 福州工微生物科技有限公司
<120> 一株产灰黄霉素的菌株及其应用
<130> GNCLN181023
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 585
<212> DNA
<213> Penicillium griseofulvum
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ctgagtgagg gccctctggg tccaacctcc 60
ccacccgtgt ttaactacct tgttgcttcg gctagcccgc cttaactggc cgccgccggg 120
cttacgcaat cgggcccgcg cccgccgaag acaccctcga actctacctg aagattgtag 180
tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttgaggcatc 240
gatgaagaac gctccgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt gaatcatcga 300
gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgccggg catgcctgtc cgagcgtcat 360
tgctgccctc aagcacggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg gggacgggcc 420
cgtatggcag cggcggcacc gcgtccgctc agcgagcgta tggggctttg tcacccgctc 480
tgtaggcccg gccggcgctt gccgggaaac ccaaattttt atccaggttg acctcggatc 540
aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gagga 585

Claims (4)

1.灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2018187。
2.一种菌剂，其特征在于：所述菌剂的活性成分为权利要求1所述的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816。
3.权利要求1所述的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816或权利要求2所述的菌剂在生产灰黄霉素中的应用。
4.权利要求1所述的灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)FH1816或权利要求2所述的菌剂在制备松刚霉素中的应用。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112094874A (zh) * 2020-09-16 2020-12-18 内蒙古格林特制药有限责任公司 一种发酵生产灰黄霉素的培养基
CN112080437A (zh) * 2020-10-15 2020-12-15 内蒙古格林特制药有限责任公司 一种灰黄霉素产生菌及氮离子注入灰黄霉素产生菌诱变高产新菌种的制备方法及应用
CN112080438B (zh) * 2020-10-15 2023-05-12 内蒙古格林特制药有限责任公司 一种灰黄霉素低产沫菌种及低产沫菌种的制备方法和应用

Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1159695A (en) * 1965-09-24 1969-07-30 Biochemie Gmbh Fermentative Production of Griseofulvin.
US3607656A (en) * 1966-11-25 1971-09-21 British Petroleum Co Production of a griseofulvin composition
US5486537A (en) * 1995-01-20 1996-01-23 Dayton Laboratories, Inc. Topical anti-fungal composition for skin and keratinous tissue
CN1542137A (zh) * 2003-11-04 2004-11-03 福建师范大学 缩短金霉素发酵周期的技术
EP2008652A1 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Griseofulvin analogues for the treatment of cancer by inhibition of centrosomal clustering
CN103255061A (zh) * 2012-02-15 2013-08-21 中国医学科学院医药生物技术研究所 灰黄青霉、由其产生的抗菌活性化合物及应用
EP2379520B1 (en) * 2008-12-22 2014-10-08 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Griseofulvin analogues for the treatment of cancer by inhibition of centrosomal clustering
CN104531543A (zh) * 2015-01-07 2015-04-22 湖南农业大学 灰毛豆内生真菌tpl25及其在防治植物病害中的应用
CN104561074A (zh) * 2014-12-30 2015-04-29 福建师范大学 一株高产l-缬氨酸工程菌的构建及其应用
CN104745520A (zh) * 2013-12-31 2015-07-01 福建省麦丹生物集团有限公司 一种高产l-苯丙氨酸的优良菌株及其应用
CN105176831A (zh) * 2015-07-14 2015-12-23 三峡大学 一种草酸青霉菌及其应用
CN105385606A (zh) * 2015-11-26 2016-03-09 华中农业大学 一种防治真菌病的灰黄青霉及其应用
WO2017072247A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CN106906146A (zh) * 2017-03-27 2017-06-30 西北农林科技大学 一种灰黄青霉及其应用
CN108165498A (zh) * 2018-01-23 2018-06-15 浙江师范大学 拮抗水稻白叶枯病菌的灰黄青霉Pg-35菌株及其发酵滤液和在植物病害防冶中的应用
CN111690579A (zh) * 2020-08-06 2020-09-22 清远一生自然生物研究院有限公司 一株耐受高浓度茶渣的植物乳杆菌lp-08及其应用

Patent Citations (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1159695A (en) * 1965-09-24 1969-07-30 Biochemie Gmbh Fermentative Production of Griseofulvin.
US3607656A (en) * 1966-11-25 1971-09-21 British Petroleum Co Production of a griseofulvin composition
US5486537A (en) * 1995-01-20 1996-01-23 Dayton Laboratories, Inc. Topical anti-fungal composition for skin and keratinous tissue
CN1542137A (zh) * 2003-11-04 2004-11-03 福建师范大学 缩短金霉素发酵周期的技术
EP2008652A1 (en) * 2007-06-28 2008-12-31 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Griseofulvin analogues for the treatment of cancer by inhibition of centrosomal clustering
EP2379520B1 (en) * 2008-12-22 2014-10-08 DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum Griseofulvin analogues for the treatment of cancer by inhibition of centrosomal clustering
CN103255061A (zh) * 2012-02-15 2013-08-21 中国医学科学院医药生物技术研究所 灰黄青霉、由其产生的抗菌活性化合物及应用
CN104745520A (zh) * 2013-12-31 2015-07-01 福建省麦丹生物集团有限公司 一种高产l-苯丙氨酸的优良菌株及其应用
CN104561074A (zh) * 2014-12-30 2015-04-29 福建师范大学 一株高产l-缬氨酸工程菌的构建及其应用
CN104531543A (zh) * 2015-01-07 2015-04-22 湖南农业大学 灰毛豆内生真菌tpl25及其在防治植物病害中的应用
CN105176831A (zh) * 2015-07-14 2015-12-23 三峡大学 一种草酸青霉菌及其应用
WO2017072247A1 (en) * 2015-10-28 2017-05-04 Syngenta Participations Ag Microbiocidal oxadiazole derivatives
CN105385606A (zh) * 2015-11-26 2016-03-09 华中农业大学 一种防治真菌病的灰黄青霉及其应用
CN106906146A (zh) * 2017-03-27 2017-06-30 西北农林科技大学 一种灰黄青霉及其应用
CN108165498A (zh) * 2018-01-23 2018-06-15 浙江师范大学 拮抗水稻白叶枯病菌的灰黄青霉Pg-35菌株及其发酵滤液和在植物病害防冶中的应用
CN111690579A (zh) * 2020-08-06 2020-09-22 清远一生自然生物研究院有限公司 一株耐受高浓度茶渣的植物乳杆菌lp-08及其应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Genome sequencing and secondary metabolism of the postharvest pathogen Penicillium griseofulvum";Houda Banani等;《BMC Genomics》;20160105;第1-14页 *
"Optimization of microbiological parameters for enhanced griseofulvin production using response surface methodology";V. Venkata Dasu等;《Bioprocess Engineering》;20000131(第22期);第45-49页 *
"Solid-State Fermentation for Production of Griseofulvin on Rice Bran Using Penicillium griseofulvum";Sayali S. Saykhedkar等;《Biotechnol. Prog.》;20041231;第1280-1284页 *
"两株灰黄霉素产生菌的18S rDNA和ITS序列测定与分析";陆娇娇等;《福建农业科技》;20191028(第10期);第10-15页 *
"灰黄霉素产生菌FS80的诱变与选育研究";张剑清;《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》;20120615;第1-75页 *
"灰黄霉素高产变株与出发菌株18S rRNA基因序列的比较分析";李晶等;《福建师范大学学报（自然科学版）》;20080531;第24卷(第3期);第77-82页 *
"灰黄霉素高产菌F208 发酵过程蛋白质表达差异的研究";李晶等;《中国微生态学杂志》;20111130;第23卷(第11期);第986-990页 *

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