CN105219653B - 产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其应用 - Google Patents
产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术微生物领域，尤其涉及1株液体发酵生产Lovastatin的棒曲霉（Aspergillus clavatus）Ac‑32菌株、用途和发酵生产方法。本发明所筛选的棒曲霉（Aspergillus clavatus）Ac‑32菌株，具有高产Lovastatin，生长速度快、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.2，培养温度为28℃条件下，Ac‑32菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5 L发酵罐发酵110 h~140 h，Lovastatin产量可达200 mg/L~250 mg/L左右。
Description
技术领域
本发明属于生物技术微生物领域，尤其涉及1株液体发酵生产Lovastatin的棒曲霉 (Aspergillus clavatus)Ac-32菌株、用途和发酵生产方法。
背景技术
近年来，我国人群的心血管病患病率、发病率及其危险因素水平不断上升，最新全国疾病监测系统的数据显示，我国心血管病占总死亡的比例从37.5％上升至40.7％。曲霉的次级代谢产物洛伐他汀(Lovastatin)，因在高血脂、动脉粥样硬化及心脑血管疾病的防治中作用机理明确、临床疗效显著，已成为治疗心血管疾病的最畅销药品之一。
1979年，日本学者远滕章(Akira Endo)等从红色红曲霉(Monascus ruber)发酵液中分离得到一种可抑制体内胆固醇合成的活性物质，命名为莫纳可林K(Monacolin K)。1980 年，Alberts等从土曲霉(Aspergillus terreus)中提取到相同的化合物，现命名为Lovastatin (洛伐他汀)。1982年，Paulus等研究了Lovastatin及其类似物在家兔体内的降胆固醇活性。1987年，美国Merck公司经FDA批准，率先推出人类历史上第一个羟甲基戊二酞辅酶A 还原酶抑制剂Lovastatin，被认为是降血脂药物研究进展的一个里程碑。自此，微生物发酵生产Lovastatin的研究取得了长足的进步。
国内从20世纪90年代初期开始对Lovastatin类物质进行研究，但Lovastatin类药物是一类重要的聚酮类化合物，因具有复杂的结构而难以通过合成的方法来进行大规模生产，而美国和日本等国家己通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和发酵工艺。因此，选育出稳定高产Lovastatin的菌种显得非常的迫切，也是Lovastatin 工业化生产的基本保障。
曲霉属(Aspergillus)真菌广泛分布于食品、土壤、空气和各种有机质中，主要以枯死的植物、动物的排泻物及动物尸体为营养源。不同种类的曲霉生活习性差异较大，大多数曲霉属于中温性，少数为高温性。多数为好氧性，对水分的要求为中生性，孢子萌发的最低相对湿度一般在85％以下，其中一些干生性曲霉在相对湿度为65％左右时萌发。曲霉属真菌能够产生葡萄糖氧化酶、果胶酶、糖化酶、淀粉酶和蛋白酶等多种具有催化作用的酶；柠檬酸、葡萄糖酸等在工业和制药上起着重要作用的有机酸；此外还会产生具有重要应用价值的生理活性物质Lovastatin。
曲霉在食品药品生产中获得了长期的实践证明，曲霉多数种都是较安全的，在市售的药品中，Lovastatin于20世纪90年代直接开发为治疗高血压的药物，其生产和应用均不存在安全隐患，能直接应用于食品药品。
发明内容
针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供1株产Lovastatin棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株和发酵生产Lovastatin的方法。
本发明所述棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株，保藏编号为：CCTCC M2015504，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年9月1日。该棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株可用于发酵生产Lovastatin。
本发明所涉及的Ac-32曲霉菌株筛选自自然发酵的面包，经初筛、复筛和培养条件优化后获得，5L发酵罐发酵110h～140h，其Lovastatin产量可达200mg/L～250mg/L左右。经形态特征、生理生化特征和18S rDNA基因序列分析，鉴定为棒曲霉(Aspergillusclavatus)。
该棒曲霉Ac-32菌株用于生产洛伐他汀的方法，该方法包括以下的步骤：
1)用接种针挑少量棒曲霉Ac-32菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2～4d；取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2～4d，制得一级种子；
2)在种子培养液中，按种子培养液质量的3～8％加入一级种子，100～300r/min摇床培养 1～3d成二级种子；
3)在发酵罐中按发酵物质量的10～20％接入二级种子进行发酵培养。
作为优选，所述的发酵培养的温度范围为25℃～35℃，pH范围为3.5～6.5。
作为优选，所述的发酵物的有机碳源选用可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、麦芽糖、番薯粉和甘油中的一种或多种混合。
作为优选，所述的发酵物的氮源选用无机氮源和有机氮源中的一种或多种混合。作为再优选，无机氮源选用硝酸钠、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的一种或多种混合；有机氮源选用牛肉膏、干酪素、酵母粉、蛋白胨和尿素中的一种或多种混合。
本发明所筛选的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株，具有高产Lovastatin，生长速度快、产孢量大、培养简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.2，培养温度为28℃条件下，Ac-32菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵110h～140h， Lovastatin产量可达200mg/L～250mg/L左右。
附图说明
图1 Ac-32曲霉菌株PDA培养基上培养5d菌落正面(左)和背面(右)。
图2 Ac-32曲霉菌株PDA培养基上培养3d分生孢子头生长的显微特征(100X)。
图3 Ac-32曲霉菌株分生孢子头显微特征(呈棒状，左200X，左400X)。
图4 Ac-32曲霉菌株分生孢子显微特征(400X)。
图5 Ac-32曲霉菌株18S rDNA基因序列(1329bp)。
图6 基于18S rDNA基因序列建立的曲霉属(Aspergillus)系统发育树。
图7 Ac-32菌株在5L发酵罐中菌丝生长曲线。
图8 Ac-32菌株在5L发酵罐中Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株的分离、筛选和鉴定
1培养基
①PDA培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂粉2.0％，水1L，pH 5.5～6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。
②PD培养基：马铃薯20％、葡萄糖2％、牛肉膏0.5％、水1L，pH 5.5～6.0。用于产Lovastatin 曲霉菌株的筛选。
2实验方法
2.1曲霉菌株的分离纯化
从不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等)表面挑取少量菌丝接入PDA 培养基平板表面，28℃培养24h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25％甘油中，置于4℃冰箱备用。
2.2产Lovastatin曲霉菌株的筛选
用高效液相色谱法(HPLC)检测曲霉菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。曲霉各保存菌株28℃PDA平板培养3d后，用打孔器取1菌饼(直径0.8mm)转接种于PD培养液中，28℃、200r/min摇床培养5d。取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理 20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，利用 HPLC法检测Lovastatin产量，筛选产Lovastatin的曲霉菌株。
2.3 Ac-32曲霉菌株的鉴定
用镊子挑取少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平板中，活化培养3d；取平皿中1菌饼(直径0.8mm)接种于新的PDA培养基平板上，28℃，培养3d，显微镜观察Ac-32菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征，并拍照。测定Ac-32菌株的生理生化特征。提取Ac-32菌株的基因组DNA，扩增18S rDNA基因序列，送上海生物工程公司测序。
3实验结果
3.1曲霉菌株的分离纯化和产Lovastatin曲霉菌株的筛选
通过分离纯化从浙江省各地不同生境收集的自然发酵样品(食品、土壤、有机质等) 中分离纯化共获186株曲霉纯菌株。
利用高效液相(HPLC)法对186株曲霉纯菌株发酵液进行检测，筛选获1株Lovastatin 产量较高的曲霉菌株，编号为Ac-32菌株，Ac-32菌株分离自自然发酵的面包。
3.2 Ac-32曲霉菌株的鉴定结果
Ac-32菌株的菌落特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，2d后中心菌丝开始变绿色，气生菌丝密而短小，培养5d后色泽变为灰蓝色，边缘呈白色，菌落直径达40mm～45 mm，质地粉粒状，有环形沟纹，分生孢子区边缘部分呈现灰蓝色(附图1)；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm～8μm的分支状；分生孢子头丰富，幼时为棒形，长度可达300 μm，直径达200μm，老后裂成几个致密的圆柱体；分生孢子梗发生于基质，梗茎长短不一，短者500μm～600μm，长者可达1000μm，直径30μm～50μm，壁较薄，光滑无色；顶囊由孢梗茎顶端逐渐膨大成为棍棒形，长度可达250μm，直径50μm～60μm；产孢结构单层，瓶梗密集着生于顶囊的全部表面，一般为8～l2μm×2～3μm，生于顶囊基部者较为短小(附图2，图3)；分生孢子呈暗蓝绿色，椭圆形，表面光滑，3～4.5μm×2.5～3μm，壁光滑(附图4)；未见菌核及有性阶段。
Ac-32菌株的生理生化特征：该菌株适宜生长温度范围为25℃～35℃，适宜pH生长范围为3.5～6.5。能够很好的利用各种有机碳源，如可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、麦芽糖、番薯粉、甘油等；在氮源利用方面，可利用硝酸钠、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵等无机氮源和牛肉膏、干酪素、酵母粉、蛋白胨、尿素等多种有机氮源。
18S rDNA基因序列分析结果表明，其长度为1329bp(附图5)，与棒曲霉(Aspergillus clavatus)(附图6)。根据Ac-32菌株的形态特征，结合曲霉属(Aspergillus)分种检索表，将Ac-32菌株鉴定为棒曲霉(Aspergillus clavatus)。
实施例2棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株在5L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产生规律
1菌株：Ac-32曲霉菌株。
2培养基
①PDA培养基：配方同实施例1。
②PD培养基：配方同实施例1。
③种子培养基：乳糖10％，甘油1％，蛋白胨0.5％，黄豆粉1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.1％，NaNO3 0.2％，水1L，pH 5.5。
④发酵培养基：乳糖20％、甘油2％、大豆蛋白胨1％，酵母膏0.5％，MgSO4·7H2O0.1％， NaNO3 0.2％，KH2PO4 0.1％，ZnSO4 0.2％，水1L，pH 5.2。
3实验方法
3.1 Ac-32菌株的培养
用接种针挑少量Ac-32菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取平皿中1 菌饼(直径0.8mm)接种于PD培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；在种子培养液中，按6％加入一级种子，200r/min摇床培养2d成二级种子；在5L发酵罐中按15％接入二级种子进行发酵培养。
3.2菌丝干重的测定
1.5mL空离心管放于在105℃的烘箱中烘干15min取出，放于干燥器内冷却后称取空离心管质量为m；每管吸取1mL培养液，在4℃，10000r/min离心10min，弃上清；加入无菌蒸馏水，吹打均匀后再离心，弃上清，放入105℃烘箱中烘至恒重，置于干燥器内冷却后称取质量为M；菌丝的干重质量为M-m。每隔5h取1mL Ac-32发酵液测定菌丝干重。以取样时间为横坐标，Ac-32菌株菌丝干重为纵坐标绘制Ac-32菌株的生长曲线。
3.3 Lovastatin产量分析
每隔5h取发酵液1mL，加甲醇4mL(按1:4的比例)，超声处理20min，50℃水浴2h，3000r/min离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以培养时间为横坐标，Ac-32菌株的Lovastatin产量为纵坐标，绘制Ac-32菌株Lovastatin 产生曲线。
4实验结果
4.1曲霉Ac-32菌株的生长曲线
按15％接种量，28℃、pH 5.2、转速180r/min～200r/min，通气量80L/h～120L/h，罐压0.1MPa～0.5MPa的条件下进行发酵。Ac-32曲霉菌株的生长曲线如图7所示：在生长初期0h～30h，Ac-32菌株生长速度较慢，为迟缓期；30h～80h为对数生长期，在发酵至 30h时，Ac-32菌体量开始快速增长，已基本覆盖液面；在发酵至80h时，Ac-32长势趋于平缓，125h～160h时出现泡沫，进入衰亡期。菌丝体呈碎片状，罐内菌体裂解衰亡。
4.2发酵液Lovastatin产量产生规律
用HPLC检测不同时间取样的发酵液中Lovastatin的产量，绘制Lovastatin产量随发酵时间的变化的曲线(图8)，发酵液中Lovastatin为量最大值为256mg/L左右。
Claims (7)
1.产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株，该菌株的保藏编号为：CCTCC M 2015504，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年9月1日。
2.权利要求1所述的棒曲霉Ac-32菌株用于生产洛伐他汀的应用。
3.权利要求1所述的棒曲霉Ac-32菌株用于生产洛伐他汀的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：
1)用接种针挑少量棒曲霉Ac-32菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2～4d；取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2～4d，制得一级种子；
2)在种子培养液中，按种子培养液质量的3～8％加入一级种子，100～300r/min摇床培养1～3d成二级种子；
3)在发酵罐中按发酵物质量的10～20％接入二级种子进行发酵培养。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于发酵培养的温度范围为25℃～35℃，pH范围为3.5～6.5。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于发酵物的有机碳源选用可溶性淀粉、果糖、蔗糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、棉子糖、麦芽糖、番薯粉和甘油中的一种或多种混合。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于发酵物的氮源选用无机氮源和有机氮源中的一种或多种混合。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于无机氮源选用硝酸钠、硫酸铵、氯化铵和硝酸铵中的一种或多种混合；有机氮源选用牛肉膏、干酪素、酵母粉、蛋白胨和尿素中的一种或多种混合。
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